Lékařská mykologie (Bi3390) Aspergilózy

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE Laichmanová Monika Lékařská mykologie (Bi3390) Aspergilózy

Aspergilózy zástupci rodu Aspergillus - popsáno 339 druhů, kolem 40 druhů popsáno jako původci mykotických infekcí u člověka oportunní patogeni ubikvitní saprofyté celosvětově rozšířeni, jsou přítomny v půdě, ve vzduchu, v rostlinných i živočišných zbytcích častý kontaminant potravin a krmiv aspergilóza je po kandidóze druhé nejčastější mykotické onemocnění u silně imunokompromitovaných pacientů Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Aspergillus nidulans

Aspergilózy Postižení respiračního systému má 3 základní formy: 1. alergickou plicní aspergilózu 2. plicní aspergilom 3. invazivní aspergilózu (IA) původci povrchových infekcích onychomykózy (mykóza nehtového aparátu) původci infekce zevního zvukovodu- otomykózy původci myktoxikóz -producenti mykotoxinů (aflatoxin) poškozujících ledviny a játra, zdrojem jsou zejména arašídy, oříšky kešu, pistácie a sušené plody

Aspergilózy Alergickou plicní aspergilóza bronchiální astma, exogenní alergická alveolitida a alergická bronchopulmonální aspergilóza(abpa) plicní onemocnění způsobené hypersenzitivitou k aspergilovým antigenům při kolonizaci dolních dýchacích cest aspergily postihuje především nemocné s astmatem a cystickou fibrózou a významně zhoršuje průběh těchto onemocnění výskyt ABPA v populaci: u astmatiků se uvádí 1-2 %, u nemocných s cystickou fibrózou cca 8-10 % při tomto onemocnění jsou dýchací cesty kolonizovány aspergilem, k invazi do organizmu nedochází klinickými příznaky jsou kašel, dušnost, teplota

Aspergilózy Alergickou plicní aspergilóza Diagnostiká kritéria alergické bronchopulmonální aspergilózy (ABPA) astma okamžitá kožní reakce na Aspergillus kultivační průkaz aspergila ve sputu přítomnost IgG a IgE proti A. fumigatus v séru výskyt plícních infiltrátů na CT hrudníka eozinofílie v krvi, ve sputu a v bronchoalveolární laváži průkaz aspergilového antigenu v séru

Aspergilózy Aspergilom u pacientů s preexistujícími dutinami v plících aspergilom je projevem saprofytické kolonizace plicních dutin vzniklých většinou po prodělané plicní tuberkulóze, z rozpadlého tumoru (Jovresova kaverna), při invazivní plicní aspergilóze houba do okolní tkáně neinvaduje, ani nedochází k diseminaci infekce rentgenologický nález ukáže typický obraz vzdušné dutiny s pohyblivým kulovitým útvarem uvnitř, který je tvořen shlukem hyf, zbytků tkání, fibrinu a zánětlivých buněk https://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/imagepages/17263.htm

Aspergilózy Aspergilom - diagnostika rentgen nebo CT hrudníku kultivace ze sputa je pozitivní jen v 50 % případech přítomnost protilátek IgG proti A. fumigatus http://www.nature.com/pr/journal/v65/n5-2/fig_tab/pr2009120f1.html

Aspergilózy Invazivní aspergilóza (IA) k infekci dochází aspirací konidií ze vzduchu plicní (80-90%) nebo sinonazální infekce vyskytující se téměř výhradně u imunosuprimovaných jedinců podle invaze do plicních struktur se rozlišují 3 typy plicní aspergilózy bronchoinvazivní aspergilóza, angioinvazivní aspergilóza a nekrotizující aspergilóza u 10 20% případů infekce diseminují do CNS, kůže či jiných lokalit klinickými příznaky plicní IA je neustupující horečka i přes léčbu ATB, kašel, bolest na hrudi, dušnost při invazivní sinonazální aspergilóze dominují příznaky: horečka, kašel, bolest hlavy, výtok z nosu, lokální bolest, bolest v krku při šíření infekce krevním řečištěm dosahuje mortalita 50 100%

Aspergilózy Invazivní aspergilóza (IA) konidie pronikají do alveolů, kde v závislosti na stavu hostitele postupně vyrůstají ve formě hyfových vláken růst mycelia má 3 fáze: 1. fáze logaritmického růstu - bohatá látková výměna spojená s tvorbou organických substrátů nutných k výstavbě myceliální stěny. Je podmíněna dostatkem živin a hlavně glukózy v okolní tkáni. V této fázi může být uvolňován galaktomanan, který pak detekujeme v materiálu z dolních dýchacích cest nebo v séru. 2. fáze stacionární - po vyčerpání zdrojů glukózy 3. fáze - lýza a destrukce hyf

Aspergilózy Invazivní aspergilóza (IA) Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus terreus vzácně pak Aspergillus clavatus, Aspergillus glaucus, Aspergillus nidulans, Aspergillus oryzae Diagnostika IFD (invazivní mykotická onemocnění) Podle mezinárodních kritérií jsou IFD děleny : prokázané pravděpodobné možné

Aspergilózy Diagnostika IFD (invazivní mykotická onemocnění) Mezinárodních kritéria: přítomnost predispozičních faktorů (neutropenie, transplantace krvetvorných buněk, dlouhodobá léčba kortikosteroidy) klinické projevy onemocnění (dušnost, radiologický nález plicních infiltrátů) průkaz mykózy pomocí mikrobiologických technik (přímá mikroskopie, kultivace klinického materiálu, detekce antigenů, histologický průkaz mykotických vláken ve tkáni) nestandardizované postupy panfungální PCR, specifická PCR v reálném čase

Aspergilózy Invazivní aspergilóza (IA) Prokázaná invazivní aspergilóza histo/cytopatologický průkaz vláken získané aspirací tenkou jehlou nebo z bioptického vzorku tkáně s průkazným vztahem (mikroskopicky nebo nesporně zobrazovací technikou) k poškozené tkáni nebo pozitivní kultivace ze vzorku získaného sterilním odběrem z normálně sterilního místa (s výjimkou vzorků moči a sliznic), které klinicky nebo radiologicky odpovídá místu infekce Pravděpodobná invazivní aspergilóza přítomnost alespoň jednoho z rizikových faktorů hostitele a jednoho mikrobiologického kritéria a jednoho velkého (nebo dvou malých) klinických kritérií s klinickými projevy místa (orgánu) odpovídajícími infekci Možná invazivní aspergilóza přítomnost alespoň jednoho z rizikových faktorů hostitele a buď jeden mikrobiologický faktor nebo jeden velký klinický faktor (nebo dva malé) odpovídající infekci

Aspergilózy Mikrobiologické faktory(ia) pozitivní kultivace nebo mikroskopický průkaz Aspergillus spp. ze sputa nebo BAL pozitivní kultivace nebo mikroskopický průkaz Aspergillus spp. z aspirátu ze sinusů pozitivní antigen galaktomanan v BAL, likvoru, krvi (v krvi minimálně ze dvou po sobě jdoucích odběrů)

Aspergilózy Klinický materiál pro mykologické vyšetření (IA) za ideální se považují vzorky odebrané přímo z podezřelého ložiska invazivními technikami (biopticky, endoskopicky, peroperačně) v případě, že nemáme tuto možnost, snažíme se odebrat materiál z postižené lokality, např. BAL při postižení plic, výplach z dutin, mok při ložiskovém postižením CNS technika odběru by měla maximálně omezit možnost kontaminace vzorku při malém množství získaného materiálu nebo hrozí-li vyschnutí, je vhodnější odebírat přímo do tekutého kultivačního media nebo sterilního fyziologického roztoku vzorky dodáme do laboratoře co nejrychleji, v případě nutnosti uchováváme při 4 C, materiál odebraný do kultivačních medií uchováváme při pokojové teplotě

Aspergilózy Diagnostika IA Mikroskopické metody: - septované hyfy s charakteristickým dichotomickým větvením hystologický průkaz (PAS, stříbření dle Grocotta, barvení HE) nativní preparát barvení podle Grama http://www.prolekare.cz/pdf?ida=vl_07_13_01.pdf#page=25&zoom=auto,-265,41

Aspergilózy aspergilóza plic

Aspergilózy aspergilóza plic, Grocottovo barvení

Aspergilózy Hyfy mikroskopických hub při fluorescenčním vyšetření pomocí Rylux BSU v KOH Detekce v bioptickém materiálu do 20 30 minut

Aspergilózy Diagnostika IA Kultivace klinického materiálu : kultivační průkaz ze sterilních tkání získaných biopsií, bronchoalveolární laváže, pleurálního výpotku, hemokultury kultivace na Sabouraudově glukózovém agaru při30 37 C, následná identifikace na diagnostických médiích nejdříve můžeme očekávat narostlé kolonie aspergilů za 24 48 hod u druhu Aspergillus fumigatus nebo Aspergillus flavus Růst A. fumigatusna SGA po 48 h při 37 C (sputum) http://zdravi.e15.cz/clanek/postgradualni-medicina-priloha/prakticke-zkusenosti-z-mykologicke-laboratore-nazorny-appendix-455848

Postup zpracování sputa v mykologické laboratoři http://zdravi.e15.cz/clanek/postgradualni-medicina-priloha/prakticke-zkusenosti-z-mykologicke-laboratore-nazorny-appendix-455848

Aspergilózy Diagnostika IA kultivační vyšetření má vysokou specifitu (92 %) v případě pozitivního nálezu, ale nízkou senzitivitu (50 % a méně) ve srovnání s dalšími metodami Interpretace nálezu významný je nález oportunních patogenů z primárně sterilních lokalit (krev, mozkomíšní mok, bioptické tkáně) při izolaci z materiálů, jako je sputum nebo i sekret z dolních dýchacích cest (DDC), musí být nález interpretován s velkou opatrností

Aspergilózy Diagnostika IA Nekultivační diagnostické metody metody sérologické využívající detekci antigenů, protilátek nebo metabolitů aspergilových kmenů metody molekulárně genetické detekující nukleové kyseliny aspergilů

Aspergilózy Detekce galaktomananu zástupci rodu Aspergillus uvolňují při svém růstu do okolí exoantigeny, které mohou být detekovány v tělesných tekutinách jedním z těchto exoantigenů je termostabilní heteropolysacharid, který je součástí buněčné stěny houby galaktomanan (GM) na zvířecích modelech byla prokázána korelace mezi mykotickou náloží ve tkáních a množstvím detekovatelného GM v séru faktory ovlivňující množství GM: fáze růstu hyf, mikroprostředí, ve kterém probíhá infekce, imunitní stav jedince, stav funkce ledvin a antimykotická léčba pravidelný a rutinní monitoring GM umožňuje zkrátit časový interval do stanovení diagnózy IA

Aspergilózy Detekce galaktomananu pro jeho detekci je možno použít latexovou aglutinaci a zejména sendvičovou ELISu metody se liší detekčním limitem i senzitivitou komerčního užití latexová aglutinace (Pastorex Aspergillus, BioRad, Francie) a sendvičová ELISA (Platelia Aspergillus, BioRad, Francie) oba komerční sety využívají při detekci vazbu antigenu s králičí monoklonální protilátkou EB-A2

Aspergilózy Detekce galaktomananu ELISA vyšší citlivost, výsledek je udáván jako index pozitivity (IP) tj. poměr mezi optickou denzitou testovaného vzorku a optickou denzitou kontrolního séra obsahujícího přibližně 1 ng GM/ml pozitivní se označuje vzorek s IP > 0,5 pozitivní pacient je nemocný s více než 2 po sobě jdoucími pozitivními odběry test je primárně určen pro detekci GM v séru, ale lze ho použít k detekci GM i v jiných tělesných tekutinách ev. v tkáních

Aspergilózy Detekce 1,3-ß-D glukanu součástí buněčné stěny většiny hub glukan se vylučuje o něco později než galaktomanan a jeho koncentrace je nižší pro laboratorní diagnostiku se využívá schopnosti glukanu reagovat s lyzátem amébocytů ostrorepa Komerční kity: Fungitell TM (USA), cutt-off 80 pg/ml, kolorimetrická Fungitec G TM (Japonsko), cutt-off 20 pg/ml, kolorimetrická Wako WB003 (Japonsko), cutt-off 11 pg/ml, turbidimetrická Cut-off je hodnota tzv.cut-off indexu pozitivity (cut-off IP), tedy hodnota indexu pozitivity, od které je vzorek označen jako pozitivní a ovlivňuje senzitivitu testu http://thomuv.blog.cz/galerie/nezarazene-vylety-akce-atd/zoo-olomouc-7-3-2010/obrazek/62594795

Aspergilózy Detekce 1,3-ß-D glukanu Výhody pozitivita v časných stadiích invaze houby široké spektrum patogenů, které lze detekovat (i nevýhoda) umožňuje monitorovat status infekce a léčebnou odpověď Nevýhody vysoká cena laboratorní náročnost falešné pozitivity (např. laboratorní kontaminace) falešné negativity (malé množství materiálu vstupujícího do reakce (5 µl), vysoká koncentrace bilirubinu) Využití v diagnostice verifikaci infekcí vzácnými mykotickými agens konfirmace falešných pozitivit GM http://procproto.cz/priroda-2/prirodni-unikat-zivocich-s-modrou-krvi/

http://www.prolekare.cz/pdf?ida=vl_07_13_01.pdf#page=25&zoom=auto,-265,41

Aspergilózy Identifikace druhů rodu Aspergillus polyfázická taxonomie: http://www.mycobank.org/ makroskopická a mikroskopická morfologie sledování produkce sekundárních metabolitů molekulární genetika

Aspergilózy Identifikace druhů rodu Aspergillus Molekulárně genetické metody panfungální PCR specifická PCR v reálném čase kvantifikace fungální nálože identifikace do rodu a druhu části genu pro rrna (18S, 5,8S a 28S) nebo sekvence mezerníků (ITS) pro sledování genetické příbuznosti druhů je u aspergilů nutná sekvenční analýza dalších lokusů http://www.prolekare.cz/pdf?ida=vl_07_13_01.pdf#page=25&zoom=auto,-265,41

Aspergilózy Identifikace druhů rodu Aspergillus Vnitrodruhová typizace aspergilů PCR-RFLP s následnou sekvenční analýzou genu pro ß-tubulin (bena) či genu rodlet A (roda) - pro rozlišení druhů fenotypicky podobných A. fumigatus multilokusová sekvenční typizace (MLST) sekvenování fragmentů referenčních genů využívána pro rutinní typizaci umožňující mezinárodní srovnávání izolátů https://www.researchgate.net/publication/227879416_molecular_typing_of_aspergillus_species

Aspergillus makroskopické znaky rychle rostoucí, plně vybarvené kolonie do pěti dnů kolonie bohatě pigmentované (v odstínech žluté, žlutozelené, zelené, zelenomodré, hnědé a černošedé) pigmentace je výrazná na Czapek-Doxově agaru (CZ) kolonie se hodnotí na standardních živných médiích: Czapkův agar s kvasničným extraktem (CYA), agar se sladovým extraktem (MEA), CZ při standardní kultivační teplotě: 25 C, 37 C Makroskopické znaky: rychlost růstu zbarvení kolonií, spodní strany kolonií povrchová struktura kolonií velikost kolonií po 7, 10, 14 dnech vzhled konidiální hlavice pod binokulární lupou http://samatoros.blogspot.cz/2008/03/plsn-aneb-co-mi-to-proboha-vyrostlo-na.html

Aspergillus makroskopické znaky https://botany.natur.cuni.cz/sites/default/files/atlas-mikroskop-saprofytnich-hub/3.03_eurotiales-aspergillus.pdf

Aspergillus mikroskopické znaky Nativní preparát: vlákna hub se špatně smáčejí a v preparátu často bývají vzduchové bubliny, je lépe použít místo vody 10 až 20% vodný roztok glycerolu, který nevysychá tak rychle. Místo glycerolu lze použít i roztok laktofenolu nebo kyselinu mléčnou. Mikrokultura: http://webserver.pa-ucl.com/wwwdocs/micro/microbiology.htm http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=s1665-27382011000200007

Aspergillus mikroskopické znaky Nepohlavní stádium konidiofor vyrůstá přímo ze substrátu nebo ze vzdušných hyf měchýřek (kolumelu) fialidy (konidiogenní buňky) v jedné nebo ve dvou řadách nad sebou (uniseriátní a biseriátní) konidiální hlavice - měchýřek s fialidami a řetězci konidií tlustostěnné buňky zvané Hülle cells

Aspergillus mikroskopické znaky

Konidiogeneze ENTEROBLASTICKÁ PHIALIDICKÁ KONIDIOGENEZE konidiogenní buňka- fialida

Konidiogeneze ENTEROBLASTICKÁ PHIALIDICKÁ KONIDIOGENEZE schizolytickýzpůsob oddělováníkonidiíod konidiogenníbuňky - při odštěpení konidie vnější stěna puká, vnitřní se vchlipuje až na malý pór, který při oddělení zacpou Woroninova tělíska tvorba límečku

Aspergillus mikroskopické znaky Pohlavní stádium tvorba drobných plodnic (menších než 1 mm) typu kleistothecium teleomorfa Eurotium, Emericella, Neosartorya http://www.uoguelph.ca/~gbarron/misc2009/eurotial.htm

Aspergillus mikroskopické znaky Kleistothecium uzavřená plodnice s vytvořenou stěnou, otvírá se rozpadem; vřecka nejsou nijak uspořádána vřecka http://ziva.avcr.cz/2012-5/houby-v-nasich-domacnostech-aneb-o-cem-doma-vite-i-nevite.html

Aspergillus fumigatus Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Eurotiomycetes, Eurotiomycetidae, Eurotiales, Trichocomaceae, Aspergillus kontaminant potravin, oportunní patogen člověka a jiných živočichů častý ve vlhkém, teplém prostředí (kompost, ale i zvlhčovací systémy, obytné prostory) zodpovědný za 90% všech případů IA termotolerantní - roste i při 55 C adaptace na nedostatek kyslíku je podmínkou pro jeho přežití v zánětlivé tkáni a umožňuje šíření do jiných orgánů produkuje mykotoxiny gliotoxin, verruculogen, fumitremorginy aj. dvě podskupiny ve vzduchu a ve vodě druhy fenotypicky podobné: A. lentulus, A. viridinutans, Neosartorya fischeri, N. pseudofischeri, N. undagawae diagnostcký znak: A. fumigatus roste při teplotě 50 C a neroste při 10 C, kdy ostatní zaměnitelné druhy rostou (výjimkou je A. viridinutans)

Aspergillus fumigatus kolonie rychle rostoucí při 25 i 37 C, zelené, sametové Foto.: A. Kubátová https://botany.natur.cuni.cz/sites/default/files/atlas-mikroskop-saprofytnich-hub/3.03_eurotiales-aspergillus.pdf

Aspergillus fumigatus konidiofory uniseriátní s široce kyjovitým měchýřkem konidiální hlavice typicky sloupcovité konidie kulovité nebo téměř kulovité, zelené, bradavčité, 2,5-3 µm v průměru https://botany.natur.cuni.cz/sites/default/files/atlas-mikroskop-saprofytnich-hub/3.03_eurotiales-aspergillus.pdf Foto.: A. Kubátová http://www.mycobank.org/biolomics.aspx?link=t&targetkey=14682616000002126&rec=3660

Aspergillus flavus kolonie rychle rostoucí, žlutozelené, roste i při teplotě až 48 C výskyt v půdě, na potravinách (arašídy, koření, obiloviny apod.) produkuje mykotoxin aflatoxin B1, 3-nitropropionovou kyselinu, kojovou, aspergilovou a cyklopiazonovou kyselinu z 10% původce bronchopulmonárních infekcí Foto.: A. Kubátová https://botany.natur.cuni.cz/sites/default/files/atlas-mikroskop-saprofytnich-hub/3.04_eurotiales-asp_sekce_flavi.pdf

Aspergillus flavus konidiofory biseriátní i uniseriátní, bradavičnaté s kulovitým nebo téměř kulovitým měchýřkem konidiální hlavice paprsčité konidie kulovité nebo téměř kulovité, bradavčité Foto.: J. Machač http://www.mycobank.org/biolomics.aspx?table=mycobank&rec=58206&fields=all Foto.: A. Kubátová http://ziva.avcr.cz/2012-5/houby-v-nasich-domacnostech-aneb-o-cem-doma-vite-i-nevite.html

Aspergillus niger kontaminant potravin rostlinného tak i živočišného původu produkuje naphtho-4-pyrony, malforminy a u několika kmenů byla zaznamenána produkce ochratoxinu A z 5% původcem IA, otomykózy optimální klíčivost konidií v acidofilním prostředí teplotní optimu je 30 C specifickým diagnostický znakem infekcí způsobených A. niger je přítomnost kalcium oxalátum ve formě krystalů v patologickém vzorku

Aspergillus niger kolonie rychle rostoucí, černé, zrnité, často produkuje žlutý pigment do agaru Foto.: A. Kubátová https://botany.natur.cuni.cz/sites/default/files/atlas-mikroskop-saprofytnich-hub/3.03_eurotiales-aspergillus.pdf

Aspergillus niger konidiofory biseriátní, hladké s kulovitým měchýřkem konidiální hlavice paprsčité konidie kulovité nebo téměř kulovité, černé, nepravidelně bradavčité, 3,5-5 µm v průměru Foto.: A. Kubátová http://www.mycobank.org/biolomics.aspx?table=mycobank&rec=2506&fields=all https://botany.natur.cuni.cz/sites/default/files/atlas-mikroskop-saprofytnich-hub/3.03_eurotiales-aspergillus.pdf

Aspergillus terreus kolonie rychle rostoucí, okrové, sametové, roste i při 37 C výskyt na potravinách a v prostředí budov, bývá izolován i z půdy původce IA se sklonem k diseminaci, sekundární kožní infekce Foto.: A. Kubátová https://botany.natur.cuni.cz/sites/default/files/atlas-mikroskop-saprofytnich-hub/3.03_eurotiales-aspergillus.pdf

Aspergillus terreus konidiofory biseriátní, hladké s téměř kulovitým měchýřkem konidiální hlavice sloupcovité konidie kulovité až elipsoidní, hladké, malé, 1,5-2,5 µm v průměru na substrátovém myceliu se tvoří kulovité buňky Foto.: J. Machač https://botany.natur.cuni.cz/sites/default/files/atlas-mikroskop-saprofytnich-hub/3.03_eurotiales-aspergillus.pdf

Aspergillus nidulans kolonie rychle rostoucí při 25 i 37 C, sametové, zelené tvorba plodnic syn. teleomorfa Emericella nidulans kontaminant potravin produkuje mykotoxin sterigmatocystin aj. vyskytuje se vzácně, virulentnější než A. fumigatus, vyšší rezistence k některým antimykotikům Foto.: A. Kubátová https://botany.natur.cuni.cz/sites/default/files/atlas-mikroskop-saprofytnich-hub/3.01_eurotiales-teleomorfy.pdf

Aspergillus nidulans plodnice kulovité, 100-300 µm v průměru, obalené vrstvou světle žlutých až béžových hülle cells vřecka kulovitá, s 8 askosporami, askospory zploštělé, hladké, se 2 obvodovými hřebínky červené, čočkovitě Foto.: A. Kubátová https://botany.natur.cuni.cz/sites/default/files/atlas-mikroskop-saprofytnich-hub/3.01_eurotiales-teleomorfy.pdf

Aspergillus nidulans konidiofory biseriátní, hladké, nahnědlé s kulovitým měchýřkem konidie v řetízcích, kulovité, bradavčité Foto.: A. Kubátová https://botany.natur.cuni.cz/sites/default/files/atlas-mikroskop-saprofytnich-hub/3.01_eurotiales-teleomorfy.pdf

Příště: Mukormykózy Entomoftoromykózy