Vyšší odborná škola zdravotnická s Střední zdravotnická škola Praha 1, Alšovo nábřeží 6 ABSOLVENTSKÁ PRÁCE. Markéta Zámečníková

Vyšší odborná škola zdravotnická s Střední zdravotnická škola Praha 1, Alšovo nábřeží 6 ABSOLVENTSKÁ PRÁCE Markéta Zámečníková Praha 2013

Rychlost inkorporace PUFA n-3 do membrán erytrocytů po jejich suplementaci Absolventská práce Markéta Zámečníková Vyšší odborná škola zdravotnická a Střední zdravotnická škola Praha 1, Alšovo nábřeží 6 Studijní obor: Diplomovaný zdravotní laborant Vedoucí práce: Mgr. Barbora Staňková Datum odevzdání práce: 19. 4. 2013 Datum obhajoby: 17. - 19. 6. 2013 Praha 2013

Prohlašuji, že jsem absolventskou práci vypracovala samostatně pod odborným vedením vedoucího absolventské práce a všechny použité zdroje jsem uvedla v seznamu literatury. Praha 19. duben 2013 Podpis:

Děkuji Mgr. Barboře Staňkové za cenné rady, odborné vedení a trpělivost při zpracování mé absolventské práce. Zároveň bych ráda poděkovala RNDr. Evě Tvrzické, CSc. za pomoc při zpracování literárních zdrojů v anglickém jazyce a paní Jiřině Trávníčkové za pomoc při zpracování biologického materiálu. Velmi také děkuji svému nadřízenému, plk. MUDr. Jiřímu Zetochovi, PhD., za podporu a toleranci.

Souhlasím s tím, aby moje absolventská práce byla půjčována ve Středisku vědeckých informací Vyšší odborné školy zdravotnické a Střední zdravotnické školy, Praha 1, Alšovo nábřeží 6. Podpis:

ABSTRAKT Markéta Zámečníková Rychlost inkorporace PUFA n-3 do membrán erytrocytů po jejich suplementaci Vyšší odborná škola zdravotnická a Střední zdravotnická škola, Praha 1, Alšovo nábřeží 6 Vedoucí práce: Mgr. Barbora Staňková Absolventská práce, Praha: VOŠZ a SZŠ, 2013, 58 stran Lidský organismus potřebuje ke své správné funkci vyváženou stravu. V dnešní době je neustále vystavován stresu a nesprávným dietním návykům, jejichž důsledkem mohou být závažná civilizační onemocnění. Chybějící důležité složky potravy bývají nahrazovány dietními doplňky. Cílem předkládané práce bylo sledovat průběh vstřebávání vícenenasycených mastných kyselin (PUFA) řady n-3 do membrán erytrocytů. Skupině 6 osob (3 muži, 3 ženy) byl podáván preparát MaxiCor po dobu 35-ti dnů v dávce 1,5 g/den. Z odebrané venosní krve byly separovány erytrocyty, ze kterých byl po extrakci celkového lipidu separován fosfatidylcholin a sfingomyelin preparativní tenkovrstevnou chromatografií. Po převedení na methylestery byl stanoven profil mastných kyselin kapilární plynovou chromatografií s plamenoionizační detekcí. Podávaný preparát obsahoval kyselinu eikosapentaenovou (EPA) a dokosahexaenovou (DHA) v poměru 3,4:1. Ke zvýšení obsahu PUFA n-3 ve fosfatidylcholinu erytrocytů došlo přibližně po prvním týdnů suplementace, po dobu užívání pak byla jejich koncentrace stabilní. K opětnému poklesu došlo přibližně po 2-3 týdnech po vysazení preparátu. Rozdíl jednotlivých koncentrací i jejich časový průběh byl individuální a závisel na počátečních hodnotách koncentrací EPA a DHA. U osoby s nízkou bazální hladinou obou kyselin se poměr DHA:EPA podáváním preparátu prakticky nezměnil, zatímco u osob se střední a vyšší koncentrací těchto kyselin se výrazně snížil, tj. došlo k reflexi vyššího obsahu EPA v suplementu. U sfingomyelinu ke změnám v koncentracích PUFA n-3 prakticky nedocházelo. Užívání preparátu MaxiCor mělo pozitivní účinek na složení mastných kyselin v membránách erytrocytů, na hodnoty aterogenního a trombogenního indexu.i na koncentrace krevních lipidů. Klíčová slova: PUFA n-3, chromatografie na tenké vrstvě, plynová chromatografie, membrána erytrocytů

ABSTRACT Markéta Zámečníková The speed of Incorporation PUFA n-3 in Erytrocyte membranes after their Suplementation Vyšší odborná škola zdravotnická a Střední zdravotnická škola, Praha 1, Alšovo nábřeží 6 Vedoucí práce: Mgr. Barbora Staňková Absolventská práce, Praha: VOŠZ a SZŠ, 2013, 58 stran Human organism needs for its correct function a well-balanced diet. Nowadays, people are permanently exposed to stress and to incorrect dietary habit. This can result in serious civilization diseases. Lack of important components in food is often substituted by dietary supplement. My presented thesis is focused on the course of incorporation of polyunsaturated fatty acids n-3 family into erythrocyte membranes. Group of 6 persons (3M/3F) received dietary supplement MaxiCor in a daily dose 1,5 g for 35 days. Erythrocytes were separated from venous blood; after the extraction of total lipid, phosphatidylcholine and sphingomyeline were separated by preparative thin layer chromatography. Separated phospholipids were transmethylated and fatty acid profile was determined by capillary gas chromatography with flame-ionization detection. Supplement contained eicosapentaenoic (EPA) and docosahexaenoic (DHA) acids in a ratio 3.4:1. Raised content of polyunsaturated fatty acids (PUFA) n-3 family in phosphatidylcholine was found after the first week of supplementation, during the supplementation their content was stable. Repeated decrease was observed approximately 2-3 weeks after its discontinuation. Differences in individual concentrations as well as their time-course were individual, and were dependent on the basal concentrations of EPA and DHA. Supplementation did not change the EPA/DHA ratio in the person with their low basal concentrations, while in persons with middle or high concentrations this ratio became significantly lower, probably due to higher EPA content in the supplement. No apparent changes in PUFA n-3 concentrations were observed in sphingomyeline. Supplementation with MaxiCor revealed beneficial effect on the profile of fatty acids in erythrocyte membranes, on the values of atherogenic and thrombogenic indexes, as well as on blood lipid concentrations.

Keywords: PUFA n-3, Thin layer chromatography, gas chromatography, erythrocyte membrane

Obsah 1 Úvod... 8 2 Literární přehled... 9 2.1 Mastné kyseliny... 9 2.1.1 Rozdělení mastných kyselin podle struktury... 10 2.1.2 Fyziologická úloha mastných kyselin... 12 2.2 Polynenasycené mastné kyseliny řady n-3... 13 2.2.1 Zdroje PUFA n-3... 14 2.2.2 Zdravotní účinky PUFA n-3... 14 2.3 Fosfolipidy... 16 2.4 Membrána erytrocytu... 17 2.4.1 Vliv PUFA n-3 na buněčnou membránu... 18 2.5 Chromatografie na tenké vrstvě... 18 2.6 Plynová chromatografie s plamenoionizační detekcí)... 19 3 Metody... 21 3.1 Použité chemikálie... 21 3.2 Použité přístroje... 21 3.2.1 Použitý doplněk stravy... 22 Zkratky: FA - fosfolipid... 22 3.2.2 Použité standardy... 22 3.3 Odběrové schéma... 23 3.3.1 Zpracování odebrané krve... 25 3.3.2 Stanovení biochemických parametrů plazmy... 25 3.3.3 Extrakce lipidové frakce z erytrocytů... 25 3.3.4 Příprava desek... 26 3.3.5 Separace fosfolipidů metodou TLC... 26 3.3.6 Transesterifikace lipidových tříd... 27 3.4 Analýza metylesterů mastných kyselin plynovou chromatografií... 27 4 Výsledky... 29 4.1 Biochemické vyšetření séra... 29 4.2 Stanovení mastných kyselin ve fosfatidylcholinu... 29 5 Diskuze... 43 6 Závěr... 45

7 Seznam obrázků a tabulek... 46 8 Seznam použité literatury a zdrojů informací... 49 9 Přílohy... 52

1 Úvod Tuky mají v organismu celou řadu významných úloh. Jejich funkce je např. mechanická ochrana orgánů, jsou zdrojem energie pro metabolizmus buněk, jsou důležité pro správnou funkci buněčných membrán, pro tvorbu některých hormonů (např. steroidních) a žlučových kyselin. Jsou nositeli některých důležitých látek, jako jsou např. vitaminy rozpustné v tucích (A, D, E, K), steroly a další. Zdrojem tuků jsou potraviny jak živočišného původu, tak i rostlinného. Nejdůležitější složkou tuků jsou mastné kyseliny (FA), které se podle své chemické struktury dělí na nasycené a nenasycené, některé z nich jsou esenciální (1). Mnoho lidí má obavy z vyššího příjmu tuků a tudíž obezity v důsledku vysoké kalorické hodnoty tuků a má snahu tento příjem minimalizovat. 1g tuku obsahuje energii ve dvojnásobném množství než u bílkovin. Optimální množství tuků by mělo tvořit 30% z celkové přijaté energie za den (2). Odborníci se shodují, že velmi záleží na kvalitě přijímaných tuků, z hlediska složení FA jsou nejvhodnější mořské ryby a rostlinné oleje. Obecným trendem je snižovat ve stravě příjem živočišných tuků a zvyšovat podíl rostlinných tuků a produktů z nich vyrobených. Preferuje se olej olivový a řepkový (nejlépe bez tepelné úpravy), protože má optimální zastoupení mastných kyselin. Člověk by měl omezit konzumaci živočišných potravin s vysokým obsahem tuku, ale také lahůdkářské výrobky, cukrářské výrobky, trvanlivé a jemné pečivo. K jejich výrobě se velmi často používá kokosový a palmojádrový tuk, který má naprosto nevhodné složení mastných kyselin (3). Cílem mé práce bylo sledovat rychlost průniku PUFA n-3 do membrán erytrocytů, po suplementaci preparátem MaxiCor u šesti dobrovolníků různého pohlaví a věku. 8

2 Literární přehled 2.1 Mastné kyseliny Mastné kyseliny, které mají v živých organismech řadu úloh, jsou strukturní součástí lipidů. Lipidy spolu s bílkovinami a sacharidy jsou základními stavebními kameny živé hmoty. Jako součást fosfolipidů tvoří mastné kyseliny základní strukturu všech buněčných membrán, v triacylglycerolech představují významný zdroj energie; v tukové tkáni slouží jako zásoba energie i tepelná izolace. V tukové tkáni mohou být mastné kyseliny skladovány v téměř neomezeném množství, což pozorujeme např. u obézních jedinců nebo u některých savců, kteří se připravují na zimní spánek (4,5). Mastné kyseliny můžeme rozdělit do několika skupin podle jejich struktury, biologických účinků a podle jejich fyziologické úlohy. Dále se od sebe liší délkou řetězce, množstvím a polohou dvojných vazeb. Obrázek 1 Strukturní vzorce mastných kyselin dle (4) Δn poloha dvojné vazby od karboxylové skupiny, X číslování uhlíkového řetězce od metylového konce 9

2.1.1 Rozdělení mastných kyselin podle struktury Nasycené mastné kyseliny mají plný počet vodíkových atomů a jsou rozdělovány do několika skupin podle délky uhlíkového řetězce (4,5). dlouhé uhlovodíkové řetězce karboxylová skupina Obrázek 2 Vzorec mastné kyseliny (kyselina stearová) dle (6) Mastné kyseliny s krátkým řetězcem (SCFA) vznikají během fermentace vlákniny v proximální části tlustého střeva. Jsou rychle resorbovány portální cirkulací, transportovány do jater a zde metabolizovány na glukózu. Tyto kyseliny podporují ve střevě absorpci sodíku, chloridů, bikarbonátů a vody, zvyšují krevní průtok tlustým střevem, stimulují produkci hlenu a také autonomní nervový systém ve střevě. Dále podporují produkci gastrointestinálních hormonů (gastrin, enteroglukagon) a snižují aciditu obsahu tlustého střeva (omezení růstu saprofytických bakterií i hnilobný rozklad). Mastné kyseliny se středním řetězcem (MCFA) jsou přímo resorbovány a transportovány portální žilou. Emulze obsahující TAG a MCFA jsou využívány jako nutriční podpora a potlačují pokles klidového energetického výdeje během kalorické restrikce. Používají se při redukčních dietách při léčbě obezity. Mastné kyseliny s dlouhým řetězcem (LCFA) mají významný aterogenní a trombogenní potenciál a představují 80-90% celkových nasycených mastných kyselin přijatých potravou. Mononenasycené mastné kyseliny (MUFA) řetězec obsahuje pouze jednu dvojnou vazbu a tak jsou tyto kyseliny rozlišovány podle konfigurace této vazby. 10

Obrázek 3 Vzorec mononenasycené mastné kyseliny (kyselina olejová) dle (6) cis konfigurace majoritním zástupcem je kys. olejová v dietě má antiaterogenní a antitrombotický účinek. Dalšími MUFA jsou kyseliny palmitolejová a vakcenová. Za zmínku stojí kyselina eruková, u které byla diskutována kardiotoxicita, a dále kyseliny cetolová a gadolová. trans konfigurace jejich aterogenní účinek je vyšší než u nasycených mastných kyselin. Hlavními zástupci jsou kyseliny eladiová a trans-vakcenová. Polynenasycené mastné kyseliny (PUFA) řetězec obsahuje dvě a více dvojných vazeb v molekule. Endogenní PUFA jsou řady n-9 a organismem jsou syntetizovány při nedostatku esenciálních mastných kyselin. PUFA řady n-3 a n-6 mají výrazný antiaterogenní a antitrombotický účinek a jsou výhradně exogenního původu (4,5). Obrázek 4 Vzorce polynenasycených mastných kyselin (EPA a DHA) dle (7) 11

Polynenasycené mastné kyseliny řady n-6 hlavním zástupcem je kyselina linolová, jejími metabolickými produkty pak kyseliny γ-linolenová, dihomo-γ-linolenová a arachidonová. Polynenasycené mastné kyseliny řady n-3 - hlavním zástupcem je kyselina α-linolenová, jejími metabolickými produkty kyseliny eikosapentaenová (EPA) a dokosahexaenová (DHA). Tabulka 1 Důležité mastné kyseliny Vzorec x Systematický název Triviální název Zkratka 12:0 dodekanová laurová 14:0 tetradekanová myristová 16:0 hexadekanová palmitová PA 16:1n-7 cis-9-hexadecenová palmitolejová POA 18:0 oktadekanová stearová SA 18:1n-9 cis-9-oktadecenová olejová OA 18:1n-7 cis,cis-11-oktadecenová vakcenová 18:2n-6 cis,cis-9,12-oktadekadienová linolová LA 18:3n-6 cis,cis,cis-6,9,12-oktadekatrienová -linolenová GLA 18:3n-3 cis,cis,cis-9,12,15-oktadekatrienová -linolenová ALA 20:3n-6 cis,cis,cis-8,11,14-eikosatrienová dihomo- -linolenová DHGLA 20:4n-6 cis,cis,cis,cis-5,8,11,14- eikosatetraenová arachidonová AA 20:5n-3 cis,cis,cis,cis,cis-5,8,11,14,17- eikosapentaenová timnodonová EPA 22:5n-3 cis,cis,cis,cis,cis-7,10,13,16,19- dokosapentaenová DPA 22:6n-3 cis,cis,cis,cis,cis,cis-4,7,10,13,16,19- dokosahexaenová klupadonová DHA x/ číslo před dvojtečkou udává počet atomů uhlíku, za dvojtečkou počet dvojných vazeb; číslo za n značí umístění první dvojné vazby na atomu uhlíku počítáno od methylového (omega) konce mastné kyseliny 2.1.2 Fyziologická úloha mastných kyselin Mezi hlavní fyziologické úlohy mastných kyselin v organismu patří: Zdroj energie ve formě triacylglyceridů (TAG) jsou mastné kyseliny základním zdrojem metabolické energie. Mají více než dvojnásobnou kalorickou hodnotu oproti sacharidům. Triacylglyceroly mají hydrofobní charakter, který je užitečný pro transport i ukládání lipofilních molekul, které jsou pro organismus důležité. 12

Tepelné a mechanické izolátory subkutánní a viscerální tuk (tkáň s vysokým obsahem TAG) je pro organismus výborným tepelným a mechanickým izolátorem. Ceramidy, které obsahují mastné kyseliny s velmi dlouhým řetězcem, snižují propustnost kůže pro vodu. V nervové tkáni jsou axony obklopeny myelinovou vrstvou, která obsahuje téměř 80% lipidů (fosfolipidů, glykolipidů a cholesterolu). Axonem postupuje signál, který je tím rychlejší, čím silnější je myelinová vrstva. Buněčné membrány strukturními složkami všech membrán jsou mastné kyseliny ve formě fosfolipidů. Sílu, propustnost membrán a tím i jejich aktivitu ovlivňuje složení mastných kyselin. Cholesterol a specifické proteiny zvyšují pevnost membrán, počet dvojných vazeb zvyšuje jejich fluiditu. Prekurzory eikosanoidů kyseliny arachidonová a eikosapentaenová jsou prekurzory prostaglandinů, tromboxanů a leukotrienů, které hrají v organismu důležitou úlohu (4). 2.2 Polynenasycené mastné kyseliny řady n-3 Polynenasycené mastné kyseliny řady n-3 (PUFA n-3) mají uhlovodíkový řetězec s 18-22 atomy uhlíku, vyznačují se první dvojnou vazbou na třetím uhlíku počítáno od methylového konce. V mnoha studiích byl potvrzen jejich vliv na: zvýšení produkce HDL cholesterolu na úkor LDL cholesterolu snížení triacylglycerolové frakce v krevním séru snížení krevního tlaku omezení zánětlivých onemocnění omezení rizika vzniku infarktu myokardu, aterosklerózy, roztroušené sklerózy, rakoviny, mrtvice atd. posílení funkce mozku a nervové soustavy, především v prenatálním vývoji (8,9,10). V těle jsou PUFA n-3 nepostradatelné jako složky buněčných membrán; prostaglandiny vzniklé z PUFA n-3 mají protizánětlivé účinky a zasahují do regulace vasodilatace, vasokonstrikce či chemotaxe. Kyseliny EPA a DHA, jejichž zdrojem jsou mořské ryby, patří mezi biologicky nejvýznamnější PUFA n-3 s dlouhým řetězcem. 13

2.2.1 Zdroje PUFA n-3 U grónských Eskymáků, kteří konzumovali velké množství tučných ryb, byl v 70. letech pozorován nízký výskyt trombóz a infarktu myokardu. Tento jev bylo obtížné vysvětlit. Později se zjistilo, že eskymácká potrava obsahovala složku, která měla za následek mizivé procento výskytu výše jmenovaných onemocnění. Bylo zjištěno, že ryby jsou bohaté na tuky omega 3 (PUFA n-3) (11). Od objevu této mastné kyseliny v mořských rybách bylo provedeno již mnoho studií, které stále více prokazovaly pozitivní vliv organismus. Živočišné zdroje tučné ryby (sardinky, tuňák, losos, sleď, makrela, pstruh, ančovičky) olej z tresčích jater (také vysoký obsah vitaminu A a D) mořské plody (ústřice, langusty, mušle, krabi) Rostlinné zdroje sojový lecitin lněný olej řepkový olej 2.2.2 Zdravotní účinky PUFA n-3 Dnes již nelze vyvrátit prokázané příznivé účinky PUFA n-3 na lidský organismus. Už v prenatálním stádiu začíná působení této kyseliny v neurogenezi ovlivňovat celkový vývoj plodu. V dřívějších dobách lidé trpěli různými onemocněními, jejichž vznik si nedokázali vysvětlit a už tehdy šlo o projevy nedostatku PUFA n-3. Byly to např. poruchy růstu, kožní projevy, kardiovaskulární onemocnění, sterilita, poruchy vidění a mnoho dalších (5). Jak bylo prokázáno v pokusech na myších, přídavek koncentrátu EPA/DHA z rybího oleje do vysokotukové diety, zabránil rozvoji obezity a inzulínové rezistence. Výsledky studie dokumentovaly, že příjem diety obohacené o PUFA n-3 z mořských ryb, indukoval tvorbu a přestavbu mitochondrií v bílém tuku a zvýšil tak oxidační kapacitu tkáně. Bylo také prokázáno, že EPA a DHA specificky indukují expresi a sekreci adiponektinu (tkáňového 14

hormonu zvyšujícího citlivost k inzulínu). V humánních studiích bylo prokázáno, že při náhradě 15% tuku v dietě koncentrátem EPA/DHA se výrazně snížila akumulace tuku a zvýšila se citlivost na inzulín (12). PUFA n-3 se akumulují v tukové tkáni, kde stoupá oxidace mastných kyselin a klesá lipogeneze (syntéza mastných kyselin a jejich esterifikace s glycerolem za vzniku triacylglycerolů při nadbytku glukózy v potravě). Tím se snižuje riziko vyššího krevního tlaku, obezity a inzulinorezistence, tedy hlavních faktorů MS u lidí (13). V dnešní době, kdy bylo zaznamenáno mnoho studií, je jednoznačně prokázán pozitivní vliv PUFA n-3 na lidský organismus. Jde především o prevenci kardiovaskulárních onemocnění, jako je angina pectoris, infarkt myokardu, cévní mozkové příhody a další. Vyšší příjem PUFA n-3 pravděpodobně také snižuje riziko nádorových onemocnění. Jedním z mechanismů je stimulace apoptózy tumorů působením DHA, dalším např. indukce izoforem proteinové kinasy C, které potlačují růst nádorových buněk. Účinek se projevil u karcinomu prsu, prostaty, plic, slinivky atlustého střeva (23). Antiaterogenní a antitrombogenní potenciál PUFA n-3 se projeví snížením aterogenního (AI) a trombogenního (TI) indexu. Aterogenní a trombogenní indexy ukazují následující vzorce: AI = (12:0+4x 14:0 + 16:0)x(PUFA n-3+mufa) -1 TI = (14:0+16:0+18:0)x(0,5xMUFA+0,5xPUFAn-6+3xPUFAn-3+PUFAn-3/PUFAn-6) -1 2.2.2.1 Karence PUFA PUFA n-3 mají pozitivní vliv na fluiditu membrán v CNS (zlepšení funkce receptorů a enzymů). Nedostatek PUFA n-3 negativně ovlivňuje transmisi vzruchu v mozkové tkáni a to zejména přenos serotonergní a dopaminergní a nerovnováhu mezi dopaminergními cestami (14). U schizofrenie, jedné ze závažných psychických poruch, je jednou z příčin vzniku choroby pravděpodobně snížení množství membránových fosfolipidů, které obsahují PUFA, kde jsou zakotveny receptory pro neurotransmitery. Díky sníženému množství dochází ke zhoršení receptorových vazebných funkcí (15). 15

Deprese, která má širokou škálu příznaků, je závažná porucha spojená se změnami emočních a psychomotorických procesů. U pacientů s depresí byl zaznamenán pokles PUFA n-3 v buněčných membránách a byly prokázány změny ve složení mastných kyselin v plazmě. Na udržení dobré nálady se podílejí právě nenasycené mastné kyseliny a to několika mechanismy. Výskyt poporodních depresí je také spojován se snížením obsahu PUFA n-3 (16). Za zmínku také stojí bipolární afektivní porucha, kdy se kromě fází deprese, kde je nedostatek PUFA n-3 zjevný, vyskytují i fáze manie. U pacientů, kteří užívali rybí tuk, došlo během 30 dnů k signifikantnímu snížení relapsů choroby. Došlo ke zlepšení příznaků deprese, nikoli manie (17). U pacientů s Alzheimerovou chorobou byl zjištěn snížený obsah DHA v plasmatickém fosfatidylcholinu (18). Rotterdamská studie ukazuje, že pravidelný příjem nenasycených mastných kyselin je dobrou prevencí vzniku Parkinsonovy choroby (19). Pozitivní efekt PUFA n-3 je v oblasti neurologické a psychiatrické jednoznačně prokázán. Pozitivní dopad spočívá ve zvýšené tvorbě myelinu nebo souvisí s protizánětlivým působením této nenasycené mastné kyseliny. 2.3 Fosfolipidy Fosfolipidy jsou součástí buněčných membrán a jsou typickým představitelem polárních lipidů. Molekula fosfolipidu je tvořena čtyřmi částmi: mastnou kyselinou, bazí (glycerol, sfingosin), fosfátem a další funkční skupinou (etanolamin, cholin, serin, inositol), která je na fosfát navázán. Hydrofobní bariéru nepolárního fosfolipidu poskytuje mastná kyselina. Hydrofilní vlastnosti umožňující interakci s prostředím zajišťuje zbytek molekuly (1). Významným zástupcem této skupiny polárních fosfolipidů je fosfatidylcholin (PC). Je to nejrozšířenější fosfolipid, který snižuje rigiditu buněčných membrán a představuje velkou část zásoby cholinu v organismu. Ten je důležitý pro přenos nervového vzruchu. Jeho C 2 je obsazen nenasycenou mastnou kyselinou a na C 1 je připojena nasycená mastná kyselina. Jeho 16

další významnou funkcí je přísun mastných kyselin pro esterifikaci plazmatického cholesterolu. Dalším zástupcem skupiny polárních fosfolipidů je sfingomyelin (SM). Je to ester aminoalkoholu sfingosinu s mastnou kyselinou a fosforylcholinem. Nachází se v membránách nervových buněk, především v myelinových pochvách v mozku a nervové tkáni. Kromě negativního náboje z fosfátového zbytku, nesou některé fosfolipidy i další náboje. Příkladem je fosfatidyletanolamin (PE), u kterého vykazuje atom dusíku aminoalkoholu pozitivní náboj. Pokud bereme fosfatidylcholin a fosfatidyletanolamin jako celek, pak se tyto dva fosfatidy jeví jako neutrální. Většina fosfolipidů je endogenního původu. Jejich syntéza probíhá prakticky ve všech tkáních, především v játrech na endoplasmatickém retikulu. Fosfatidylcholin, jako dominantní fosfolipid krevních lipoproteinů je syntetizován v hepatocytech. 2.4 Membrána erytrocytu Membrána erytrocytu je tvořena proteiny (50%), lipidy (40%) a sacharidy (10%). Základem membrány je dvojvrstva fosfolipidů. Horní část molekuly lipidů obsahuje fosfátovou složku, která má pozitivní náboj a je dobře rozpustná ve vodě. Polární část je tedy hydrofilní. Spodní část molekuly je tvořena dvěma řetězci mastných kyselin a ty jsou ve vodě nerozpustné, nepolární, tedy hydrofobní. Fosfatidylcholin (PC) a sfingomyelin (SM) spolu s glykolipidy jsou obsaženy na zevním povrchu buňky. Na vnitřním povrchu je hlavně fosfatidyletanolamin (PE), fosfatidylinositol a fosfatidylserin. Cholesterol, který je v obou částech membrány rozložen rovnoměrně, se mění v závislosti na plazmatické koncentraci, žlučových kyselinách a aktivitě některých enzymů (20,21). Hlavní funkcí membrány erytrocytu je: udržení tvaru a deformability buňky transport iontů a plynů podpůrný skeletální systém pro povrchové antigeny 17

. Obrázek 5 Stavba buněčné membrány dle (22) 2.4.1 Vliv PUFA n-3 na buněčnou membránu Po inkorporaci jsou nenasycené mastné kyseliny schopny měnit strukturu membrán (např. tloušťku) a fyzikálně-chemické vlastnosti membrán (např. fluiditu). Díky těmto schopnostem mohou následně ovlivnit strukturu i funkci proteinových struktur (enzymy, iontové kanály, transportéry, signální funkce). V mnoha studiích byl prokázán příznivý účinek PUFA n-3 na CNS. V mozku ovlivňují fluiditu buněčných membrán, vzájemné působení mezi lipidovými a proteinovými složkami membrán, dále ovlivňují funkci transportérů, receptorů a různých enzymů. Hlavní mechanismus působení je ovlivnění vlastností membrán neuronů a složek v nich obsažených. Fosfolipáza A 2 svým působením uvolňuje z fosfolipidů kyseliny EPA a DHA. Působením dalších enzymů jsou přeměňovány na metabolity, které působí protizánětlivě a snadno procházejí membránami neuronů (23). 2.5 Chromatografie na tenké vrstvě Vzhledem k nenáročnosti přístrojového vybavení, je chromatografie na tenké vrstvě (TLC) stále využívanou analytickou technikou. Jako stacionární fáze se využívá papír nebo tenká vrstva silikagelu, mobilní fází je obvykle směs kapalin volená podle druhu separovaných 18

látek. (24) Jednou z možných aplikací je preparace lipidových tříd na vrstvě silikagelu. Mobilní fází pro dělení neutrálních lipidů se používá směsi uhlovodík (hexan, heptan), diethylether a organická kyselina (octová, mravenčí). Dělení polárních lipidů probíhá s mobilní fází chloroform-methanol-voda, případně ještě kyselina octová nebo amoniak. Detekce probíhá obvykle pod UV světlem, pokud silikagel obsahuje specifický indikátor; další možností je vizualizace rozdělených zón chemickou reakcí. Dělení fosfolipidů (dělení start čelo) Lysolecitin, sfingomyelin, fosfatidylcholin, fosfatidylserin, fosfatidylinositol, fosfatidyletanolamin, neutrální lipidy (+ kys. fosfatidová) 2.6 Plynová chromatografie s plamenoionizační detekcí) Plynová chromatografie je analytická a separační metoda, vhodná k analýze těkavých látek. Plynovou chromatografii dále dělíme podle stacionární fáze na adsorpční (stacionární fází je pevná látka) a rozdělovací (stacionární fází je kapalina). Největší výhodou této techniky je dokonale reprodukovatelná a ekologická mobilní fáze plyn. Další výhodou je i účinná separace a potřeba minimálního množství analyzované látky (24,25). Obrázek 6 Schéma plynového chromatografu dle (25) 19

Princip plynové rozdělovací chromatografie (GLC) je založen na postupném utváření rovnováhy analyzovaných látek (na základě rozdělovacích koeficientů) mezi plynem a kapalinou, kdy dochází k rozpuštění látky v obou fázích. Stacionární fází je kapilární kolona většinou s chemicky zakotvenou fází různé polarity (podle charakteru dělených látek). Kapalná fáze, která je v koloně ukotvena, musí mít nízkou tenzi par a být chemicky stabilní i při vysoké teplotě. Polyethylenglykoly, polyestery nebo polysiloxany jsou nejčastěji používané stacionární fáze pro GLC. Mobilní fází je u GLC nosný plyn, nejčastěji dusík, helium nebo vodík. Viskozita, účinnost, čistota a reaktivita jsou faktory, které rozhodují při výběru nosného plynu. Optimalizace průtoku mobilní fáze rozhoduje o kvalitě rozdělení analyzovaných látek. Látka je do plynového chromatografu nastřikována speciální stříkačkou do injektoru. Ve skleněné vložce injektoru dochází působením vysoké teploty k odpaření vzorku a tím k promíchání jeho par s nosným plynem. Dělič toku, který je umístěn mezi injektorem a kolonou, vede jen část odpařeného vzorku do kolony. Kolona (náplňová nebo kapilární) obsahuje adsorbent nebo nosič se zakotvenou kapalnou fází, je umístěna v termostatu, kde je temperována na požadovanou teplotu. Analýza probíhá buď izokraticky nebo s teplotním gradientem; toho se využívá pro stanovení směsí látek s rozdílnými body varu. Princip plamenově ionizačního detektoru (FID): vodíkový plamen hoří v prostoru sběrné elektrody a je snímána jeho vodivost; při průchodu vzorku se vodivost prostoru zvýší úměrně procházejícímu množství analyzované látky. Tento detektor je schopen detekce téměř všech organických látek v širokém rozmezí koncentrací. Konečnou fází je záznam analýzy, který se nazývá chromatogram. Je to grafické znázornění závislosti napěťové odezvy detektoru na čase. 20

3 Metody 3.1 Použité chemikálie Metanol pro HPLC G (Chromservis, ČR) Dichlormetan pro HPLC G (Chromservis, ČR) Chloroform pro HPLC, Chromapur G (Chromservis, ČR) n heptan 95+ pro HPLC, Chromapur G (Chromservis, ČR) n hexan pro HPLC, Chromapur G (Chromservis, ČR) Silikagel (Kieselgel 60PF 254+366, Merck, Německo) Voda přírodní minerální voda značky DOBRÁ VODA, testovaná na přítomnost FA Síran sodný bezvodý (Lachema, ČR) Kyselina octová ledová p.a. (Lachema, ČR) Fyziologický roztok (Lachema, ČR) 3.2 Použité přístroje Centrifuga: HERAEUS MEGAFUGE 16R (Thermo SCIENTIFIC, Německo) Termostatovaný inkubátor vzorků: TERMOVAP TV 10+ ( ECOM, ČR) Míchačka: Lab Dancer vario (IKA, Německo) GC 17A včetně PC (SHIMADZU, Japonsko) Třepačka: MTS 2/4 (IKA, Německo) Sušárna: POL-EKO APARATURA (EU) Biochemický automatický analyzátor MODULAR (ROCHE, Švýsarsko) UV lampa 360nm (Instala, ČR) 21

3.2.1 Použitý doplněk stravy MaxiCor (SVUS Pharma a.s., Česká republika), směs ethylesterů mastných kyselin (Tabulka 2). Tabulka 2 Složení mastných kyselin v použitém dietním suplementu FA mol % FA mol % 12:0 0,00 20:1n-9 0,20 14:0 0,05 20:2n-6cc 0,03 14:1n-5 0,00 20:3n-6alc 0,11 16:0 0,30 20:4n-6alc 2,94 16:1n-9 0,02 20:5n-3alc 71,02 16:1n-7c 0,12 22:4n-6alc 0,04 18:0 0,10 22:5n-6 0,51 18:1n-9c 0,43 22:5n-3alc 1,36 18:1n-7c 0,15 22:6n-3alc 20,88 18:2n-6cc 0,43 ƩSFA 0,81 18:3n-6alc 0,71 ƩMUFA 0,92 18:3n-3alc 0,25 ƩPUFA n-6 4,76 20:0 0,36 ƩPUFA n-3 93,51 Zkratky: FA - fosfolipid 3.2.2 Použité standardy L- α-fosfatidylcholin (Sigma Chemical, St. Louis, Montana, U.S.A.) Sfingomyelin (Sigma Chemical, St. Louis, Montana, U.S.A.) 22

Tabulka 3 Použité standardy metylesterů mastných kyselin Systematický název kyseliny Triviální název 12:0 kys. cis-dodekanová laurová 14:0 kys. tetradekanová myristová 14:1n-5 kys. cis-5-tetradecenová myristoolejová 16:0 kys. hexadekanová palmitová 16:1n-9 kys. cis-7-hexadecenová 16:1n-7 kys. cis-9-hexadecenová palmitolejová 18:0 kys. oktadekanová stearová 18:1n-9 kys. cis-9-oktadecenová olejová 18:1n-7 kys. cis-11-oktadecenová vakcenová 18:2n-6 kys. cis,cis-9,12-oktadekadienová linolová 18:3n-6 kys. cis,cis,cis-6,9,12-oktadekatrienová γ-linolenová 18:3n-3 kys. cis,cis,cis-9,12,15-oktadekatrienová α-linolenová 20:0 kys. eikosanová arachidonová 20:1n-9 kys. cis-11-eikosenová gondoová 20:2n-6 kys. cis,cis-11,14-eikosadienová 20:3n-6 kys. cis,cis,cis-8,11,14-eikosatrienová dihomo- γ-linolenová 20:4n-6 kys. cis,cis cis,cis-5,8,11,14-eikosatetraenová arachidonová 20:5n-3 kys. cis,cis,cis,cis,cis-5,8,11,14,17-eikosapentaenová timnodonová (EPA) 22:4n-6 kys. cis,cis,cis,cis-7,10,13,16-dokosatetraenová adrenová 22:5n-6 kys. cis,cis,cis,cis,cis-4,7,10,13,16-dokosapentaenová 22:5n-3 kys. cis,cis,cis,cis,cis-7,10,13,16,19-dokosapentaenová 22:6n-3 kys. cis,cis,cis,cis,cis,cis-4,7,10,13,16,19-dokosahexaenová klupadonová (DHA) 3.3 Odběrové schéma Ve studii bylo monitorováno 6 osob, různého věku a pohlaví. Osoby užívaly doplněk stravy MaxiCor, a to 3 tobolky (každá 500mg oleje, z toho min. 450mg PUFA n-3) denně po dobu 35-ti dnů dle uvedeného schématu v Tabulce 4 na straně 24, kde římská číslice I. VI. jsou testované osoby. 23

Tabulka 4 Odběrové schéma týden číslo odběru datum čas n-3 I II. III. IV. V. VI. 0 1 8.10. 8:00 odběr na biochemické vyšetření č. 1 2 10:00 ano 3 12:00 ano 4 14:00 ano 5 16:00 ano 6 9.10. ano 7 10.10. ano 8 11.10. ano 9 12.10. ano 1 10 15.10. ano 2 11 22.10. ano 3 12 29.10. ano 4 13 5.11. ano 5 14 12.11. ano odběr na biochemické vyšetření č. 2 6 15 19.11. ne 7 16 26.11. ne 8 17 3.12. ne 9 18 10.12. ne 10 19 17.12. ne odběr na biochemické vyšetření č. 3 Zkratky: n-3 podávaný suplement MaxiCor, římská číslice I. VI. testované osoby V pravidelných časových intervalech byla osobám odebírána venózní krev do zkumavky s EDTA pro separaci erytrocytů a do zkumavky se separačním gelem pro oddělení séra. Před začátkem suplementace, bezprostředně a 5 týdnů po jejím skončení byl také u každé osoby odebrán vzorek séra, pro stanovení koncentrací lipidů. 24

3.3.1 Zpracování odebrané krve Po odběru se odebraná krev nechala vytemperovat na laboratorní teplotu (cca 30 min) a poté se stočila v centrifuze (2000 RPM po dobu 10 min). Po centrifugaci se 1 ml separovaných erytrocytů 3x promyl 10 ml fyziologického roztoku (3500 RPM, 5 min). Promyté krvinky se přenesly pipetou do kryozkumavek a uložily do mrazícího boxu (-80 C). 3.3.2 Stanovení biochemických parametrů plazmy Koncentrace triacylglycerolů (TAG), celkového cholesterolu (TC), HDL- cholesterolu (HDL-C) v séru byly stanoveny na biochemickém automatickém analyzátoru MODULAR, koncentrace apolipoproteinu B (ApoB) na proteinovém analyzátoru Immage v laboratořích Ústavu lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky VFN a 1. LF UK Praha. Hladina TAG byla stanovena spektrofotometricky enzymatickým kolorimetrickým testem GPO-PAP, hladiny TC a HDL-C byly stanoveny enzymatickou metodou CHOD-PAP. Koncentrace ApoB byla stanovena diagnostickým setem s nefelometrickou detekcí. 3.3.3 Extrakce lipidové frakce z erytrocytů Lipidová frakce z erytrocytů byla separována metodou dle Folche modifikovaná Carlsonem (26,27). Rozmrazený 1 ml erytrocytů se smísil s 0,5 ml destilované vody a tato směs byla uložena do mechanické třepačky po dobu 10 min. Po uplynutí stanovené doby bylo ke směsi přidáno 5 ml metanolu (CH 3 OH). Směs byla opět uložena do třepačky na dobu 20 min. Po vyjmutí z třepačky bylo do směsi přidáno 10 ml CH 2 Cl 2 a opět proběhlo míchání v třepačce po dobu 20 min. Poté byla tato směs přefiltrována a filtrát ve zkumavce byl extrahován s 3 ml H 2 O. Zkumavky byly krátce promíchány na třepačce a centrifugovány při 2500 RPM, při 4 C po dobu 10 min. Spodní organická vrstva byla přenesena do nové zkumavky a vysušena proudem dusíku při 40 C. Izolovaná lipidová frakce byla uložena při -20 C. 25

3.3.4 Příprava desek Na odmaštěné skleněné desky (20 x 20 cm) byla nanesena vrstva silikagelu (Kieselgel 60PF 254+366, Merck, Německo). Před nanášením vzorku byly desky vždy aktivovány v sušárně při 110 C po dobu 30 min. Vzorek byl poté nanášen v co nejkratší době, aby se zamezilo deaktivaci desek vzdušnou vlhkostí. 3.3.5 Separace fosfolipidů metodou TLC Izolovaný lipid byl rozpuštěn ve 150µl směsi hexan: metanol 1:2 (v/v, v ml) a naneseny na aktivovanou desku mikrostříkačkou Hamilton. Desky byly vloženy do chromatografické kyvety a vyvíjeny mobilní fází chloroform-metanol-voda (60:30:5 v/v/v) cca 45 min (čelo 1 cm pod horním okrajem). Poté byla deska usušena a rozdělené fosfolipidy byly detekovány pod UV lampou (λ = 366 nm). Označené zóny fosfatidylcholinu (PC) a sfingomyelinu (SM) byly vyškrábány a kvantitativně převedeny do zkumavek pro další zpracování.. čelo. PE. PI. PS. PC. SM. lyzo PC. start Obrázek 7 Rozmístění fosfolipidových frakcí po vizualizaci UV lampou 26

3.3.6 Transesterifikace lipidových tříd Pro stanovení relativního zastoupení mastných kyselin v jednotlivých lipidových třídách pomocí plynové chromatografie, je podmínkou těkavost vzorku. Je proto nutné převést mastné kyseliny na těkavé metylestery transesterifikací. Jednotlivé izolované vzorky PC byly inkubovány po přidání 1 ml 1M metanolátu sodného po dobu 60 min v temnu, při laboratorní teplotě. Vzorky SM byly po přidání 1 ml metanolátu inkubovány 20 min při 80 C. Ke každému vzorku (na 1 ml metanolátu sodného) byly přidány 2 ml 0,5N kyseliny octové a extrahovány 2 ml hexanu. Po centrifugaci (2000 RPM, 10 min) byla stažena horní, oddělená fáze mikrostříkačkou Hamilton do nové zkumavky přes kolonku se síranem sodným a poté odpařována pod proudem dusíku při teplotě 40 C. Po odpaření a uzavření zkumavek byly vzorky uchovány při -20 C. 3.4 Analýza metylesterů mastných kyselin plynovou chromatografií Přístroj: kapilární plynový chromatograf GC 17A spojený s automatickým dávkovačem AOC-20i (Shimadzu) vybavený injektorerm typu split/splitless a plamenoionizačním detektorem. Kolona: kapilární kolona s polární zakotvenou fází DB-23 (Agilent Technologies, Inc.), vnitřní průměr 0,25 mm, délka 60 m, síla zakotvené fáze 0,25 um. Teplota injektoru: 250 C Teplota detektoru: 260 C Teplotní program pro analýzu FA v PC: 80 C (1) 10 120 (0) - 4 180(0) 1 240(0) 10 250 Počáteční teplota 80 C izotermicky 1 min; gradient 10 C /min do teploty 120 C; další gradient 4 C/min do teploty 180 C; dále gradient 1 C/min do teploty 240 C; závěrečný gradient 10 C za minutu do teploty 250 C. 27

Teplotní program pro analýzu FA v SM: 80 C (1) 10 120 (0) - 4 180(0) 1 240(0) 10 255 (27) Počáteční teplota 80 C izotermicky 1 min; gradient 10 C /min do teploty 120 C; gradient 4 C/min do teploty 180 C; další gradient 1 C/min do teploty 240 C; poslední gradient 10 C/min do teploty 255 C a pak 27 minut izotermicky. Výpočet SEM: s - výběrová směrodatná odchylka n počet měření x i jsou hodnoty znaku aritmetický průměr hodnot 28

4 Výsledky Testované osoby byly rozděleny podle pohlaví, ze skupiny žen byla 1 osoba vyčleněna na základě extrémně nízkých bazálních koncentrací EPA a DHA. Ve výsledcích jsou jednotlivé skupiny označeny: A (1 žena s nízkou bazální koncentrací EPA a DHA), B (muži), C (ženy). 4.1 Biochemické vyšetření séra Všechny osoby měly srovnatelné koncentrace sérových lipidů během celého pokusu, jak ukazuje Tabulka 5. Tabulka 5 Koncentrace krevních lipidů Krevní lipidy odběr 1 SEM odběr 2 SEM odběr 3 SEM TC mmol/l 5,32 ± 0,33 5,04 ± 0,26 5,28 ± 0,25 TAG mmol/l 1,78 ± 0,01 1,07 ± 0,14 1,15 ± 0,15 HDL C mmol/l 1,87 ± 0,27 1,83 ± 0,25 1,92 ± 0,29 Apo B g/l 1,05 ± 0,02 0,87 ± 0,05 0,95 ± 0,01 Hodnoty jsou vyjádřeny jako průměr ± SEM. odběr 1 - lipidy v krevním séru před první aplikací dietního doplňku. odběr 2 - lipidy v krevním séru po ukončení aplikace dietního doplňku. odběr 3 - lipidy v krevním séru na konci studie. Zkratky: TC - celkový cholesterol, TAG - triacylglyceroly, HDL-C HDL-cholesterol, apo B apolipoprotein B. 4.2 Stanovení mastných kyselin ve fosfatidylcholinu Změny profilu mastných kyselin v průběhu pokusu ukazují Tabulky 6-8 na stranách 30-34 a Obrázky 8 11 na stranách 35 42. 29

Tabulka 6 Profil mastných kyselin v PC skupina A Zkratky: ƩSFA součet saturovaných mastných kyselin, ƩMUFA součet mononenasycených mastných kyselin, ƩPUFA součet vícenenasycených mastných kyselin. 30

Tabulka 7 Profil mastných kyselin v PC skupina B FA/čas 0 mol % 2 hod 4 hod 6 hod 8 hod 2. den 3. den 4. den 5. den 8. den 12:0 0,20 ± 0,016 0,16 ± 0,013 0,19 ± 0,016 0,13 ± 0,010 0,22 ± 0,018 0,15 ± 0,012 0,14 ± 0,011 0,11 ± 0,009 0,20 ± 0,016 0,16 ± 0,013 14:0 0,26 ± 0,021 0,10 ± 0,009 0,21 ± 0,017 0,27 ± 0,022 0,21 ± 0,017 0,22 ± 0,018 0,17 ± 0,014 0,15 ± 0,012 0,16 ± 0,013 0,09 ± 0,007 14:1n-5 0,01 ± 0,001 0,00 ± 0,000 0,00 ± 0,000 0,00 ± 0,000 0,01 ± 0,001 0,01 ± 0,000 0,00 ± 0,000 0,00 ± 0,000 0,00 ± 0,000 0,00 ± 0,000 16:0 38,94 ± 3,182 36,25 ± 2,962 37,51 ± 3,065 37,36 ± 3,053 38,76 ± 3,168 36,98 ± 3,023 35,83 ± 2,928 36,03 ± 2,945 32,47 ± 2,654 32,87 ± 2,686 16:1n-9 0,12 ± 0,010 0,09 ± 0,007 0,09 ± 0,008 0,13 ± 0,011 0,11 ± 0,009 0,11 ± 0,009 0,11 ± 0,009 0,08 ± 0,006 0,17 ± 0,014 0,10 ± 0,008 16:1n-7 0,31 ± 0,025 0,33 ± 0,027 0,32 ± 0,026 0,33 ± 0,027 0,38 ± 0,031 0,42 ± 0,034 0,37 ± 0,030 0,33 ± 0,027 0,33 ± 0,027 0,36 ± 0,029 18:0 14,03 ± 1,147 15,28 ± 1,249 14,77 ± 1,207 14,85 ± 1,214 14,14 ± 1,156 15,34 ± 1,254 14,94 ± 1,221 14,53 ± 1,187 16,26 ± 1,328 15,60 ± 1,275 18:1n-9 19,91 ± 1,627 22,16 ± 1,811 22,69 ± 1,854 22,39 ± 1,830 22,04 ± 1,801 20,37 ± 1,665 23,19 ± 1,895 22,63 ± 1,849 25,05 ± 2,047 24,07 ± 1,967 18:1n-7 2,30 ± 0,188 2,13 ± 0,174 2,15 ± 0,176 2,17 ± 0,178 2,11 ± 0,172 1,97 ± 0,161 2,26 ± 0,185 2,28 ± 0,186 2,04 ± 0,167 2,12 ± 0,174 18:2n-6 17,61 ± 1,439 17,65 ± 1,443 16,88 ± 1,380 16,70 ± 1,365 17,03 ± 1,392 17,73 ± 1,449 17,15 ± 1,402 17,53 ± 1,432 16,34 ± 1,336 17,37 ± 1,420 18:3n-6 0,06 ± 0,005 0,04 ± 0,003 0,03 ± 0,003 0,03 ± 0,002 0,04 ± 0,003 0,07 ± 0,006 0,03 ± 0,003 0,03 ± 0,002 0,05 ± 0,004 0,03 ± 0,003 18:3n-3 0,18 ± 0,015 0,16 ± 0,013 0,12 ± 0,010 0,09 ± 0,008 0,11 ± 0,009 0,12 ± 0,009 0,13 ± 0,011 0,14 ± 0,011 0,13 ± 0,011 0,12 ± 0,010 20:0 0,09 ± 0,017 0,11 ± 0,009 0,09 ± 0,013 0,15 ± 0,012 0,11 ± 0,009 0,13 ± 0,011 0,13 ± 0,014 0,09 ± 0,008 0,14 ± 0,011 0,11 ± 0,009 20:1n-9 0,27 ± 0,022 0,34 ± 0,028 0,30 ± 0,025 0,33 ± 0,027 0,31 ± 0,025 0,29 ± 0,024 0,31 ± 0,025 0,30 ± 0,024 0,32 ± 0,027 0,31 ± 0,025 20:2n-6 0,30 ± 0,058 0,32 ± 0,027 0,31 ± 0,043 0,31 ± 0,025 0,30 ± 0,036 0,32 ± 0,026 0,31 ± 0,034 0,32 ± 0,026 0,37 ± 0,024 0,32 ± 0,026 20:3n-6 1,64 ± 0,134 1,29 ± 0,105 1,06 ± 0,087 1,04 ± 0,085 1,05 ± 0,086 1,30 ± 0,106 1,21 ± 0,099 1,15 ± 0,094 1,31 ± 0,107 1,33 ± 0,108 20:4n-6 2,30 ± 0,188 2,27 ± 0,186 1,83 ± 0,150 2,00 ± 0,163 1,76 ± 0,144 2,37 ± 0,194 2,05 ± 0,167 2,24 ± 0,183 2,06 ± 0,168 2,39 ± 0,195 20:5n-3 0,24 ± 0,020 0,25 ± 0,019 0,27 ± 0,026 0,24 ± 0,017 0,22 ± 0,018 0,26 ± 0,017 0,23 ± 0,019 0,26 ± 0,020 0,34 ± 0,028 0,47 ± 0,033 22:4n-6 0,20 ± 0,016 0,07 ± 0,006 0,04 ± 0,003 0,06 ± 0,005 0,06 ± 0,005 0,28 ± 0,023 0,08 ± 0,006 0,11 ± 0,009 0,14 ± 0,012 0,14 ± 0,011 22:5n-6 0,10 ± 0,008 0,08 ± 0,006 0,21 ± 0,017 0,48 ± 0,040 0,07 ± 0,006 0,14 ± 0,011 0,04 ± 0,003 0,14 ± 0,011 0,20 ± 0,017 0,08 ± 0,007 22:5n-3 0,14 ± 0,012 0,09 ± 0,007 0,08 ± 0,007 0,09 ± 0,007 0,06 ± 0,005 0,16 ± 0,013 0,11 ± 0,009 0,09 ± 0,007 0,11 ± 0,009 0,12 ± 0,010 22:6n-3 0,79 ± 0,052 0,83 ± 0,068 0,83 ± 0,065 0,85 ± 0,069 0,89 ± 0,067 1,26 ± 0,103 1,22 ± 0,108 1,48 ± 0,112 1,80 ± 0,147 1,82 ± 0,119 ƩSFA 53,52 ± 4,374 51,90 ± 4,242 52,78 ± 4,313 52,77 ± 4,312 53,45 ± 4,368 52,82 ± 4,317 51,21 ± 4,185 50,91 ± 4,160 49,23 ± 4,023 48,84 ± 3,991 ƩMUFA 22,91 ± 1,872 25,06 ± 2,048 25,55 ± 2,088 25,35 ± 2,071 24,95 ± 2,039 23,16 ± 1,893 26,23 ± 2,144 25,61 ± 2,093 27,91 ± 2,281 26,96 ± 2,204 ƩPUFAn-6 22,21 ± 1,815 21,72 ± 1,775 20,36 ± 1,664 20,62 ± 1,685 20,31 ± 1,660 22,22 ± 1,816 20,87 ± 1,706 21,51 ± 1,758 20,48 ± 1,673 21,66 ± 1,770 ƩPUFAn-3 1,36 ± 0,111 1,32 ± 0,108 1,30 ± 0,107 1,27 ± 0,104 1,29 ± 0,106 1,80 ± 0,147 1,69 ± 0,138 1,97 ± 0,161 2,38 ± 0,195 2,54 ± 0,207 Hodnoty jsou vyjádřeny jako průměr ± SEM. Zkratky: ƩSFA součet saturovaných mastných kyselin, ƩMUFA součet mononenasycených mastných kyselin, ƩPUFA součet vícenenasycených mastných kyselin. 31

FA/čas 15. den 22. den 29. den 36. den 43. den 50. den 57. den 64. den mol % 12:0 0,18 ± 0,014 0,10 ± 0,008 0,14 ± 0,012 0,14 ± 0,012 0,18 ± 0,015 0,19 ± 0,016 0,15 ± 0,012 0,26 ± 0,021 0,14 ± 0,011 14:0 0,27 ± 0,022 0,22 ± 0,018 0,23 ± 0,019 0,19 ± 0,016 0,20 ± 0,017 0,26 ± 0,021 0,25 ± 0,021 0,31 ± 0,025 0,40 ± 0,032 14:1n-5 0,01 ± 0,001 0,00 ± 0,000 0,01 ± 0,000 0,00 ± 0,001 0,01 ± 0,001 0,01 ± 0,001 0,01 ± 0,000 0,01 ± 0,001 0,00 ± 0,000 16:0 30,94 ± 2,528 31,79 ± 2,598 30,82 ± 2,518 31,69 ± 2,590 32,38 ± 2,646 32,97 ± 2,694 33,70 ± 2,754 38,63 ± 3,157 39,67 ± 3,242 16:1n-9 0,10 ± 0,008 0,10 ± 0,008 0,09 ± 0,007 0,08 ± 0,007 0,10 ± 0,008 0,10 ± 0,008 0,11 ± 0,009 0,10 ± 0,008 0,31 ± 0,025 16:1n-7 0,41 ± 0,033 0,36 ± 0,029 0,36 ± 0,030 0,29 ± 0,024 0,34 ± 0,028 0,36 ± 0,029 0,39 ± 0,032 0,42 ± 0,034 0,44 ± 0,036 18:0 15,53 ± 1,269 16,70 ± 1,365 16,71 ± 1,366 16,68 ± 1,363 15,82 ± 1,293 15,84 ± 1,294 15,75 ± 1,287 14,46 ± 1,182 12,85 ± 1,050 18:1n-9 25,62 ± 2,094 24,87 ± 2,033 25,02 ± 2,045 24,89 ± 2,034 24,85 ± 2,031 24,43 ± 1,997 25,06 ± 2,048 21,78 ± 1,780 18,62 ± 1,522 18:1n-7 2,02 ± 0,165 2,12 ± 0,173 2,27 ± 0,185 2,18 ± 0,178 2,12 ± 0,173 2,13 ± 0,174 2,28 ± 0,186 2,12 ± 0,173 1,81 ± 0,148 18:2n-6 17,57 ± 1,436 16,98 ± 1,388 17,85 ± 1,459 17,30 ± 1,414 17,03 ± 1,392 16,85 ± 1,377 16,44 ± 1,343 16,76 ± 1,370 19,98 ± 1,633 18:3n-6 0,05 ± 0,004 0,03 ± 0,002 0,03 ± 0,002 0,03 ± 0,002 0,03 ± 0,003 0,04 ± 0,003 0,05 ± 0,004 0,05 ± 0,004 0,08 ± 0,007 18:3n-3 0,17 ± 0,014 0,09 ± 0,008 0,15 ± 0,012 0,14 ± 0,012 0,12 ± 0,010 0,13 ± 0,011 0,11 ± 0,009 0,11 ± 0,009 0,14 ± 0,012 20:0 0,10 ± 0,016 0,18 ± 0,014 0,10 ± 0,008 0,09 ± 0,007 0,11 ± 0,009 0,09 ± 0,011 0,07 ± 0,006 0,12 ± 0,010 0,13 ± 0,014 20:1n-9 0,28 ± 0,023 0,41 ± 0,034 0,33 ± 0,027 0,30 ± 0,024 0,35 ± 0,029 0,29 ± 0,023 0,33 ± 0,027 0,31 ± 0,026 0,37 ± 0,030 20:2n-6 0,30 ± 0,024 0,31 ± 0,025 0,25 ± 0,025 0,26 ± 0,021 0,27 ± 0,022 0,29 ± 0,055 0,23 ± 0,019 0,26 ± 0,021 0,33 ± 0,027 20:3n-6 1,10 ± 0,090 0,94 ± 0,077 1,05 ± 0,086 0,87 ± 0,071 0,94 ± 0,076 0,91 ± 0,074 0,96 ± 0,078 0,91 ± 0,074 0,96 ± 0,079 20:4n-6 2,43 ± 0,199 1,97 ± 0,161 1,66 ± 0,135 1,63 ± 0,133 2,07 ± 0,169 2,01 ± 0,165 1,87 ± 0,153 1,48 ± 0,121 1,80 ± 0,147 20:5n-3 0,81 ± 0,066 0,82 ± 0,089 0,82 ± 0,067 0,98 ± 0,080 0,97 ± 0,074 0,92 ± 0,082 0,59 ± 0,058 0,44 ± 0,036 0,42 ± 0,028 22:4n-6 0,07 ± 0,006 0,04 ± 0,003 0,05 ± 0,004 0,06 ± 0,005 0,07 ± 0,005 0,14 ± 0,011 0,17 ± 0,014 0,12 ± 0,010 0,25 ± 0,021 22:5n-6 0,07 ± 0,006 0,06 ± 0,005 0,13 ± 0,010 0,26 ± 0,021 0,06 ± 0,005 0,13 ± 0,011 0,08 ± 0,006 0,06 ± 0,005 0,12 ± 0,010 22:5n-3 0,08 ± 0,007 0,09 ± 0,007 0,08 ± 0,007 0,10 ± 0,008 0,10 ± 0,008 0,13 ± 0,011 0,14 ± 0,011 0,09 ± 0,007 0,15 ± 0,012 22:6n-3 1,88 ± 0,153 1,83 ± 0,189 1,85 ± 0,151 1,84 ± 0,107 1,87 ± 0,152 1,79 ± 0,146 1,28 ± 0,090 1,19 ± 0,097 1,03 ± 0,078 71. den ƩSFA 47,02 ± 3,843 48,98 ± 4,003 48,00 ± 3,923 48,79 ± 3,987 48,69 ± 3,979 49,35 ± 4,033 49,92 ± 4,080 53,79 ± 4,396 53,19 ± 4,347 ƩMUFA 28,44 ± 2,324 27,86 ± 2,277 28,07 ± 2,294 27,74 ± 2,267 27,78 ± 2,270 27,31 ± 2,232 28,17 ± 2,302 24,74 ± 2,022 21,55 ± 1,761 ƩPUFAn-6 21,60 ± 1,765 20,32 ± 1,661 21,02 ± 1,718 20,40 ± 1,667 20,47 ± 1,673 20,37 ± 1,664 19,78 ± 1,617 19,64 ± 1,605 23,52 ± 1,922 ƩPUFAn-3 2,95 ± 0,241 2,83 ± 0,231 2,90 ± 0,237 3,07 ± 0,251 3,06 ± 0,250 2,97 ± 0,243 2,12 ± 0,174 1,83 ± 0,150 1,74 ± 0,142 Tabulka 7 Profil mastných kyselin v PC skupina B (pokračování) Hodnoty jsou vyjádřeny jako průměr ± SEM. Zkratky: ƩSFA součet saturovaných mastných kyselin, ƩMUFA součet mononenasycených mastných kyselin, ƩPUFA součet vícenenasycených mastných kyselin. 32

FA/čas 0 2 hod 4 hod 6 hod 8 hod 2. den mol % 3. den 4. den 5. den 8. den 12:0 0,191 ± 0,016 0,145 ± 0,012 0,167 ± 0,014 0,185 ± 0,015 0,157 ± 0,013 0,189 ± 0,015 0,160 ± 0,013 0,967 ± 0,079 0,192 ± 0,016 0,146 ± 0,012 14:0 0,293 ± 0,024 0,188 ± 0,015 0,291 ± 0,024 0,213 ± 0,017 0,262 ± 0,021 0,255 ± 0,021 0,246 ± 0,020 0,277 ± 0,023 0,147 ± 0,012 0,218 ± 0,018 14:1n-5 0,007 ± 0,001 0,008 ± 0,001 0,015 ± 0,001 0,003 ± 0,000 0,040 ± 0,003 0,022 ± 0,002 0,002 ± 0,000 0,028 ± 0,002 0,006 ± 0,000 0,016 ± 0,001 16:0 36,432 ± 2,977 35,810 ± 2,927 34,819 ± 2,846 34,123 ± 2,789 36,242 ± 2,962 34,292 ± 2,803 34,695 ± 2,835 35,244 ± 2,880 32,192 ± 2,631 32,681 ± 2,671 16:1n-9 0,113 ± 0,009 0,115 ± 0,009 0,105 ± 0,009 0,110 ± 0,009 0,098 ± 0,008 0,114 ± 0,009 0,097 ± 0,008 0,063 ± 0,005 0,075 ± 0,006 0,112 ± 0,009 16:1n-7 0,506 ± 0,041 0,416 ± 0,034 0,428 ± 0,035 0,462 ± 0,038 0,497 ± 0,041 0,493 ± 0,040 0,396 ± 0,032 0,369 ± 0,030 0,285 ± 0,023 0,379 ± 0,031 18:0 14,273 ± 1,166 14,995 ± 1,225 13,941 ± 1,139 13,831 ± 1,130 12,192 ± 0,996 13,742 ± 1,123 13,933 ± 1,139 12,555 ± 1,026 15,173 ± 1,240 15,758 ± 1,288 18:1n-9 19,334 ± 1,580 16,184 ± 1,323 18,000 ± 1,471 20,456 ± 1,672 19,890 ± 1,626 20,285 ± 1,658 19,188 ± 1,568 17,427 ± 1,424 16,529 ± 1,351 18,088 ± 1,478 18:1n-7 1,890 ± 0,154 1,430 ± 0,117 1,670 ± 0,136 1,872 ± 0,153 1,858 ± 0,152 1,786 ± 0,146 1,806 ± 0,148 1,682 ± 0,137 1,619 ± 0,132 1,804 ± 0,147 18:2n-6 17,934 ± 1,466 19,615 ± 1,603 19,064 ± 1,558 18,532 ± 1,515 17,424 ± 1,424 18,360 ± 1,501 18,282 ± 1,494 17,994 ± 1,471 18,846 ± 1,540 17,683 ± 1,445 18:3n-6 0,086 ± 0,007 0,139 ± 0,011 0,112 ± 0,009 0,106 ± 0,009 0,118 ± 0,010 0,095 ± 0,008 0,054 ± 0,004 0,072 ± 0,006 0,063 ± 0,005 0,076 ± 0,006 18:3n-3 0,127 ± 0,010 0,157 ± 0,013 0,161 ± 0,013 0,157 ± 0,013 0,135 ± 0,011 0,181 ± 0,015 0,171 ± 0,014 0,161 ± 0,013 0,135 ± 0,011 0,118 ± 0,010 20:0 0,112 ± 0,021 0,134 ± 0,011 0,124 ± 0,017 0,130 ± 0,011 0,106 ± 0,009 0,132 ± 0,011 0,094 ± 0,010 0,068 ± 0,006 0,074 ± 0,006 0,140 ± 0,011 20:1n-9 0,270 ± 0,022 0,252 ± 0,021 0,253 ± 0,021 0,304 ± 0,025 0,246 ± 0,020 0,291 ± 0,024 0,235 ± 0,019 0,207 ± 0,017 0,231 ± 0,019 0,285 ± 0,023 20:2n-6 0,376 ± 0,072 0,486 ± 0,040 0,414 ± 0,057 0,422 ± 0,034 0,386 ± 0,047 0,429 ± 0,035 0,418 ± 0,045 0,430 ± 0,035 0,486 ± 0,032 0,415 ± 0,034 20:3n-6 1,542 ± 0,126 2,396 ± 0,196 1,896 ± 0,155 1,803 ± 0,147 2,217 ± 0,181 1,844 ± 0,151 2,051 ± 0,168 2,451 ± 0,200 2,646 ± 0,216 1,870 ± 0,153 20:4n-6 4,347 ± 0,355 5,270 ± 0,431 6,109 ± 0,499 5,017 ± 0,410 5,714 ± 0,467 5,089 ± 0,416 5,354 ± 0,438 7,228 ± 0,591 7,138 ± 0,583 6,303 ± 0,515 20:5n-3 0,436 ± 0,036 0,453 ± 0,034 0,440 ± 0,043 0,450 ± 0,032 0,440 ± 0,036 0,467 ± 0,031 0,575 ± 0,038 0,825 ± 0,062 1,092 ± 0,089 1,018 ± 0,072 22:4n-6 0,266 ± 0,022 0,289 ± 0,024 0,400 ± 0,033 0,374 ± 0,031 0,343 ± 0,028 0,371 ± 0,030 0,438 ± 0,036 0,265 ± 0,022 0,478 ± 0,039 0,377 ± 0,031 22:5n-6 0,137 ± 0,011 0,133 ± 0,011 0,131 ± 0,011 0,087 ± 0,007 0,122 ± 0,010 0,088 ± 0,007 0,134 ± 0,011 0,066 ± 0,005 0,195 ± 0,016 0,104 ± 0,009 22:5n-3 0,228 ± 0,019 0,277 ± 0,023 0,344 ± 0,028 0,259 ± 0,021 0,366 ± 0,030 0,292 ± 0,024 0,395 ± 0,032 0,357 ± 0,029 0,676 ± 0,055 0,604 ± 0,049 22:6n-3 1,101 ± 0,072 1,109 ± 0,091 1,117 ± 0,088 1,106 ± 0,090 1,150 ± 0,087 1,182 ± 0,097 1,279 ± 0,114 1,262 ± 0,095 1,723 ± 0,113 1,802 ± 0,118 ƩSFA 51,300 ± 4,193 51,271 ± 4,190 49,341 ± 4,032 48,481 ± 3,962 48,958 ± 4,001 48,611 ± 3,973 49,127 ± 4,015 49,111 ± 4,014 47,777 ± 3,905 48,944 ± 4,000 ƩMUFA 22,118 ± 1,808 18,406 ± 1,504 20,470 ± 1,673 23,208 ± 1,897 22,628 ± 1,849 22,991 ± 1,879 21,723 ± 1,775 19,777 ± 1,616 18,745 ± 1,532 20,684 ± 1,690 ƩPUFAn-6 24,689 ± 2,018 28,327 ± 2,315 28,127 ± 2,299 26,340 ± 2,153 26,323 ± 2,151 26,276 ± 2,147 26,730 ± 2,185 28,507 ± 2,330 29,852 ± 2,440 26,829 ± 2,193 ƩPUFAn-3 1,893 ± 0,155 1,996 ± 0,163 2,062 ± 0,169 1,972 ± 0,161 2,090 ± 0,171 2,122 ± 0,173 2,419 ± 0,198 2,606 ± 0,213 3,626 ± 0,296 3,543 ± 0,290 Tabulka 8 Profil mastných kyselin v PC skupina C Hodnoty jsou vyjádřeny jako průměr ± SEM. Zkratky: ƩSFA součet saturovaných mastných kyselin, ƩMUFA součet mononenasycených mastných kyselin, ƩPUFA součet vícenenasycených mastných kyselin. 33

Tabulka 8 Profil mastných kyselin skupina C (pokračování) FA/čas 15. den 22. den 29. den 36. den 43. den 50. den 57. den 64. den mol % 12:0 0,195 ± 0,016 0,233 ± 0,019 0,182 ± 0,015 0,177 ± 0,014 0,177 ± 0,014 0,247 ± 0,020 0,253 ± 0,021 0,238 ± 0,019 0,298 ± 0,024 14:0 0,208 ± 0,017 0,215 ± 0,018 0,275 ± 0,022 0,238 ± 0,019 0,188 ± 0,015 0,496 ± 0,041 0,516 ± 0,042 1,000 ± 0,082 0,982 ± 0,080 14:1n-5 0,009 ± 0,001 0,013 ± 0,001 0,003 ± 0,000 0,020 ± 0,002 0,001 ± 0,000 0,176 ± 0,014 0,196 ± 0,016 0,841 ± 0,069 0,916 ± 0,075 16:0 31,335 ± 2,561 31,429 ± 2,569 32,566 ± 2,662 32,305 ± 2,640 31,410 ± 2,567 31,597 ± 2,582 31,556 ± 2,579 35,934 ± 2,937 36,750 ± 3,003 16:1n-9 0,102 ± 0,008 0,100 ± 0,008 0,124 ± 0,010 0,128 ± 0,010 0,121 ± 0,010 0,105 ± 0,009 0,124 ± 0,010 0,122 ± 0,010 0,102 ± 0,008 16:1n-7 0,390 ± 0,032 0,401 ± 0,033 0,415 ± 0,034 0,333 ± 0,027 0,343 ± 0,028 0,481 ± 0,039 0,519 ± 0,042 0,555 ± 0,045 0,385 ± 0,031 18:0 15,701 ± 1,283 16,867 ± 1,379 15,700 ± 1,283 14,834 ± 1,212 14,696 ± 1,201 14,077 ± 1,150 15,153 ± 1,238 14,267 ± 1,166 14,660 ± 1,198 18:1n-9 19,243 ± 1,573 17,958 ± 1,468 18,256 ± 1,492 17,738 ± 1,450 19,059 ± 1,558 17,113 ± 1,399 15,535 ± 1,270 15,273 ± 1,248 14,279 ± 1,167 18:1n-7 1,871 ± 0,153 1,745 ± 0,143 2,035 ± 0,166 1,761 ± 0,144 1,882 ± 0,154 1,812 ± 0,148 1,815 ± 0,148 1,851 ± 0,151 1,925 ± 0,157 18:2n-6 18,091 ± 1,479 18,816 ± 1,538 18,313 ± 1,497 18,302 ± 1,496 18,320 ± 1,497 19,200 ± 1,569 19,142 ± 1,564 18,209 ± 1,488 18,819 ± 1,538 18:3n-6 0,070 ± 0,006 0,102 ± 0,008 0,135 ± 0,011 0,097 ± 0,008 0,052 ± 0,004 0,261 ± 0,021 0,139 ± 0,011 0,138 ± 0,011 0,102 ± 0,008 18:3n-3 0,128 ± 0,010 0,163 ± 0,013 0,132 ± 0,011 0,122 ± 0,010 0,095 ± 0,008 0,164 ± 0,013 0,182 ± 0,015 0,108 ± 0,009 0,105 ± 0,009 20:0 0,094 ± 0,015 0,076 ± 0,006 0,141 ± 0,012 0,132 ± 0,011 0,097 ± 0,008 0,135 ± 0,016 0,196 ± 0,016 0,293 ± 0,024 0,224 ± 0,024 20:1n-9 0,280 ± 0,023 0,251 ± 0,020 0,312 ± 0,025 0,289 ± 0,024 0,259 ± 0,021 0,265 ± 0,022 0,272 ± 0,022 0,278 ± 0,023 0,270 ± 0,022 20:2n-6 0,412 ± 0,034 0,371 ± 0,030 0,405 ± 0,040 0,409 ± 0,033 0,393 ± 0,032 0,474 ± 0,090 0,452 ± 0,037 0,494 ± 0,040 0,430 ± 0,035 20:3n-6 1,891 ± 0,155 1,723 ± 0,141 1,679 ± 0,137 1,601 ± 0,131 1,766 ± 0,144 1,900 ± 0,155 1,833 ± 0,150 1,890 ± 0,154 1,917 ± 0,157 20:4n-6 6,159 ± 0,503 5,479 ± 0,448 5,171 ± 0,423 7,138 ± 0,583 6,336 ± 0,518 6,455 ± 0,528 7,716 ± 0,631 5,027 ± 0,411 4,538 ± 0,371 20:5n-3 1,139 ± 0,066 1,244 ± 0,135 1,262 ± 0,066 1,242 ± 0,101 1,415 ± 0,107 1,336 ± 0,119 0,722 ± 0,071 0,654 ± 0,053 0,651 ± 0,043 22:4n-6 0,292 ± 0,024 0,312 ± 0,026 0,356 ± 0,029 0,433 ± 0,035 0,403 ± 0,033 0,443 ± 0,036 0,461 ± 0,038 0,531 ± 0,043 0,492 ± 0,040 22:5n-6 0,079 ± 0,006 0,088 ± 0,007 0,128 ± 0,010 0,168 ± 0,014 0,135 ± 0,011 0,193 ± 0,016 0,211 ± 0,017 0,245 ± 0,020 0,149 ± 0,012 22:5n-3 0,496 ± 0,041 0,598 ± 0,049 0,576 ± 0,047 0,594 ± 0,049 0,462 ± 0,038 0,464 ± 0,038 0,437 ± 0,036 0,252 ± 0,021 0,191 ± 0,016 22:6n-3 1,813 ± 0,148 1,817 ± 0,155 1,836 ± 0,120 1,940 ± 0,113 2,388 ± 0,147 2,604 ± 0,213 2,570 ± 0,181 1,800 ± 0,104 1,818 ± 0,137 ƩSFA 47,534 ± 3,885 48,820 ± 3,990 48,864 ± 3,993 47,686 ± 3,897 46,568 ± 3,806 46,553 ± 3,805 47,673 ± 3,896 51,732 ± 4,228 52,914 ± 4,324 ƩMUFA 21,895 ± 1,789 20,468 ± 1,673 21,145 ± 1,728 20,269 ± 1,657 21,667 ± 1,771 19,953 ± 1,631 18,462 ± 1,509 18,920 ± 1,546 17,876 ± 1,461 ƩPUFAn-6 26,995 ± 2,206 26,891 ± 2,198 26,186 ± 2,140 28,147 ± 2,300 27,405 ± 2,240 28,926 ± 2,364 29,954 ± 2,448 26,534 ± 2,169 26,446 ± 2,161 ƩPUFAn-3 3,576 ± 0,292 3,822 ± 0,312 3,805 ± 0,311 3,898 ± 0,319 4,360 ± 0,356 4,568 ± 0,373 3,911 ± 0,320 2,815 ± 0,230 2,764 ± 0,226 Hodnoty jsou vyjádřeny jako průměr ± SEM. Zkratky: ƩSFA součet saturovaných mastných kyselin, ƩMUFA součet mononenasycených mastných kyselin, ƩPUFA součet vícenenasycených mastných kyselin. 71. den 34

Obrázek 8 Časový průběh koncentrace kyseliny eikosapentaenové ve fosfatidylcholinu u jednotlivých skupin osob Hodnoty jsou vyjádřeny jako průměr ± SEM. Zkratky: PC fosfatidylcholin, EPA kyselina eikosapentaenová. čas 35

Obrázek 9 Časový průběh koncentrace kyseliny dokosahexaenové ve fosfatidylcholinu u jednotlivých skupin osob Hodnoty jsou vyjádřeny jako průměr ± SEM. Zkratky: PC fosfatidylcholin, DHA kyselina dokosahexaenová. čas 36

Obrázek 10 Časový průběh koncentrace kyseliny dokosahexaenové ve sfingomyelinu u sledovaných osob Hodnoty jsou vyjádřeny jako průměr ± SEM. Zkratky: SM sfingomyelin, DHA kyselina dokosahexaenová. čas 37

Obrázek 11 Časový průběh koncentrace kyseliny eikosapentaenové ve sfingomyelinu u sledovaných osob Hodnoty jsou vyjádřeny jako průměr ± SEM. Zkratky: SM sfingomyelin, EPA kyselina eikosapentaenová. čas 38

Obrázek 12 Změny v zastoupení mastných kyselin ve fosfatidylcholinu u jednotlivých skupin osob A 0, B 0, C 0 složení FA na začátku experimentu, A max, B max, C max složení FA při maximální koncentraci PUFA n-3. Hodnoty jsou vyjádřeny jako průměr ± SEM. Zkratky: ƩSFA součet saturovaných mastných kyselin, ƩMUFA součet mononenasycených mastných kyselin, ƩPUFA součet vícenenasycených mastných kyselin. 39

Obrázek 13 Zvýšení koncentrací EPA a DHA ve fosfatidylcholinu u jednotlivých skupin osob Hodnoty představují maximální dosažené koncentrace EPA a DHA vůči bazálním koncentracím (100%). Hodnoty jsou vyjádřeny jako průměr ± SEM. 40

Obrázek 14 Vzájemný vztah koncentrací DHA a EPA ve fosfatidylcholinu u jednotlivých skupin osob Hodnoty představují podíl koncentrací DHA/EPA. A 0, B 0, C 0 složení FA na začátku experimentu, A max, B max, C max složení FA při maximální koncentraci PUFA n-3. Hodnoty jsou vyjádřeny jako průměr ± SEM. 41

Obrázek 15 Aterogenní a trombogenní index fosfatidylcholinu u jednotlivých skupin osob A 0, B 0, C 0 hodnoty indexů na začátku experimentu, A max, B max, C max hodnoty indexů při maximální koncentraci PUFA n-3; AI aterogenní index, TI trombogenní index. Hodnoty jsou vyjádřeny jako průměr ± SEM. 42

5 Diskuze Podávání preparátu MaxiCor příznivě ovlivnilo hladiny sérových lipidů u všech testovaných osob - poklesly koncentrace triacylglycerolů, cholesterolu a apob, koncentrace HDL-C zůstaly zachovány. Po vysazení preparátu se hladiny lipidů vrátily do původních hodnot po 1 týdnu, zřejmě vzhledem ke krátkodobému podávání preparátu. Vstřebání PUFA n-3 do membrán erytrocytů se projevilo změnou profilu mastných kyselin ve frakci fosfatidylcholinu. Dle předpokladu došlo ke zvýšení obsahu kyselin EPA a DHA, nárůst byl u jednotlivých osob individuální. V preparátu byl poměr EPA/DHA 3,4:1, a také v PC erytrocytů byl přírůstek EPA vyšší než u DHA. Pouze v jednom případě byl nárůst srovnatelný, a to u osoby s nízkými bazálními koncentracemi těchto kyselin. Časový průběh inkorporace EPA a DHA do PC membrán erytrocytů měl pro všechny osoby obdobný charakter, tj. nárůst koncentrací se projevil přibližně po 5 dnech, přetrvával po dobu podávání a ještě asi 3 týdny po vysazení preparátu. Prakticky žádný vliv na zastoupení těchto kyselin nemělo podávání MaxiCoru u sfingomyelinu. Zvýšení koncentrací bylo nejvyšší (cca o 330 %) u osoby s velmi nízkou bazální hladinou EPA (0,12 M%) a DHA (0,33 M%) a srovnatelné pro obě kyseliny. U skupiny mužů s počáteční koncentrací EPA 0,22 M% a DHA 0,75 M% byla koncentrace EPA zvýšena o 310 % a DHA o 140 %. U skupiny žen s počáteční koncentrací EPA 0,42 M% a DHA 1,1 M% se zvýšila hladina EPA o 225 % a DHA o 130 %. Je známo, že zastoupení mastných kyselin v jednotlivých tkáních je specifické pro každý živočišný druh, u jedinců téhož druhu je dáno z větší části geneticky, z menší pak je ovlivnitelné dietou. Je pravděpodobné, že možnost nárůstu koncentrací EPA a DHA má určitý limit, daný snahou organismu zachovat fluiditu plasmatických membrán v optimálním rozmezí. Zajímavé je rovněž zjištění, že u osoby s nízkou bazální hladinou obou kyselin se poměr DHA:EPA podáváním preparátu prakticky nezměnil, zatímco u osob se střední a vyšší koncentrací těchto kyselin se výrazně snížil, tj. došlo k reflexi vyššího obsahu EPA v suplementu. Pro objasnění tohoto efektu by bylo třeba další detailnější studie na vyšším počtu osob. Studií na toto téma není v literatuře mnoho, docházejí v podstatě k obdobným závěrům. Rusca a spolupracovníci zjistili zvýšené koncentrace EPA a DHA v lipidu celé krve (28) po podávání preparátu, který obsahoval srovnatelné zastoupení obou kyselin v dávce 3 g/d. Gali a spolupracovníci sledovali inkorporaci EPA a DHA do celkového lipidu krve po jednorázové aplikaci 12 g 2 preparátů, které obsahovaly etylestery těchto kyselin v poměru EPA:DHA 43

1.32 a 1. Průběh inkorporace byl srovnatelný s naší studií, maximální koncentrace bylo dosaženo mezi 6. a 8. hodinou po podání. Leigh-Firbank a spolupracovníci (29) podávali 6 g/d rybího oleje po dobu 6 týdnů hypertriglyceridemickým osobám. V krevních destičkách zjistili zvýšené koncentrace EPA a DHA a snížené hladiny kyselin linolové, gama.linolenová a arachidonové. Mori a spolupracovníci podávali izolované kyseliny EPA nebo DHA v dávce 4 g/d po dobu 6 týdnů. Podávání izolované EPA zvýšilo její koncentraci ve fosfolipidech krevních destiček o 370% a snížilo obsah DHA o 56%. Podávání izolované DHA zvýšilo její obsah o 155% a obsah EPA zvýšilo o 54%. Podávání obou kyselin snížilo významně koncentraci kyseliny stearové, podávání EPA mělo větší vliv na snížení koncentrací kyselin linolové, dihomogamalinolenové a arachidonové než podávání DHA (30). Srovnáním profilů jednotlivých skupin mastných kyselin nasycených, mononenasycených a vícenenasycených na začátku pokusu a po dosažení maximálních koncentrací vidíme u osoby s nízkými bazálními hladinami PUFA n-3 pokles SFA a PUFA n-6, a nárůst MUFA a PUFA n-3. Stejný charakter změn byl zaznamenán i u mužů, rozdíly jsou ale výraznější. Ve skupině žen, která měla nejvyšší bazální koncentrace EPA a DHA, je charakter změn odlišný: poklesly hladiny SFA a MUFA a zvýšily se hladiny PUFA n-6 i PUFA n-3. Tato studie zahrnuje malý počet osob pro vysvětlení tohoto jevu. Pravděpodobně jde o komplexní vliv genetických, biochemických i dietních faktorů, který by vyžadoval studii s větším počtem osob. Příznivé účinky EPA a DHA na řadu funkcí organismu byly již mnohokrát popsány. Jedním z kvantitativních parametrů pro hodnocení je výpočet aterogenního a trombogenního indexu, který jsme provedli na základě zastoupení jednotlivých mastných kyselin. Oba tyto indexy se u všech skupin po suplementaci snížily, trombogenní index výrazněji než aterogenní. Míra snížení je rovněž odlišná v jednotlivých sledovaných skupinách nejméně se vliv uplatnil u osoby s nízkou bazální koncentrací PUFA n-3, u dalších dvou skupin je výraznější. 44

6 Závěr Závěrem lze shrnout, že užívání preparátu MaxiCor mělo jednoznačně pozitivní účinek na složení mastných kyselin v membránách erytrocytů u sledovaných osob. Hladiny EPA a DHA začaly v organismu stoupat v průměru po čtyřech dnech od začátku užívání preparátu. Maximální hladina PUFA n-3 byla detekována ještě tři týdny po vysazení preparátu. Analýza krevních lipidů prokázala snížení hladiny cholesterolu a triacylglycerolu. V membránách erytrocytů změna zastoupení jednotlivých mastných kyselin vedla ke snížení aterogenního a trombogenního indexu. U osob zařazených do skupiny C nebyl nárůst hladin PUFA n-3 tak výrazný jako u skupiny A vzhledem k tomu, že osoby ve skupině C měly na počátku studie vyšší koncentraci EPA a DHA. Tím, že PUFA n-3 ovlivňuje hlavně fluiditu membrán, fungoval zde obranný mechanismus organismu, aby zabránil poškození daných membrán. Tím, že životnost erytrocytů je cca 120 dní, ještě tři týdny po vysazení preparátu byly hladiny PUFA n-3 vyšší než jejich bazální koncentrace. 45

7 Seznam obrázků a tabulek Obrázek 1 Strukturní vzorce mastných kyselin... 9 Obrázek 2 Vzorec mastné kyseliny (kyselina stearová)... 10 Obrázek 3 Vzorec mononenasycené mastné kyseliny (kyselina olejová)... 11 Obrázek 4 Vzorce polynenasycených mastných kyselin (EPA a DHA)... 11 Obrázek 5 Stavba buněčné membrány... 18 Obrázek 6 Schéma plynového chromatografu... 19 Obrázek 7 Rozmístění fosfolipidových frakcí po vizualizaci UV lampou... 26 Obrázek 8 Časový průběh koncentrace kyseliny eikosapentaenové ve fosfatidylcholinu u jednotlivých skupin osob... 35 Obrázek 9 Časový průběh koncentrace kyseliny dokosahexaenové ve fosfatidylcholinu u jednotlivých skupin osob... 36 Obrázek 10 Časový průběh koncentrace kyseliny dokosahexaenové ve sfingomyelinu u sledovaných osob... 37 Obrázek 11 Časový průběh koncentrace kyseliny eikosapentaenové ve sfingomyelinu u sledovaných osob... 38 Obrázek 12 Změny v zastoupení mastných kyselin ve fosfatidylcholinu u jednotlivých skupin osob... 39 Obrázek 13 Zvýšení koncentrací EPA a DHA ve fosfatidylcholinu u jednotlivých skupin osob... 40 Obrázek 14 Vzájemný vztah koncentrací DHA a EPA ve fosfatidylcholinu u jednotlivých skupin osob... 41 Obrázek 15 Aterogenní a trombogenní index fosfatidylcholinu u jednotlivých skupin osob.. 42 Tabulka 1 Důležité mastné kyseliny... 12 Tabulka 2 Složení mastných kyselin v použitém dietním suplementu... 22 Tabulka 3 Použité standardy metylesterů mastných kyselin... 23 Tabulka 4 Odběrové schéma... 24 Tabulka 5 Koncentrace krevních lipidů... 29 Tabulka 6 Profil mastných kyselin v PC skupina A... 30 Tabulka 7 Profil mastných kyselin v PC skupina B... 31 Tabulka 8 Profil mastných kyselin v PC skupina C... 33 46

Použité zkratky AA kyselina arachidonová (arachidonic acid) AI aterogenní index ALA kyselina α-linolenová (α-linolenic acid) CHOD cholesteroloxidáza CNS centrální nervový systém DHA kyselina dokosahexaenová (docosahexaenoic acid) DHGLA kyselina dihomo- γ-linolenová (dihomo- γ-linolenic acid) DPA kyselina dokosapentaenová (docosapentaenoic acid) EDTA kyselina etylendiaminotetraoctová EPA kyselina eikosapentaenová (eicosapentaenoic acid) FA mastné kyselina (fatty acid) FID plamenoionizační detektor GC plynová chromatografie (gas chromatography) GLA kyselina γ-linolenová (gama linoleic acid) GLC plynová kapilární chromatografie (gass liquid chromatography) GPO glycerol-3-fosfát oxidáza HPLC vysokoúčinná kapalinová chromatografie (high performance liquid chromatography) LA kyselina linolová (linoleic acid) MCFA mastné kyseliny se středním řetězcem (medium chain fatty acid) MS metabolický syndrom MUFA mononenasycené mastné kyseliny (monounsaturated fatty acids) OA kyselina olejová (oleic acid) PA kyselina palmitová (palmitic acid) PAP fenol + aminofenazon PC fosfatidylcholin PE fosfatidyletanolamin PI fosfatidylinositol PL fosfolipidy POA kyselin palmitolejová (palmitoleic acid) 47

PS fosfatidylserin PUFA n-3 vícenenasycené mastné kyseliny (polyunsaturated fatty acids) SA kyselina stearová (stearic acid) SCFA mastné kyseliny s krátkým řetězcem (short chain fatty acids) SEM směrodatná odchylka průměru rozdílů (standard error of mean) SFA součet saturovaných mastných kyselin SM sfingomyelin TC celkový cholesterol (total cholesterol) TAG triacylglyceroly TI trombogenní index TLC chromatografie na tenké vrstvě (Thin layer chromatography) 48

8 Seznam použité literatury a zdrojů informací 1. VOET, Donald a Judith G. VOETOVÁ. Biochemie. Praha: Victoria Publishing, 1995. ISBN 80-85605-44-9. 2. Fakulta rybářství a ochrany vod, Institut klinické a experimentální medicíny. Co jsou omega 3 kyseliny. Kapr.cz [online]. [cit. 2013-3-12] Dostupné z: http://www.omega3kapr.cz/index.php/co-jsou-omega-3-kyseliny 3. DOSTÁLOVÁ, J. a kol. Mythyus rostlinných tuků. In: Atherosklerosa 2006: Sborník symposia. Praha: VI. Interní klinika 1. LF UK Praha, 2006, 6 str. 9-12. ISBN 80-239- 7726-1. 4. TVRZICKÁ, E. a kol. Mastné kyseliny 1. Výskyt a biologický význam. Časopis lékařů českých, 2009, 148, s. 16-24. ISSN 0008-7335. 5. TVRZICKÁ, E. a kol. Mastné kyseliny 2. Fyziologický a klinický význam. Časopis lékařů českých, 2009, 148, s. 116-123. ISSN 0008-7335. 6. Prezentace [online]. [cit. 2013-3-12] Dostupné z: is.muni.cz/do/1499/el/estud/fsps/js06/t031/tuky_lipidy_.ppt 7. European Food Information Council. Význam mastných kyselin omega-3 a omega-6. Eufic.org [online]. [cit. 2013-3-12] Dostupné z: http://www.eufic.org/article/cs/nutrition/fats/artid/omega-3-a-omega-6/ 8. DYERBERG,J. Linolenate-derived polyunsaturated fatty acids and prevention of atherosclerosis. Nutrition Reviews, 1986, vol. 44, p. 125-34. ISSN 1753-4887. 9. SIMOPOULOS, A.P. Omega-3 fatty acids in health and disease and in growth and development. The American Journal of Clinical Nutrition, 2012, vol. 54, p. 438-463. ISSN 1938-320710. 10. CALDER, P.C. N-3 Polyunsaturated fatty acids, inflammation: from molecular biology to the clinic. Lipids, 2003, vol. 38, p. 343-352. ISSN 0024-4201. 11. TVRZICKÁ, E. a kol. Mastné kyseliny. In: Atherosklerosa 2008: Sborník symposia. Praha: VI. Interní klinika 1. LF UK Praha, 2008, str. s14 s37. ISBN 978-80-254-2834-4. 49

12. FLACHS, Pavel a Jan KOPECKÝ. Mechanismus účinku n-3 PUFA na buněčné úrovni. In: Atherosklerosa 2005: Sborník symposia. Praha: VI. Interní klinika 1. LF UK Praha, 2005, 6 str. 36. ISBN 80-239-5545-4. 13. ZEMAN, M. a A. ŽÁK. Prevence a léčba metabolického syndromu a jeho hlavních komponent. In: Atherosklerosa 2005: Sborník symposia. Praha: VI. Interní klinika 1. LF UK Praha, 2005, 6 str. s1-s8. ISBN 80-239-5545-4. 14. CHALON, S. Omega-3 fatty acids and monoamine neurotransmission. Prostaglandins, leukotrienes and Essential fatty acides, 2006, vol. 75, p. 259-269. ISSN 1532-2823. 15. HORROBIN, D.F. et.al. Fatty acid levels in the brals of schizophrenic and normal controls. Biological Psychiatry, 1991, vol 30,p. 795-805. ISSN 0006-3223. 16. HIBBELN, J.R. Fish consumption and major depression. The Lancet,1998, vol. 351, p.1213. ISSN 0140-6736. 17. STOLL A.L. et. al. Omega-3 fatty acids in bipolar disorder: a preliminary doubleblind, placebo controlled trial. Archives of General Psychiatry, 1999, vol. 56, p.407-412. ISSN 0003-990X. 18. SCHAEFER, E.J. et. al. Plasma phosphatidylcholine docosahexaenoic acid content and risk of demetia and Alzheimer disease. Archives of Neurology, 2006, vol. 11, p.1545-1550. ISSN 0475-8540. 19. DE LAU, L.M. et. al. Dietary fatty acids and the risk of Parkinson disease: the Rotterdam study. Neurology. 2005, vol. 28, p. 2040-5. ISSN 0028-3878. 20. PECKA,M. Přehled laboratorní hematologie I. Krvetvorba. Červená krevní řada. Praha: Galén, 1995, ISBN 80-85824-28-0. 21. LEXOVÁ, S. a kol. Hematologie pro zdravotní laboranty 1. Díl. Brno: IDPVZ, 2000, ISBN 80-7013-304-X. 22. PTÁČEK, V. Cytologie nauka o buňkách, Masarykova univerzita Brno. is.muni.cz [online]. [cit. 2013-3-15] Dostupné z : http://www.sci.muni.cz/ptacek/cytologie6.htm 23. ŽÁK, A. a kol. Vícenenasycené mastné kyseliny řady n-3: klinický význam a terapeutické možnosti. In: Atherosklerosa 2005: Sborník symposia. Praha: VI. Interní klinika 1. LF UK Praha, 2005, str. s16 s32. ISBN 80-239-5545-4. 50

24. DOLEŽALOVÁ,V. a kol: Laboratorní technika v klinické biochemii a toxikologii. Brno: IDPVZ, 1995, ISBN 80-7013-198-5. 25. Metody chemického výzkumu, Plynová chromatografie,(poslední aktualizace: 2009-10-7), Masarykova univerzita Brno. is.muni.cz [online]. [cit. 2013-3-16] Dostupné z: http://cheminfo.chemi.muni.cz/chem_sekce/predmety/c7300/gc/uvod.pdf 26. FOLCH,J., M. LEES and G.H.S. STANLEY. Isolation of Total Tissue Lipids. The Journal of Biological Chemistry, 1957, vol.226, p. 497-509. ISSN 0021-9258. 27. CARLSON, L.A. Extraction of Lipids from Tissues. Clinica Chimica Acta, 1985, vol. 149, p. 89-93. ISSN 0009-8981. 28. RUSCA, A. et. al. Relative bioavailability and pharmacokinetics of two oral formulations of docosahexaenoic acid/eicosapentaenoic acid after multiple-dose administration in healthy volunteers. European Journal of Clinical Pharmacology, 2009, vol. 65, p. 503 510. ISSN 1432-1041. 29. LEIGHT-FIRBANK, E.C. et. al. Eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid from fish oils: differential associations with lipid responses. British Journal of Nutrition, 2002, vol. 87, p. 435 445. ISSN 0007-1145. 30. MORI, T.A. et al. Purified eicosapentaenoic and docosahexaenoic acids have differential ffects on serum lipids and lipoproteins, LDL particle size, glucose, and insulin in mildly hyperlipidemic men. The American Journal of Clinical Nutrition, 2000, vol. 71, p. 1085-94. ISSN 1938-3207. 51

9 Přílohy Dietní doplněk stravy MaxiCor Mikrostříkačky Hamilton 52

Nanášení standardů a vzorků při separaci metodou TLC Chromatografie na tenké vrstvě - vyvíjení 53

Detekce rozdělených fosfolipidů pod UV lampou (λ = 366 nm) Levá deska rozdělené a označené fosfolipidy vzorků, pravá deska rozdělené a označené standardy (metoda TLC) 54

GC 17A SHIMADZU 55

Záznam chromatografické analýzy mastných kyselin v dietním suplementu. Podmínky analýzy jsou uvedeny na staně 27 28.. Identifikace jednotlivých složek: 1-12:0, 2-14:0, 3-14:1n-5, 4-16:0, 5-16:1n-9, 6-16:1n-7, 7-18:0, 8-18:1n-9, 9-18:1n-7, 10-18:2n- 6,11-18:3n-6, 12-18:3n-3, 13-20:0, 14-20:1n-9, 15-20:2n-6, 16-20:3n-6, 17-20:4n-6, 18-20:5n-3, 19-22:4n-6, 20-22:5n-6, 21-22:5n-3,22-22:6n-3 56

Záznam chromatografické analýzy směsi standardů mastných kyselin. Podmínky analýzy jsou uvedeny na staně 27 28. Identifikace jednotlivých složek: 1-12:0, 2-14:0, 3-14:1n-5, 4-16:0, 5-16:1n-9, 6-16:1n-7, 7-18:0, 8-18:1n-9, 9-18:1n-7, 10-18:2n- 6,11-18:3n-6, 12-18:3n-3, 13-20:0, 14-20:1n-9, 15-20:2n-6, 16-20:3n-6, 17-20:4n-6, 18-20:5n-3, 19-22:4n-6, 20-22:5n-6, 21-22:5n-3,22-22:6n-3 57

Záznam chromatografické analýzy mastných kyselin ve fosfatidylcholinu membrán erytrocytů. Podmínky analýzy jsou uvedeny na staně xx. Identifikace jednotlivých složek: 1-12:0, 2-14:0, 3-14:1n-5, 4-16:0, 5-16:1n-9, 6-16:1n-7, 7-18:0, 8-18:1n-9, 9-18:1n-7, 10-18:2n-6,11-18:3n-6, 12-18:3n-3, 13-20:0, 14-20:1n-9, 15-20:2n-6, 16-20:3n-6, 17-20:4n-6, 18-20:5n-3, 19-22:4n-6, 20-22:5n- 6, 21-22:5n-3,22-22:6n-3 58