Vyšetření urogenitálního traktu se zaměřením na mikroskopický obraz poševní. Absolventská práce. Magdalena Starůstková

Vyšetření urogenitálního traktu se zaměřením na mikroskopický obraz poševní Absolventská práce Magdalena Starůstková Vyšší odborná škola zdravotnická a Střední zdravotnická škola Praha 1, Alšovo nábřeţí 6 Studijní obor: Diplomovaný zdravotní laborant Vedoucí práce: MUDr. Matějková Jana Datum odevzdání práce: 20. 4. 2015 Datum obhajoby: 17.-19. 6. 2015 Praha 2015

Prohlašuji, ţe jsem absolventskou práci vypracoval (a) samostatně a všechny pouţité prameny jsem uvedl (a) podle platného autorského zákona v seznamu pouţité literatury a zdrojů informací. Praha, 15.4.2015 Podpis

Děkuji MUDr.Janě Matějkové za odborné vedení absolventské práce.

Souhlasím s tím, aby moje absolventská práce byla půjčována v knihovně Vyšší odborné školy zdravotnické a Střední zdravotnické školy, Praha 1, Alšovo nábřeţí 6. Podpis

ABSTRAKT Magdalena Starůstková Vyšetření urogenitálního traktu se zaměřením na mikrobiální obraz poševní Vyšší odborná škola zdravotnická a Střední zdravotnická škola, Praha 1, Alšovo nábřeţí 6 Vedoucí práce: MUDr. Jana Matějková Absolventská práce, Praha, VOŠZ a SZŠ,2015, 42 stran Diagnostika infekcí ţenského pohlavního systému prodělala v posledních letech podstatné změny. V literatuře jsou dostupné nové trendy a moţnosti uplatňující se v optimálním stanovení původce onemocnění. Proto jsem si jako cíl své práce stanovila podat přehledné informace týkající se této problematiky a ověřit si v praxi jejich uplatnění. V úvodu je stručný popis ţenského pohlavního ústrojí a základní přehled onemocnění. Dále jsou obecně popsáni původci a mechanismy patogeneze infekcí, současné moţnosti laboratorní diagnostiky a terapie. Vlastní sledování se zaměřuje na výskyt infekcí ţenského pohlavního systému ve FN Motol v období od 1.1.2015 do 31.1.2015. Během jednoho měsíce bylo vyšetřeno celkem 587 vzorků s cílem prokázat mikroskopicky, kultivačně nebo pomocí průkazu nukleové kyseliny původce, event. normální mikroflóru. U patogenů byla stanovena citlivost in vitro k antibiotikům a chemoterapeutikům. Ve FN Motol nebyla během sledovaného období diagnostikována Trichomonas vaginalis.

ABSTRACT Magdalena Starůstková Vyšetření urogenitálního traktu se zaměřením na mikrobiální obraz poševní Urogenital tract examination focused on the microbiological picture of the vagina Vyšší odborná škola zdravotnická a Střední zdravotnická škola, Praha 1, Alšovo nábřeţí 6 Vedoucí práce: MUDr. Jana Matějková Absolventská práce, Praha, VOŠZ a SZŠ,2015, 42 stran The diagnosis of the female urogenital system infections has undergone substantial changes in recent years. There are new trends and possibilities available in literature which can be used for optimal determination of the disease causing agents. Therefore, as a main aim for my thesis I have chosen to provide clear information about this area and to verify its use in professional experience. The introduction contains a basic description of female urogenital system and a concise overview of the diseases. There is also a general description of the disease causing agents of the infections, the development of infections, present laboratory diagnostic possibilities and treatment. The actual monitoring was focused on the occurrence of female urogenital system infections in FN Motol in the period of 1. 1. 2015 to 31. 1. 2015. There were 587 samples examined during the month in order to demonstrate microscopically, by culture or with using nucleic acid the cause of the disease or to prove normal microflora. Pathogens were determined with in vitro antibiotics and chemotherapeutics sensitivity. Trichomonas vaginalis wasn t diagnosed in FN Motol during the monitored period.

Obsah 1. Úvod... 8 2. Teoretická část... 8 2.1. Anatomie ţenského pohlavního ústrojí... 8 2.1.1. Zevní pohlavní orgány... 8 2.1.2. Vnitřní pohlavní orgány... 9 2.2. Vaginální mikroflóra... 10 2.3. Infekce a její původci... 12 2.3.1. Endogenní infekce... 12 2.3.1.1. Aerobní (bakteriální) vaginitis... 12 2.3.1.2. Bakteriální vaginóza... 13 2.3.2. Exogenní infekce... 15 3. Praktická část... 23 3.1. Diagnostika... 23 3.1.1. Mikroskopie... 23 3.1.2. Kultivace... 28 3.1.2.1. Princip... 28 3.1.2.2. Odběr, transport a příjem materiálu... 28 3.1.2.3. Kultivační půdy... 29 3.1.2.4. Kultivace... 30 3.1.2.5. Průkaz urogenitálních mykoplazmat... 30 3.1.2.6. Průkaz Chlamydia trachomatis... 31 3.1.3. Hodnocení... 31 3.2. Praktické provedení... 31 3.2.1. Materiál a metodika... 31 3.2.2. Vyhodnocení praktické části... 32 4. Diskuse... 36 5. Závěr... 37 Seznam obrázků... 38 Seznam tabulek... 39 Seznam zkratek... 40 Pouţitá literatura... 41

1. Úvod Infekce ţenského pohlavního systému jsou poměrně časté a mohou mít nejrůznější etiologii. Na jejich rozvoji se podílejí i faktory neinfekční povahy. Situace je navíc komplikována hormonálními změnami během menstruačního a ovulačního cyklu nebo během těhotenství a šestinedělí. Pohlavní ústrojí má své dobře účinné nespecifické obranné mechanismy, velkou roli hraje hladina hormonů a přítomnost přirozené mikroflóry. Infekční vaginitida patří mezi nejčastější onemocnění ţenského genitálu. V České republice dominují bakteriální a mykotičtí původci. Statistiky udávají, ţe během ţivota se s vaginálním zánětem setká téměř kaţdá ţena. Proto jsem si vybrala téma zabývající se moţnostmi diagnostiky infekcí genitálních infekcí u ţen jako téma svojí absolventské práce (1),(2),(3),(4). 2. Teoretická část 2.1. Anatomie ţenského pohlavního ústrojí Ţenské pohlavní ústrojí se rozděleno na orgány vnitřní a zevní. Vnitřní část ţenského genitálu je uloţena v pánvi a je tvořena pochvou, dělohou a párovými vaječníky a vejcovody. Zevní ţenské pohlavní orgány naléhají na stydkou kost a tvoří je malé a velké stydké pysky, poštěváček a předsíň poševní. 2.1.1. Zevní pohlavní orgány Malý stydký pysk (labium minus pudendi) Je to tenká koţní párová řasa s délkou 3-4 centimetry. Má růţovou barvu, je značně prokrvená, proto se jeví jako sliznice. Nacházejí se zde potní a mazové ţlázky, více na vnitřní ploše labia. Velký stydký pysk (labium majus pudendi) Je to párová koţní řasa, která je 8 centimetrů dlouhá a 3 centimetry široká, je kryta kůţí a v mládí je silnější a pevnější. Zevní strana je pigmentovaná a od puberty kryta silnými chlupy. Na vnitřní straně se ochlupení nenachází. Povrch vnitřní strany je podobný malému stydkému pysku. Obsahuj potní a mazové ţlázky. Velké stydké pysky zakrývají z části nebo úplně malé stydké pysky. 8

Topořivá tělesa Ţenská topořivá tělesa tvoří clitoris a bulbus vestibuli. Při pohlavním podráţdění dochází k městnání krve a zduření celé přilehlé oblasti. Postěváček (clitoris) Je obdobou dorzální části penisu. Délka poštěváčku je okolo osmi centimetrů. Jeho ramena jsou připojena k ramenům kostí stydkých, na dolním okraji spony stydké se spojují v tělo, které je zakončeno glans clitoridis. Povrch pokrývá předkoţka. Obsahuje corpora cavernosa, erekční mechanismus je obdobný jako u penisu. Bulbus vestibuli Párový orgán erektilního charakteru, leţí kolem stěny poševního vchodu. 2.1.2. Vnitřní pohlavní orgány Pochva (vagina) Pochva je vazivové svalový orgán válcovitého tvaru. Kraniálně je ohraničena děloţním hrdlem a kaudálně ústí ve vchod poševní. Vagina je předozadně zploštělá, na stěnách jsou řasy, které se sniţují po porodu a ve stáří. Délka je průměrně 8-9 centimetrů, šířka cca 3 centimetry. Nejuţší je u vchodu, nejširší u čípku děloţního. Zadní stěna je delší, v zadní klenbě poševní se hromadí sperma. Na hranici poševního vchodu je v dětství tenká slizniční řasa panenská blána (hymen). Stěna poševní je poměrně silná, pruţná, bohatě prokrvená, neobsahuje ţádné ţlázky. Sliznice je růţová, v těhotenství díky dilataci cév fialová, během menstruace nebo při pohlavním dráţdění tmavě červená. Mnohovrstevný dlaţdicový epitel díky estrogenům produkuje glykogen, který se spolu s odloupanými epiteliemi hromadí ve vagině a následně je přítomnými mikroorganismy (laktobacily) štěpen za vzniku kyseliny mléčné. Ta zajišťuje kyselé ph (4), které je důleţité pro udrţování optimálního prostředí pro ostatní mikrobiální flóru. Děloha (uterus) Děloha je dutý, nepárový orgán tvořený silnou svalovinou, slouţí k vývoji plodu. Je hruškovitého tvaru, kaudálně se zuţuje a její hrdlo ústí do vaginy. Má trojúhelníkovitý tvar, je předozadně zploštělá. Stěnu tvoří sliznice (endometrium), svalovina (myometrium) a serózní vrstva (perimetrium). Endometrium je u ţen v reprodukčním věku pod vlivem řídících hormonů, vzniklé změny označujeme jako menstruační 9

cyklus. Ten se u zdravých ţen zastavuje během těhotenství a během laktace, končí kolem 5O.roku věku. Vejcovod (tuba uterina) Vejcovod je párová trubice, začíná v děloţní dutině (v jejím rohu) a ústí nálevkovitým rozšířením do dutiny břišní, kde úzce naléhá na vaječník. Je dlouhý aţ 15 cm a široký cca 5 mm. Na děloţním konci je nejuţší. Základní funkcí vejcovodu je transport vajíčka po ovulaci z vaječníku do dělohy. Vaječník (ovarium) Vaječník je ţenská pohlavní ţláza, která produkuje vajíčka a ţenské pohlavní hormony. Má oválný tvar, ze stran je zploštělý. Velikost a tvar jsou závislé na věku a funkčím stavu. Je 3-5 cm dlouhý a 1,5-3 cm široký. Ovarium je uchyceno ve výchlipce pobřišnice (mesovarium) (5). 2.2. Vaginální mikroflóra Vaginální mikroflóra je za normálních okolností tvořena především laktobacily. Podle nejnovějších poznatků se na kolonizaci vaginální sliznice podílí L.gasseri, L.jenseni a L.crispatus. Jejich úlohou je ochrana sliznice před patogeny. Produkují peroxid vodíku, který je pro řadu bakterií, hlavně anaerobních, toxický. Další součástí poševní flóry jsou některé anaeroby (bakteriody, fusobakteria, veilonelly, eubakteria), koagulázanegativní stafylokoky, Staphylococcus aureus, alfa a betahemolytické streptokoky, nehemolytické streptokoky a enterokoky, v menší míře i Gardnerella vaginalis, Mycoplasma hominis a Ureaplasma urealyticum, E.coli a C.albicans. Důleţitou roli na optimálním udrţení vaginálního ekosystému hrají epitelie poševní sliznice a hladina hormonů, zvláště estrogenů. Estrogeny podporují trovbu a hromadění glykogenu v epiteliích vaginální sliznice a podporují výţivu sliznice. Glykogen se uplatňuje v přeţívání a mnoţení laktobacilů. Kyselina mléčná, která vzniká při mléčném kvašení glykogenu, okyseluje poševní prostředí a tím zpětně poskytuje příznivé ph pro další růst laktobacilů. Pokud dojde k porušení rovnováhy mezi přirozenými bakteriálním druhy, vzniká infekce a zánět. Dysmikrobii mohou vyvolat exogenní i endogenní mikroorganismy (1),(2).(3)(4)(6). 10

Obrázek 1 - Lactobacillus sp. - krevní agar 11

2.3. Infekce a její původci Gardnerella vaginalis Morfologicky je to gramnegativní, někdy gramlabilní drobrá tyčinka aţ kokobacil. Roste za aerobních nebo mikroaerofilních podmínek na speciálních selektivních kultivačních půdách obsahujících lidské erytrocyty. Kultivaci většinou prodluţujeme na 2-3 dny. Můţe se vyskytovat i u zdravých ţen jako součást normální vaginální flóry, častěji je však dávána do souvislosti s bakteriální vaginózou. Většinou v důsledku hormonální dysbalance dojde k jejímu přemnoţení na úkor normální flóry, zejména laktobacilů. Klesá produkce peroxidáz a následně se přemnoţí anaeroby. Jejich metabolická aktivita má za následek produkci vazkého zapáchajícího sekretu. Základem terapie je primárně odstranění vyvolávajícího agens, např. úprava hormonálních hladin. Terapie je kombinovaná, tvoří ji aplikace antimikrobních preparátů (metronidazol) a uţívání pro- i prebiotik. Pro- a prebiotika mohou zvýšit počet laktobacilů a tím přirozeně omezit přítomnost gardnerel (1),(2),(3). Mobiluncus Mobiluncus je gramnegativní aţ gramlabilní, hákovitě prohnutá drobná pohyblivá tyčinka (lat.mobilis pohyblivý, lat.uncus hák). Podobně jako u gardnerel, nacházíme mobilunky jak ve vagině zdravých ţen, tak i u pacientek s BV. Nejčastěji se vyskytující druh je Mobiluncus curtisii. Vzhledem k tomu, ţe je to striktní anaerob, je kultivace poměrně náročná. Roste na půdách obohacených krví, kultivaci je nutno prodlouţit aţ na pět dní. Z tohoto důvodu je diagnostika zaloţena výhradně na mikroskopickém průkazu (Nugentovo skóre)(1),(2),(3). 2.3.1. Endogenní infekce Rozeznáváme několik druhů infekcí vaginy: aerobní vaginitida, bakteriální vaginóza a vulvovaginální kandidóza. 2.3.1.1. Aerobní (bakteriální) vaginitis Aerobní vaginitis (AV) je zánět pochvy způsobený přemnoţením aerobních bakterií, zejména E.coli, stafylokoky, enterokoky nebo streptokoky. Jelikoţ se většinou jedná o bakterie s pyogenním potenciálem, pozorujeme v sekretu velké mnoţství leukocytů. Typickým příznakem aerobní vaginitidy je přítomnost hojného, hustého, 12

bělavě nebo ţlutavě zabarveného páchnoucího sekretu. Diagnostika je zaloţena téměř výhradně na kultivaci odebraného sekretu a průkazu infekčního agens. U ţen s hnisavým výtokem je nutno vyloučit přítomnost gonokoků nebo chlamydií. K terapii se pouţívají antibiotika, často stačí lokální podání (1),(7),(11). 2.3.1.2. Bakteriální vaginóza Pojmem bakteriání vaginóza rozumíme poruchu mikrobioty. Za normálního stavu se u ţen obvykle nachází zvýšené mnoţství laktobacilů, při bakteriální vaginóze jejich počet v důsledku změny ph klesá. Nahradí je přemnoţené anaeroby, gardnerelly a dalších druhy. Zatím není znám přesný mechanismus vzniku onemocnění, pravděpodobně ale nedochází k přenosu bakterií sexuální cestou. Jako predispoziční faktory bakteriální vaginózy se uplatňuje kouření, vyšší počet sexuálních partnerů, obezita apod. Změny ve sloţení fyziologické mikroflóry evidujeme i v průběhu normálního menstruačního a ovulačního cyklu. V literatuře se uvádí, ţe bakteriální vaginóza je nejčastější zánětlivé onemocnění vaginy u ţen v reprodukčním věku, činí 40-50% všech vaginálních infekcí. Klinický obraz představuje hojný výtok, rybí zápach. Pro potvrzení diagnózy j e důleţitý průkaz infekčního původce, často se jedná o polymikrobii. Základem jsou Amselova kritéria nebo Nugentovo skóre. Amselova kritéria: Je to komplexní hodnocení vaginálního sekretu našedlá barva výtoku, ph vyšší neţ 4,8, pozitivní KOH (aminový) test a přítomnost tzv. clue cells v mikroskopii. Kaţdý jednotlivý nález je hodnocen jedním bodem, pro bakteriální vaginózu je nutná přítomnost tří ze čtyř uvedených kritérií. Nugentovo skóre bylo poprvé publikováno v roce 1991. Hodnotí se mikroskopie stěrů z vaginy. Preparát se barví podle Grama a porovnává se přítomnost bakteriálních morfotypů v nátěru. Odlišují se tři bakteriální morfotypy morfotyp Lactobacillus (velké grampozitivní tyčky), morfotyp Gardnerella a Bacteroides (malé gramnegativní tyčky) a morfotyp Mobiluncus (malé prohnuté gramlabilní tyčinky). Podle nálezu a mnoţství jednotlivých morfotypů se stanovuje skóre podle tabulek. Body se sčítají, skóre 0-3 vylučuje BV, skóre 4-6 se označuje jako hraniční stav a pro potvrzení diagnózy BV musí byt skóre 7 a vyšší. V roce 2007 bylo skóre rozšířeno o další morfotyp purulentní (nález >5 polymorfonukleárů v zorném poli, přítomné laktobacily, chybí klíčové buňky) (1),(7). 13

Obrázek 2- Nugentovo skóre Vulvovaginální kandidóza Je to lokální infekce kvasinkového původu. Nejčastějším původcem je Candida albicans. V poslední době dochází ke zvýšení incidence kvasinkovitých infekcí, zvyšuje se i podíl jiných druhů kvasinek např.candida glabrata nebo Saccharomyces cerevisiae. Postiţena je hlavně dolní část ţenského geniálu (pochva, poševní vchod). Projevy mohou být pestré, často probíhá asymptomaticky. Mezi charakteristické projevy patří pruritus, výtok, pálení nebo bolestivost vulvy, případně místní otok nebo erytém. U fertilních ţen se tyto příznaky zesilují asi týden před menses. Plně rozvinutý akutní zánět kandidového původu označujeme jako mykotická kolpitida s výskytem pablán na sliznici nebo erytémem. Často dochází k rekurencím (opakovaný výskyt). U tzv. primární VVK nejsme schopni identifikovat vyvolávající moment, u sekundární jsou predispoziční faktory např. neléčený diabetes mellitus, léčba imunosupresivy nebo antibiotiky (1),(8),(9),(10). 14

Diagnostika: Výtěr u vaginy kultivujeme na Sabouraudově agaru, kvasinky rostou v bílých koloniích s charakteristickou vůni po chlebu. Kultivace je vţdy doplněna citlivostí k antimykotikům. Další moţností je mikroskopický průkaz (MOP VI)(1),(4),(11). Léčba: K lokální terapii VVK se uţívají zejména imidazoly, při častém selhání léčby je nutno podávat antimykotika současně perorálně. Vţdy by měl být vyšetřen i přeléčen sexuální partner (1),(12),(13). Candida albicans Candida albicans je nejvýznamnějším původcem vulvovaginální kandidozy. Odpovídá za 80-90% nálezů. Všechny kvasinky oválné blastokonidie aţ pseudohyfy, které svědčí pro rychlý růst a mnoţení.. Kultivace kvasinek nečiní velké problémy. Rostou téměř na všech kultivačních médiích v drobných bílých koloniích, jako selektivní se pouţívá Sabouraudův agar. Obsahuje antibiotika k potlačení průvodní bakteriální flóry a cukry pro podporu růstu. K identifikaci jednotlivých druhů kvasinek lez vyuţít chromogenní Candiselect (3),(8),(9),(10). 2.3.2. Exogenní infekce Neisseria gonorrhoeae Gramnegativní diplokok tvaru kávového zrna. Na povrchu má fimbrie, které jako faktor virulence slouţí zejména k adherenci na sliznici močové trubice nebo vaginy. Způsobuje kapavku. Je to klasická pohlavní nemoc přenášená výlučně pohlavním stykem. Projevuje se jako neinvazivní zánět urogenitálních sliznic. Bakterie jsou pevně vázány na epitel sliznice a díky fimbriím nemohou být odplaveny močí. Onemocnění se u muţů projevuje několik dní po nechráněném vaginálním nebo análním styku hnisavým výtokem z ústí močové trubice. Vzácnější komplikací je prostatitida. U ţen můţe zpočátku infekce proběhnout asymptomaticky, následně se rozvíjí ascendentní nebo systémová forma. Projevuje se jako zánět děloţního čípku (zánětlivé eroze na čípku, výtok z cervixu), zarudnutí ústí uretry, pálení při močení. Komplikací u ţen je zánět vejcovodů s následnými srůsty ústícími aţ v neplodnost. U ţen nemusí být akutní příznaky markantní, proto spíše u pacientek přechází infekce do chronicity. Při oráních praktikách vzniká faryngitida nebo tonsilitida. K nákaze novorozence dochází při průchodu infikovanými porodními, brána vstupu je oční 15

spojivka. Jako prevence gonokokové konjunktivitidy se provádí tzv.kredeizace, vkapávání 1% roztoku dusičnanu stříbrného do očí. Inkubační doba je u muţů 5 dnů a uţ ţen i více neţ dva týdny (1),(3),(7). Gonokoky můţeme prokázat ve vaginálním nebo uretrálním sekretu mikroskopicky (MOP IV), nebo kultivačně. Jsou to choulostivé a kultivačně náročné bakterie. Jsou kapnofilní, vyţadují atmosféru s obsahem 5-7% CO2 a dostatečnou vlhkost. Ke kultivaci je téţ třeba zvolit obohacená kultivační média např. čokoládový agar nebo Neisseria Selective Medium Plus (2),(4),(7),(11). Gonokoky vykazují vysoký stupeň rezistence k penicilinu a jeho derivátům. Lékem volby jsou cefalosporiny 3. generace, zejména ceftriaxon nebo cefepim, dále vybrané aminopeniciliny (s inhibitorem) nebo v některých případech fluorochinolony nebo tetracykliny (kontraindikované u novorozenců)(2),(3),(12),(13). Obrázek 3 - Neisseria gonorrhoeae - čokoládový agar Trichomonas vaginalis Pohyblivý 10-20ŋm velký parazit. Pohybuje se pomocí bičíků a undulující membrány. Trofozoiti se mnoţí na vaginální sliznici. Produkují adhezivní proteiny, které napomáhají přichycení na poševní sliznici. Obalují se hostitelskými proteiny, coţ vyuţívají při obraně proti imunitnímu. U ţen se nákaza projeví zapáchajícím 16

svědivým výtokem, je ţluté aţ zelené barvy, často zpěněný. U 75% ţen s vaginální trichomonózou pozorujeme současné postiţení urety. Při přechodu do chronicity je symptomatologie chudá. U muţů způsobuje trichomonáda uretritidu mnohdy s asymptomatickým průběhem. Zdrojem je výlučně nemocný člověk. K přenosu dochází vzhledem k citlivosti parazita k vnějším vlivům výlučně pohlavním stykem. Výjimečně můţe dojít k přenosu prádlem (ručníky) nebo vodou (drobné epidemie těhotných cvičení v bazénech) (1),(3),(7). Diagnostika: Přestoţe se jedná o parazita, je moţno ho kultivovat bez přítomnosti hostitele. U ţen se vyšetřuje vaginální sekret, u muţů výtěr z uretry nebo exprimát z prostaty. Trichomonády kultivujeme ve speciálních tekutých médiích Diamondovo médium nebo C.A.T. (kombinovaná půda pro kultivaci trichomonád a kvasinek). Diagnostika pomocí nativního preparátu vyuţívá velikosti a pohyblivosti mikroba. Vaginální sekret lze obarvit podle Giemsy MOP V (2),(4),(7),(11). K léčbě se pouţívá metronidazol, vţdy je nutné vyšetřit a přeléčit všechny sexuální partnery (2),(3),(12),(13). Streptococcus agalactiae Streptococcus agalactiae nezpůsobuje primárně vagintidy, ale díky kolonizaci je velmi důleţitý pro diagnotiku infekcí novorozence. Je to grampozitivní β-hemolytický streptokok. Koky jsou seřazeny v řetízkách. Na povrchu je skupinový C-polysacharid, který ho řadí do skupiny B. Streptococcus agalactiaee kolonizuje poševní sliznici téměř 40% ţen. Je původce sepse a purulentní meningitidy novorozence. K nákaze dochází při porodu, brána vstupu je oční spojivka nebo respirační trakt. Preventivně se provádí monitoring těhotných výtěr z vaginy slouţící ke kultivačnímu průkazu Streptococcus agalactiae. Při pozitivitě je novorozenec sledován, ev.zaléčen penicilinem (1),(3),(7). Vaginální sekret odebraný vatovým tampónem kultivujeme na krevním agaru, v atmosféře obohacené CO2 (7),(4),(7),(14). Antibiotiky je léčen pouze novorozenec. Antibiotická profylaxe u těhotných se neprovádí (2). 17

Obrázek 4 - Streptococcus agalactiae - krevní agar Obrázek 5 - Streptococcus agalactiae - chromogenní agar, vlevo pozitivní, vpravo negativní Treponema pallidum Treponema pallidum patří mezi spirochéty. Tvarově je to hustě stočená spirála, která je dlouhá 5-20 mikrometrů. Treponema je patogenní primárně pro člověka a ten je také její jediný hostitel. 18

Treponema pallidum způsobuje onemocnění syfilis (lues,příjice). K přenosu dochází pohlavním stykem, krví a slinami, transplacentárně (adnatální syfilis). Po průniku do těla se treponemata dostávají do lymfatických cest a krví do kteréhokoliv orgánu. Získanou syfilis dělíme na časnou a pozdní. Časnou syfilis dále dělíme na: Primární syfilis Za dva aţ čtyři týdny od nákazy se v místě vstupu vytvoří tvrdý vřed (ulcus durum - tuhé uzlovité loţisko ze specifické granulační tkáně) velký jeden aţ několik centimetrů. Má neostré ohraničení, rudou spodinu. Vřed je nebolestivý, lokalizovaný na vnějším genitálu, cervixu, v ústech nebo v okolí análního otvoru. Spontánně se vyhojí zhruba do jednoho měsíce. Asi 14 dní od manifestace vředu dochází ke zdruření regionálních místních uzlin. Objevují se první protilátky. Sekundární syfilis Toto stadium nastupuje cca za 2-12 týdnů od vyhojení primárního vředu. Je charakterizováno chřipkovitými příznaky zvýšená teplota, bolest hlavy a kloubů. Na kůţi jsou patrné typické eflorescence - ploché papulky s macerovaným povrchem. Makulopapulózní exantém na trupu a končetinách je vysoce infekční. Na sliznicích vidíme mokvavé pláty, zarudlé erodované plochy. Pacienta netrápí ţádné bolesti, vše spontánně vymizí za 4-6 týdnů. Při neléčené syfilis se objevují časté relapsy. Po zhojení projevů sekundární syfilis se infekce dostává do stadia latence. Pozdní syfilis označujeme také jako terciární stadium. K projevům dochází i desítky let po primární infekci, postiţeny jsou různé orgány. Pacient není v tomto stadiu infekční. Nejčastější formy pozdní syfilis jsou kardiovaskulární syfilis, neurosyfilis a gumma. Gumózní projevy tvoří se gummata.gumma je pruţný laločnatý útvar specifické tkáně, nachází se v mozku, játrech, v kostech, ve varlatech, na lebce, jeho velikost je rozmanitá, pohybuje se od 1mm aţ po několik centimetrů (i velikost lidské pěsti). Jsou tvořena kaseifikační nekrózou s paprsčitou jizvou, která oslabuje funkci postiţeného orgánu. Nemusí se vůbec vyskytnout. Nová gummata se objevují po vyléčení předchozího. Negumózní projevy postiţen je kardiovaskulární a centrální nervový systém. Aortitis zánětlivé změny na aortě. Dochází k zesílení aortální stěny vazivem, které sniţuje její pruţnost, zvyšuje se tuhost, hypertrofuje 19

svalovina levé komory, srdce se zvětšuje a celý proces můţe vyústit v dysfunkci srdce. Někdy můţe naopak dojít k oslabení stěny aorty vedoucí ke vzniku aneurysmatu a jeho ruptuře. Paralysis progresiva degenerace vazivových obalů mozku, dochází k jejich hypertrofii a následným tlakem na mozkovou kůru k její atrofii. K nespecifickým projevům paralysis progresiva patří zahálčivost, hrubost, sociální degradace, poruchy paměti, pozornosti aţ demence. Tabes dorsalis zánětlivý proces postihuje zadní provazce míšní, to má za následek zkreslené informace z oblasti dolních končetin projevující se především nejistou chůzí. Vrozená syfilis K přenosu bakterií dochází vertikálně přes placentu z matky na plod v děloze nebo při porodu průchodem porodními cestami. Stupeň postiţení dítěte závisí na velikosti infekční dávky a na stupni těhotenství, ve kterém k nákaze došlo. Většinou má pro novorozence fatální následky. Treponemy napadají všechny orgány (plíce, játra, slinivka břišní), je porušena osifikace s následnými deformitami kostí (šavlovité tibie, sedlovitý nos, caput quadratum, atd.), centrální nervový systém (Hutchinsonova trias: keratitis - těţký zánět rohovky s následnou poruchou zraku nebo slepotou, labyrintitis - zánět vnitřního ucha s poruchou aţ ztrátou sluchu a Hutchinsonovy zuby soudkovité řezáky) (1),(3). Diagnostika syfilis se opírá výlučně o sérologický průkaz protilátek v séru matky nebo novorozence. Pouţívají se treponemové a netreponemové testy, vţdy s verifikací Western-blotem. Přímý kultivační nebo mikroskopický průkaz se pro náročnost neprovádí (1). Lékem volby je benzylpenicilin. Rezistence k penicilinu zatím nebyla zaznamenána. Při alergii na penicilinová antibiotika lze vyuţít makrolidy nebo tetracykliny (12),(13). Chlamidia trachomatis Patří do čeledi Chlamydiaceae. Je to nejčastější původce tzv. negonokokové uretritidy a vaginitidy (60-70 % ţen je asymptomatických nosiček). U muţů způsobuje záněty prostaty, nadvarlete a u ţen cervicitidy, uretritidy, salpingitidy a endometritidy. Akutní zánět často přechází do chronicity s následnou neprůchodností a neplodností. 20

U Chlamydia trachomatis rozeznáváme řadu sérotypů. Významné u venerických chorob jsou sérotypy D-K, vyvolávající negonokokovou uretritidu a L1-L3, vyvolávající lymphogranuloma venereum. Kultivace chlamydií je vhledem k jejich růstovému cyklu náročná, na buněčných kulturách. Pro rutinní praxi je tato metoda zcela nevhodná (dlouhá doba kultivace, finanční náročnost). Chlamydia trachomatis nevyvolává protilátkovou odpověď, proto nelze sérologické metody také vyuţít. Pro potvrzení agens se pouţívá průkaz nukleové kyseliny v moči pomocí molekulárně biologických metod PCR. Chlamydiové infekce se léčí antibiotiky. Antibiotiky volby jsou u dětí makrolidy a u dospělých tetracykliny nebo fluorochinolony (1),(2),(4),(6),(13). Urogenitální mykoplazmata Mycoplasma hominis a Ureaplasma urealyticum Mykoplazmata jsou bakterie bez klasické bakteriální buněčné stěny. Jelikoţ nemají buněčnou stěnu, nedají se znázornit barvením podle Grama, můţeme je pozorovat v preparátu obarveném podle Giemsy. Bakterie pak mají různý tvar (koky, prstence, polymorfní tyčinky aţ vlákna). Klasická kultivace na pevných půdách je téměř nemoţná, v klinické praxi se vyuţívá pouze jejich biochemická aktivita v tekutých médiích. Pro průkaz přítomnosti M.hominis pouţíváme půdu obohacenou argininem a k záchytu U.urealyticum půdu obohacenou ureou. Ke stanovení přítomnosti obou bakterií existují komerčně vyráběné soupravy, kultivace probíhá v termostatu se zvýšenou tenzí CO2 a prodluţuje se vzhledem k dlouhé generační době na 48 hodin. Součástí soupravy je semikvantitativní stanovení k lékům volby. Urogenitální mykoplazmata zejména M.hominis bývá izolováno u 35-80% zdravých ţen, coţ můţe činit potíţe při interpretaci pozitivních nálezů. Mykoplazmata se podílejí na vzniku endometritid a mohou způsobit předčasnou rupturu plodových obalů. K terapii mykoplazmat jsou vhodná antibiotika ze skupiny tetracyklinů, makrolidů nebo fluorochinolonů. Důleţitá je doba uţívání antibiotik, obvykle aţ 3 týdny (1),(2),(4),(6),(13). 21

Obrázek 6. M.hominis pozitivní, U.urealyticum negativní Obrázek 7 - M.hominis a U.urealyticum negativní 22

3. Praktická část 3.1. Diagnostika 3.1.1. Mikroskopie Mikroskopická diagnostika lézí na vulvě se opírá o vyšetření vzorku získaného abrazí, kultivační vyšetření stěrů z endocervixu a vaginy je fakultativně doplněno mikroskopickým vyšetřením (MOP). MOP mikrobiální obraz poševní MOP se hodnotí mikroskopicky v preparátech barvených dle Grama a dle Giemsy ve světelném mikroskopu objektivem 100 s imerzním olejem. Dělí se na šest základních obrazů označovaných římskými číslicemi I-VI, u nichţ jsou rozlišovány další podskupiny a-c. V preparátu barveném dle Grama se hodnotí barvitelnost a morfologie mikroorganismů, jejich kvantita, přítomnost a mnoţství leukocytů a vaginálních epitelií. Preparát obarvený dle Giemsy je určen pro mikroskopický průkaz Trichomonas vaginalis, hodnotí se mnoţství leukocytů a vaginálních epitelií. Vyšetření se provádí u ţen jako součást běţné preventivní gynekologické prohlídky nebo u ţen, které mají klinické projevy vaginální infekce. Mikroskopické vyšetření má doplňovat vyšetření kultivační. Vaginální sekret odebírá vyškolený gynekolog (příp.venerolog) ze zadní klenby poševní nebo z cervixu a ihned ho aplikuje na podloţní sklíčka. Po zaschnutí jsou tato sklíčka opatřena ochranným obalem (alobal, igelitový sáček nebo nejlépe speciální krabička na transport a uchování podloţních sklíček) a dopravena do mikrobiologické laboratoře do 2 hodin po odběru. Sklíčka musí být čitelně označena a doplněna průvodním listem s údaji o pacientce a se specifikací vzorku (vagina, cervix). V laboratoři po obarvení VŠ mikroskopicky vyhodnotí preparáty a do LIS popíše mikroskopický nález a jako závěr uvede do výsledku klasifikaci MOP. Výsledek uzavírá a uvolňuje k tisku jako samostatný nález nebo jako součást výsledku kultivace výtěru z vaginy, popř. hrdla děloţního (15). Hodnocení MOP Ia převaţují vaginální epitelie a laktobacily. Normální obraz zdravých dospělých ţen. 23

MOP Ib hojně leukocytů a laktobacilů, méně epitelií. Normální obraz u těhotných, u ţen bezprostředně po menzes, v intermenstruu i v menopauze. MOP IIa mnoho epitelií bez laktobacilů, směs hojných koků a tyčinek, málo leukocytů. Jedná se o nehnisavý bakteriální výtok. MOP IIb málo epitelií a leukocytů bez laktobacilů, přítomnost vibrií vedle směsi koků a tyčinek. Jedná se o vibriový výtok. MOP IIIa méně epitelií, hojně leukocytů bez laktobacilů, bohatá směs tyčinek a koků. Jedná se o bakteriální výtok hnisavý. MOP IIIb málo epitelií bez laktobacilů, hojně leukocytů se streptokoky intracelulárně uloţenými. Jedná se o výtok streptokokový. MOP IVa velké mnoţství leukocytů s intracelulárně i extracelulárně uloţenými g- neg.diplokoky, bez laktobacilů. Jedná se o akutní kapavku MOP IVb velké mnoţství leukocytů s gonokoky, příměs jiných bakterií a malého mnoţství epitelií. Jedná se o chronickou kapavku. MOP Va velké mnoţství leukocytů, trichomonád, ojediněle epitelie bez laktobacilů. Jedná se o akutní trichomoniázu. MOP Vb dosti epitelií, mnoho leukocytů bez laktobacilů, trichomonády a směs koků a tyčinek. Jedná se o kulminující trichomoniázu. MOP Vc dost epitelií, málo leukocytů a laktobacilů, trichomonády i bakterie. Jedná se o chronickou nebo latentní trichomoniázu. MOP VIa dost epitelií s laktobacily, nepatrně leukocytů, blastospóry a pučící pseudomycelium. Jedná se o mykózu nehnisavou. MOP VIb dost epitelií, mnoho leukocytů, laktobacily, blastospóry a pseudomycelia se směsí bakterií. Jedná se o mykózu hnisavou (11),(16). 24

Obrázek 8 - MOP Ia barvení podle Grama Obrázek 9 - MOP I b - barvení podle Giemsy 25

Obrázek 10 - MOP IIb - barvení podle Grama Obrázek 11 - MOP IIIa - barvení podle Grama Obrázek 12 - MOP VI barvení podle Giemsy 26

Obrázek 13 - MOP VI - barvení podle Giemsy Obrázek 14 - MOP VI - barvení podle Grama 27

Obrázek 15 - MOP VI - barvení podle Giemsy 3.1.2. Kultivace 3.1.2.1. Princip Základem kultivačního vyšetření výtěru z pochvy a cervixu je průkaz kultivovatelných bakteriálních původců infekcí ţenského genitálu na pevných univerzálních a selektivních půdách v aerobním a mikroaerofilním prostředí a průkaz Trichomonas vaginalis a kvasinek pomnoţením v jedné selektivní tekuté půdě. 3.1.2.2. Odběr, transport a příjem materiálu Vzorky pro kultivaci jsou odebrány ambulantními specialisty gynekology nebo venerology a transportují se do laboratoře jako výtěry na tamponech zanořených v transportním médiu nebo výtěr aplikovaný do speciálního transportního média pro kultivaci urogenitálních mykoplazmat. Pokud je vzorek nesprávně odebraný, poškozený nebo nesplňuje poţadované transportní podmínky nebo je opatřen nedohledatelnou identifikací, nemůţe být přijat a zpracován. Kaţdý vzorek musí být opatřen štítkem, na kterém je uvedena identifikace vzorku a pacienta a doručen s řádně vyplněnou ţádankou. Po příjmu jsou vzorkům přiřazena protokolární čísla. Údaje na ţádance jsou zapsány do LIS. Stejnými čísly jsou označeny i kultivační půdy. Kultivační půdy jsou vytemperovány na laboratorní teplotu. 28

3.1.2.3. Kultivační půdy Columbia agar + sheep blood plus (=krevní agar), Endo agar, Gardnerella vaginalis selective medium, Neisseria selective agar, Sabouraud+genta agar, Trichomonas (dříve Diamondovo) medium, thioglykolátová pomnoţovaní půda, Brilliance GBS agar. V přehledu jsou uvedeny všechny pouţité kultivační půdy a moţnost jejich vyuţití. Krevní agar (Columbia agar) Krevní agar patří mezi základní pevné kultivační půdy, rostou na něm téměř všechny bakterie. Výjimku tvoří obtíţně kultivovatelné kmeny např.hemofily nebo patogenní neisserie. Výhodou krevního agaru je identifikace bakterií podle produkce toxinů hemolyzinů. Endo agar Endova půda je selektivně diagnostický agar, slouţí ke kultivaci gramnegativních tyčinek. Selekce grampozitivní flóry je dosaţeno přídavkem fuchsinu, je moţno podle barevné změny narostlých kolonií pozorovat štěpení laktózy. Gardnerella vaginalis selective medium Toto médium je patří mezi speciální krevní agary, gardnerelly na něm rostou v typických drobných koloniích s malou zónou hemolýzy. Neisseria selective agar Kultivační půda svými růstovými moţnostmi podobná čokoládovému agaru. Rostou na ní patogenní hemofily a neisserie v podobě drobných leských koloniích imitujících kapičky rosy. Sabouraudův agar Sabouraudův agar je selektivní médium určené ke kultivaci kvasinek a plísní. Obsaţená antibiotika potlačují růst veškerých bakterií, cukry naopak růst kvasinek podporují. Trichomonas medium Toto médium je tekuté, prvoci se diagnostikují zhotovením nativního preparátu a pozorováním jejich typického kotrmelcovitého pohybu. Thioglykolátová pomnoţovací půda Jak z názvu vyplývá, je vyuţívána k pomnoţení bakterií, které mohou být v primárním vzorku v malé kvantitě. Jedná se o tekuté médium. Brilliance GBS agar 29

Tento tzv.chromogenní agar se pouţívá výhradně k záchytu Streptococcus agalactiae z vaginálního výtěru. Tato patogenní bakterie na něm roste ve fialových koloniích, ostatní flóra většinou v bílých nebo zelených. Mueller-Hinton agar Médium souţí ke stanovení citlivosti patogenních bakterií difúzní diskovou metodou (2),(14),(15). 3.1.2.4. Kultivace Pomocí tamponu s odebraným vzorkem se materiál inokuluje na ¼ povrchu kaţdé z výše uvedených tuhých kultivačních půd. Pouţitý tampon se po inokulaci na půdy zanoří do Trichomonas média. Inokulum na kultivačních půdách je rozočkováno dvěma sterilními bakteriologickými kličkami po ½ plochy. Přes očkovací čáry na krevním agaru je další bakteriologickou kličkou převrstven prouţek laboratorního kmene Staphylococcus aureus. Naočkované krevní agary, Neisseria selective agar a půda ke kultivaci Gardnerella vaginalis jsou kultivovány v termostatu při 37 C s 5%CO 2, Endova půda, Sabouraudova půda, Trichomonas médium v termostatu při 37 C. Kultivace probíhá 18-24 hodin. Agar pro patogenní neisserie, půda pro kultivaci Gardnerella vaginalis a Sabouraudova půda jsou kultivovány 48 hodin. Diamondovo médium se prohlíţí mikroskopicky v podobě nativního preparátu po 24 a 48 hodinách kultivace. Monitoring gravidních ţen: Při monitoringu gravidních ţen se odebrané vzorky (rektum+vagina) nejprve inkubují 18-24 hodin v pomnoţovací thioglykolátové půdě, pak se vyočkují ne selektivní půdu pro záchyt Streptococcus agalactiae (Brilliance GBS agar). K dourčení bakteriálních druhů se vyuţívá hmotnostní spektrometrie (2),(14),(15). 3.1.2.5. Průkaz urogenitálních mykoplazmat K diagnostice urogenitálních mykoplazmat se pouţívá komerční souprava Myco View. Podle přiloţeného návodu se smíchá transportovaný vzorek s kultivačním médiem a pomocí automatické pipety se vzniklá suspenze inokuluje do připraveného stripu. Kaţdá jamka se zakape parafínovým olejem, jelikoţ kultivace probíhá v anaerobním prostředí. Celý naočkovaný prouţek se uzavře přilnavou fólií a inkubuje aţ 48 hodin při 37 C. Základem hodnocení je změna barvy tekutého média 30

na podkladě produkce ureázy. Současně se odečítá i semikvantitativní citlivost k antibiotikům volby. 3.1.2.6. Průkaz Chlamydia trachomatis Pro přímý průkaz Chlamydia trachomatis se odebírá první porce moče. Dříve doporučované stěry z muţské uretry se vzhledem k obtíţné dostupnosti vzorku prakticky nevyuţívají. V moči je bakterie stanovena pomocí PCR přímý průkaz nukleové kyseliny. Spolehlivost této metody je 98% (2),(14),(15). 3.1.3. Hodnocení Ve výsledku je zaznamenán mikroskopický nebo kultivační nález: vzorek je negativní nebo obsahuje patogenní bakterie nebo obsahuje nepatogenní bakterie, které jsou součástí komenzální mikroflóry. V celkovém konečném výsledku je uveden výsledek MOP nebo kultivace (negativní nebo pozitivní doplněná o stanovení citlivosti k ATB, případně interpretace výsledku). Výsledky jsou evidovány v laboratorním informačním systému. VŠ pracovník validuje výsledky, uvolňuje do tisku a převádí do celonemocničního systému. Kultivační nález Neisseria gonorrhoae podléhá povinnému hlášení depistáţní sestře dermatovenerologie. O tomto hlášení je proveden záznam do výsledku. Je zaznamenáno datum, čas, obsah hlášení a jména hlásící a informaci přijímající osoby. Vytištěný výsledek je odeslán v zalepené obálce k rukám lékaře. Výsledek průkazu Chlamydia trachomatis je pozitivní nebo negativní (14),(15). 3.2. Praktické provedení 3.2.1. Materiál a metodika Odběr vzorků Odběry vzorků prováděli zaměstnanci na jednotlivých odděleních u pacientek s podezřením na zánětlivé onemocnění genitálu nebo při běţných kontrolách. Do souboru byla zařazena téměř všechna oddělení nemocnice. Odběr byl prováděn v souladu s laboratorní příručkou, která je volně dostupná k nahlédnutí na internetových stránkách nemocnice. Personál odebíral vaginální sekret na podloţní sklíčka, výtěr z vaginy na tampón nebo moč do sterilních odběrových nádobek určených k odběru moče. 31

Transport vzorků Transport byl zajištěn ţurnální sluţbou. Vzorky bylo nutno doručit do laboratoře co nejdříve po odběru, nejdéle do dvou hodin. Pokud nebylo moţno zaslat materiál na kultivaci (tampón) ihned, byl transportován v transportním médiu. Příjem materiálu Řádně označené vzorky, doplněné ţádankou s vyznačením poţadovaného vyšetření byly přijaty v příjmové laboratoři, zapsány do laboratorního programu a byla jim přidělena protokolární čísla. Zpracování materiálu Všechny vzorky byly zpracovány podle poţadovaného vyšetření. Byly obarveny preparáty v případě vyšetření MOP nebo byla zaloţena kultivace nebo provedeno PCR. Kultivace probíhala podle jiţ výše uvedeného postupu. Narostlé kolonie byly dourčeny na základě svých růstových vlastností a pomocí moderní metody hmotnostní spektrometrie (MALDI-TOF). Tato metoda vyuţívá schopností laseru ionizovat ribozomální proteiny bakteriálních buněk, kvasinek i některých plísní. Systém získané spektrum porovná se svojí databází a vyhodnotí ho. Databáze čítá cca 5000 bakteriálních agens. U patogenních kmenů byla stanovena citlivost na antibiotika difúzním diskovým testem. Výsledky Výsledky byly zaznamenány do laboratorního programu, povinně hlásitelné byly telefonicky nahlášeny lékaři, který si vyšetření vyţádal a na oddělení hygieny. Výsledky byly dále po kontrole VŠ pracovníkem uvolněny, vytištěny a odeslány na příslušná oddělení (2),(14),(15). 3.2.2. Vyhodnocení praktické části V Ústavu lékařské mikrobiologie FN v Motole, kde jsem prováděla praktickou část své absolventské práce, bylo ve stanoveném období 1.1.- 31.1.2015 vyšetřeno základní kultivací 331 vzorků (z toho bylo 278 ambulatnů a 53 hospitalizovaných). Přehled všech nálezů udává tabulka 1. U 26 pacientek byla diagnostikována kvasinka, u 19 Gardnerella vaginalis, Streptococcus agalactiae byl při základní kultivaci zachycen ve 48 a enterobakterie ve 31 případech. Trichomonas vaginalis se v ţádném vzorku nepodařilo prokázat. 32

Tabulka 1-Výsledky základní kultivace Nálezy Četnost Actinomyces urogenitalis 1 Candida sp. 24 Candida albicans 2 Corynebacterium sp. 2 Enterococcus 3 Enterococcus faecalis 13 Enterococcus faecium 1 Escherichia coli 30 Finegolgia magna 1 Gardnerella vaginalis 19 Klebsiella pneumoniae 1 Lactobacillus sp. 75 Rothia mucilaginosa 1 Staphylococcus aureus 2 Streptococcus agalactiae 48 Streptococcus anginosus 1 Streptococcus beta-hemolytický sk.c 2 Streptococcus mitis 1 Streptococcus oralis 5 Streptococcus pneumoniae 2 Streptococcus pyogenes 3 Streptococcus salivarius 14 Streptococcus sp., viridující 1 Difteroidy 3 33

Stafylokoky koaguláza negativní 29 Negativní 56 Vyšetření GBS průkaz beta-hemolytického streptokoka sk.b bylo provedeno 196x, z toho pozitivních bylo 29 vzorků. Podrobné nálezy tohoto vyšetření upřesňuje tabulka 2. Tabulka 2-GBS Nález Rothia mucilaginosa 1 Streptococcus agalactiae 29 Streptococcus anginosus 1 Streptococcus mitis 1 Streptococcus oralis 4 Streptococcus salivarius 14 Viridující streptokoky 3 Negativní 143 34 Četnost Vyšetření MOP si vyţádalo pouze 7 lékařů, pouze v jednom případě byla mikroskopie doplněna kultivací. Výsledky v tabulce 3. Tabulka 3-MOP Vzorek č. MOP č. 1 Ia 0 2 IIa E.coli 3 VIa 0 4 VIa 0 5 IIIa 0 6 VIa 0 7 IIb 0 Kultivace, výsledek Přímý průkaz chlamydií z moče byl proveden u 10-ti pacientek, 2x pozitivní nález.

Urogenitální mykoplazmata byla vyšetřena 43x, pozitivních nálezů M.hominis bylo 5, U.urealyticum 7. Nález obou bakterií současně jsem zaznamenala 2x, zbývající vzorky byly negativní.shrnutí v tabulce 4. Tabulka 4-Urogenitální mykoplazmata Nález Mycoplasma hominis 5 Ureaplasma urealyticum 7 Mycoplasma hominis a Ureaplasma urealyticum 2 Negativní 29 Četnost 35

4. Diskuse Infekční onemocnění ţenského pohlavního systému jsou způsobena rozmanitými původci z řad bakterií, identifikovány jsou kvasinky i parazité. Z tohoto důvodu znamená jejich diagnostika rozmanitý přístup. Jsou vypracovány tzv. Standardní operační postupy, podle nichţ kaţdá akreditovaná laboratoř poţadované vyšetření provádí. Tato vyšetření zahrnují mikroskopii, kultivaci, přímý průkaz a také průkaz nepřímý pomocí stanovení protilátek proti původci. Součástí kaţdého výsledku je uvedení původce a citlivosti k lékům volby. Při průkazu infekčního agens, které podléhá povinnému hlášení, se uplatňuje mezioborová spolupráce. Je aktivován epidemiolog, který se snaţí zjistit zdroj infekce a kontakty nemocného s cílem zabránit dalšímu šíření. Mikrobiologické laboratoře se tedy přímo podílejí na epidemiologickém šetření. Během sledovaného období bylo vyšetřeno základní kultivací 331 vzorků. Kvasinky byly u 26 pacientek, Gardnerella vaginalis u 19, Streptococcus agalactiae u 48 a enterobakterie u 31 pacientek. Některé patogeny byly zachyceny současně. Trichomonas vaginalis zachycena nebyla. Mikroskopické vyšetření vaginálního sekretu (MOP) si zadalo v ţádance pouze 7 specialistů. To je v rozporu s novými kritérii pro celkové hodnocení infekce. Podle moderních skórovacích systémů by měla být diagnóza stanovena komplexně. Je tedy otázkou, proč gynekologové posílají materiál k mikroskopii sporadicky. Pouze jeden vzorek určený ke kultivaci byl doplněn o vyšetření MOP! Průkaz beta-hemolytického streptokoka sk.b je během těhotenství ze zákona povinný. Jeho záchyt a moţnost antibiotické intervence v porodním období sniţuje riziko nákazy novorozence. V tabulce č. 2 je uveden kromě pozitivních nálezů Streptococcus agalactiae také přehled dalších vykultivovaných bakterií. Při jejich záchytu je výsledek uvolněn jako negativní. Toto vyšetření se v posledních letech stalo nedílnou součástí screeningu v těhotenství. Urogenitální mykoplazmata a chlamydie představují zejména terapeutický problém. Řada kliniků léčí záněty nejen v gynekologii bez mikrobiologického vyšetření pomocí širokospektrých antibiotik. Tyto preparáty mnohdy díky odlišným farmakokinetickým vlastnostem na zmíněné intracelulární bakterie neúčinkují. Proto je potřeba stále upozorňovat na moţnosti diagnostiky z jednoduše dostupného materiálu. Průkaz chlamydií byl diagnostikován u 2 pacientek z 10. PCR je metoda, 36

která je poměrně finančně náročná, z tohoto důvodu bylo patrně zasláno pouze deset vzorků. 5. Závěr Původně jsem chtěla svoji práci zaměřit pouze na mikroskopický průkaz infekčního agens v genitálním traktu u ţen. V literatuře uváděná data však nekorelovala s těmi, která jsem během svého sledování získala. Proto jsem svoji práci rozšířila o moţnosti diagnostiky jak kultivační, tak sérologické. Zaměřila jsem se zejména na diagnostiku přímou a výskyt původců infekcí ţenského zevního genitálu. Předloţila jsem moţnosti diagnostiky původců a na provedení všech uvedených metod jsem se podílela. Na základě poţadavku klinických lékařů byly zaslané vzorky mikroskopovány, kultivovány nebo byl obtíţně kultivovatelný původce prokázán molekulárními metodami. Ve sledovaném období se podařilo zachytit téměř všechny původce, průkaz Trichomonas vaginalis byl jak mikroskopicky, tak kultivačně negativní. 37

Seznam obrázků Obrázek 16 - Lactobacillus sp. - krevní agar Obrázek 17- Nugentovo skóre(zdroj:špaček, Jiří, Vladimír BUCHTA a Petr JÍLEK. Vulvovaginální dyskomfort a poruchy poševního prostředí.) Obrázek 18 - Neisseria gonorrhoeae - čokoládový agar Obrázek 19 - Streptococcus agalactiae - krevní agar Obrázek 20 - Streptococcus agalactiae - chromogenní agar, vlevo pozitivní, vpravo negativní Obrázek 21. M.hominis pozitivní, U.urealyticum negativní Obrázek 22 - M.hominis a U.urealyticum negativní Obrázek 23 - MOP Ia barvení podle Grama Obrázek 24 - MOP I b - barvení podle Giemsy Obrázek 25 - MOP IIb - barvení podle Grama Obrázek 26 - MOP IIIa - barvení podle Grama Obrázek 27 - MOP VI barvení podle Giemsy Obrázek 28 - MOP VI barvení podle Giemsy Obrázek 29 - MOP VI - barvení podle Giemsy Obrázek 30 - MOP VI - barvení podle Grama Obrázek 31 - MOP VI - barvení podle Giemsy 38

Seznam tabulek Tab.1 Výsledky základní kultivace Tab.2 GBS Tab.3 MOP Tab.4 Urogenitální mykoplazmata 39

Seznam zkratek FN fakultní nemocnice VŠ vysokoškolský pracovník BV baktriální vaginóza AV aerobní vaginitis VVK vulvovaginální kandikóza MOP mikrobiální obraz poševní C.A.T půda pro kultivaci trichomonád a kvasinek PCR polymerázová řetězová reakce GBS Group B Streptococcus ATB antibiotika 40

Použitá literatura (1) ŠPAČEK, Jiří, Vladimír BUCHTA a Petr JÍLEK. Vulvovaginální dyskomfort a poruchy poševního prostředí. 1. vyd. Praha: Grada, 2013, 359 s. ISBN 978-80- 247-4554-1. (2) VOTAVA, Miroslav a Petr ONDROVČÍK. Vybrané kapitoly z klinické mikrobiologie. 1. vyd. Brno: Masarykova univerzita, 1998, 90 s. ISBN 80-210- 1805-4. (3) VOTAVA, Miroslav. Lékařská mikrobiologie speciální. Brno: Neptun, 2003, xxii, 495 s. ISBN 80-902896-6-5. (4) MAŠATA, J. Současné možnosti diagnostiky vulvovaginálních infekcí, Česká gynekol 2010, 75:111-117 s. (5) ČIHÁK, Radomír. Anatomie. 3., upr. a dopl. vyd. Editor Miloš Grim. Praha: Grada, 2013, 497 s. ISBN 9788024747880. (6) JÍLEK, P. Systemic immunity in patiens with recurrent vulvovaginal candidiasis. Ces Gynekol 2005, 70:453-459 s. (7) FOERSTL, M. Diferenciální diagnostika zánětů pochvy a zevního genitálu, možnosti a limity mikrobiologického vyšetření. Česká Gynekol, 2005, 70:79-86 s. (8) BUCHTA, V. Mykotické infekce ženského genitálu I. Epidemiologie a mikrobiologie, Gynekolog 1997, 2:67-70 s. (9) BUCHTA, V. Mykotické infekce ženského genitálu II. Diagnoza, Gynekolog 1997, 4:173-175 s. (10) BUCHTA, V. Mykotické infekce ženského genitálu III. Terapie, Gynekolog 1998, 7:73-82 s. (11) MAŠATA, J. Modifikovaná klasifikace mikroskopického hodnocení poševních infekcí, Českoslov Gynekol 2010, 75:199-208 s. (12) JINDRÁK, Vlastimil, Dana HEDLOVÁ a Pavla URBÁŠKOVÁ. Antibiotická politika a prevence infekcí v nemocnici. 1. vyd. Praha: Mladá fronta, 2014, 709 s. Aeskulap. ISBN 9788020428158. (13) HRDINA, Radomír. Farmakologický slovník. Praha: Maxdorf, 1997, 410 s. ISBN 808580042x. 41

(14) VOTAVA, Miroslav. Lékařská mikrobiologie: vyšetřovací metody. Brno: Neptun, 2010, 495 s. ISBN 9788086850047. (15) SOP, řízený dokument ÚLM FN Motol 42