Univerzita Karlova v Praze

Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Studijní program: Biologie Karolína Skipalová Antikoagulační faktory krevsajících parazitů Anticoagulation factors of haematophagous parasites Bakalářská práce RNDr. Libor Mikeš, Ph.D. Praha, 2012

Poděkování: Děkuji svému školiteli RNDr. Liborovy Mikešovi, Ph.D. za konzultace, trpělivost a cenné rady. Zároveň bych chtěla poděkovat celé své rodině za podporu při psaní bakalářské práce. Prohlášení: Prohlašuji, že jsem závěrečnou práci zpracovala samostatně a že jsem uvedla všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu. V Praze, 24.08.2012 Podpis:

Obsah 1. Abstrakt.3 2. Abstract..3 3. Úvod 4 4. Hematofágie..5 5. Koagulační kaskáda...6 5.1. Vnější systém...8 5.2. Vnitřní systém...9 6. Regulace koagulační kaskády...10 6.1. Inhibitory Kunitz typu.....11 6.2. Inhibitory Kazal typu......12 6.3. Metody k posouzení koagulační aktivity enzymů a inhibitorů...12 6.3.1. Metody s chromogenními a fluorescenčními substráty..12 6.4. Koagulační testy....13 6.4.1. Aktivovaný parciální tromboplastinový čas...13 6.4.2. Protrombinový - Quickův čas...13 6.4.3. Trombinový čas...14 7. Antikoagulační faktory vybraných skupin hematofágů...14 7.1. Helminti.....14 7.1.1. Trematoda......14 7.1.1.1. Čeleď Schistosomatidae...14 7.2.1. Nematoda....16 7.1.2.1. Čeleď Ancylostomatidae...16 7.1.2.2. Čeleď: Trichostrongylidae.....17 7.2. Hirudinea.18 7.3. Arthropoda...20 7.3.1. Ixodida... 20 7.3.1.1. Čeleď Ixodidae...20 7.3.1.2. Čeleď Argasidae...25 1

7.3.2. Heteroptera..26 7.3.3. Diptera...28 7.3.3.1. Čeleď Culicidae.. 28 7.3.3.2 Čeleď Phlebotomidae.. 29 7.3.3.3. Čeleď Ceratopogonidae...29 7.3.3.4. Čeleď Glossinidae..30 7.3.3.5. Čeleď Simuliidae...30 7.3.3.6. Čeleď Tabanidae...31 7.3.3.7. Čeleď Muscidae. 32 7.3.4. Anoplura.32 8. Závěr.32 9. Použití literatura.35 2

1. Abstrakt Přítomnost antihemostatických molekul je nezbytná k úspěšnému přijímání potravy všech organismů, kteří se živí krví. Jsou to vasodilatační, antikoagulační molekuly a apyrázy, nabourávající se do hostitelské hemostázy, a tím celý proces blokují. Tato práce se snaží shrnout dostupné informace o antikoagulačních faktorech hematofágních parazitů. U krevsajících skupin helmintů, členovců a pijavek se jedná zvláště o inhibitory serinových proteáz, které mají svou inhibiční aktivitu namířenou především proti trombinu a faktoru Xa. Jde o dva klíčové faktory v koagulační kaskádě. Faktor X je první člen, kde se sbíhá vnitřní a vnější koagulační cesta. Zároveň díky němu vzniká aktivní forma proteinu trombinu, odpovídající za přeměnu rozpustného fibrinogenu na nerozpustný fibrin, který krvácení zastavuje. Kromě těchto dvou faktorů dohází však inhibici i dalších členu kaskády. Je to např. inhibice komplexu faktoru VII a TF, která byla popsána u měchovců a klíšťat. Antikoagulační faktory hrají zásadní roli v přenosu patogenů krví z vektora do hostitele. Čím déle je krev v tekutém stavu, tím je větší šance nákazy patogenem. Klíčová slova: krev, fibrinogen, fibrin, hemostáze, koagulace, hematofágie 2. Abstract Presence of antihaemostasis molekule is essential for the successful reception of food organisms that feed on blood. They are vasodilators, anticoagulant molecules and apyrases that break into the host hemostasis, thus blocking the whole process. This work summarizes all available information about the anticoagulant factors of haematophagous parasites.the blood sucking groups of helminths, arthropods and leeches is particularly inhibitors of serine proteases, which have their inhibitory aktivity directed primarily against thrombin and factor Xa. These are two key factors in the coagulation cascade. Factor X is the first member, where it sets the intrinsic and extrinsic coagulation pathways. At the same time it arises due to the aktive form of the protein thrombin, which is responsible for the conversion of soluble fibrinogen to insoluble fibrin, which stops bleeding. In addition to these two factors are inhibited of other members of the cascade. For example the inhibition of komplex factor VII and TF, which has been described in ticks and hookworms. Anticoagulation factors play a crucial role in the transmission of pathogens by blood from the vector into the host. The longer the blood is a liquid, the greater the chance of transmission of the pathogen. Keywords: blood, fibrinogen, fibrin, hemostasis, coagulation, haematophagy 3

3. Úvod Parazitické organismy, živicí se krví, najdeme v rámci různých skupin živočichů. Zejména pak mezi členovci, helminty a pijavkami. Každý hematofágní parazit musí zajistit, aby se krev během sání nesrážela a zůstala v tekutém stavu. Srážením by se zablokoval další její přísun. Parazitům to zajišťují mj. antikoagulační molekuly, které jsou většinou produkovány specializovanými žlázami. Krevní koagulační kaskáda pomáhá zachovávat cévní integritu. Jde o propracovaný systém enzymatických reakcí koagulačních faktorů, na jehož konci vzniká nerozpustná fibrinová zátka, zastavující krvácení v místě poškození cévy. Antikoagulační faktory inhibují koagulační faktory, a tím brání kaskádě hostitele vytvořit konečnou sraženinu. Krevsající paraziti mají své antikoagulační molekuly namířené především proti jednotlivým koagulačním faktorům. Jedná se o inhibitory proteáz a fibrinolytické enzymy. Většina parazitických skupin, prezentovaných v této práci, způsobuje nebo přenáší závažná infekční onemocnění. Svým působením či přenosem nejrůznějších patogenů vyvolávají těžká onemocnění, jako jsou horečka dengue, leishmanióza, malárie, Chagasova nemoc, schistosomóza, onchocerkóza či lymfatická filarióza. Antikoagulační faktory k šíření těchto chorob pomáhají blokací koagulační kaskády hostitele. Cílem mé bakalářské práce je shrnout a zpracovat dostupné informace o antikoagulačních faktorech jednotlivých parazitických krevsajících skupin, o jejich chemické povaze, mechanismech účinku, metodách detekce jejich biologické aktivity a také o samotné koagulační kaskádě formou literární rešerše. V rámci diplomové práce je možnost pokračovat studiem antikoagulačních faktorů u krevsajících Monogeneí. Monogenea patří mezi parazitické živočichy, konkrétně mezi ploštěnce. Ve většině případů žijí ektoparaziticky na rybách, kde mohou být nebezpečnými patogeny. Řada druhů způsobuje závažné ztráty v chovech ryb. Na rozdíl od ostatních parazitických ploštěnců nemají žádné mezihostitele. Larva se po přichycení na žábry či kůži hostitele postupně přetváří v dospělce. Živí se mukusem a tkáňovým detritem, ale je známo i značné množství krevsajících druhů, o jejichž antikoagulačních faktorech nemáme relevantní údaje. Studie by probíhala v rámci diplomové práce a grantového projektu, který se bude zabývat krevsajícími druhy diplozoidních monogeneí. 4

4. Hematofágie Organismy, které se živí krví, označujeme jako hematofágní. Tento způsob obživy je známý u krevsajícího hmyzu, některých dalších členovců, zástupců parazitických hlístic, pijavek či u motolic. Hematofágii bychom však našli i mezi savci u upírů rodu Desmodus. Hematofágové často způsobují hostiteli řadu nepříjemností. Ať už se jedná o záněty, alergickou reakci, ztrátu krve, či více těchto událostí najednou. Větší nebezpečí však spočívá ve schopnosti efektivně přenášet patogeny, což platí především u hmyzích zástupců. Tyto patogeny zapříčiňují řadu onemocnění u lidí i zvířat. Pro představu, 8 z 10 nejdůležitějších infekčních onemocnění na světě je parazitárních nebo parazity přenášených (WHO). Z toho 7 nemocí je přenášeno krevsajícími členovci. Patří mezi ně leishmanióza přenášená zástupci dvoukřídlého hmyzu z čeledi Phlebotomidae, malárie jako onemocnění způsobené prvoky z rodu Plasmodium a přenášené komárem rodu Anopheles, dále je to Chagasova nemoc šířená krevsajícími plošticemi čeledi Reduviidae, komáry přenášené lymfatické filariózy a horečka dengue, nebo onchocerkóza, kterou šíří muchničky. Osmé onemocnění schistosomóza je helmintóza působená motolicemi z čeledi Schistosomatidae. Na našem území je ze zdravotnického hlediska významná klíšťová encefalitida, infekční virové onemocnění přenášené klíšťaty rodu Ixodes. Klíšťata přenášejí i bakterie rodu Borrelia působící onemocnění zvané lymská borelióza (Rahn, 1991). Adaptací na tento způsob života došlo k rozmanitému uzpůsobení ústního ústrojí v rámci jednotlivých parazitických skupin. Odlišnosti v morfologii ústního ústrojí panují u zástupců nejpočetnější třídy živočichů - Insecta. Bodavě sací ústrojí s vysunovatelným styletem nalezneme u vší a mohutný sosák (rostrum) u ploštic. Součást ústního ústrojí klíšťat je zuby opatřený hypostom, který pomáhá klíštěti během sání udržet se na hostiteli. Další odlišnosti v délce a šířce sosáků objevíme u jedné z nejpočetnějších skupin hmyzu dvojkřídlých. U hlístic stojí za zmínku mohutná ozubená ústní kapsula čeledi Ancylostomatidae. Ústní otvor skupiny Monogenea je součást hlavové části (prohaptoru). U některých druhů jsou přítomné bukální přísavky. Pijavky přijímají krev svalnatou přísavkou a hltanem. Stejně jako se liší morfologie ústního ústrojí, liší se i strategie příjmu krve. Některé druhy (komáři, moucha tse-tse) sají na svém hostiteli jen pár minut, zatímco zástupci dalších skupin mohou sát několik desítek minut (ploštice), klíšťata dokonce až několik dní (Ribeiro a Francischetti, 2003; Wikel a kol., 1994). Konkrétně u hmyzu se vyvinuly dva odlišné způsoby, kterými k sání krve dochází. 5

Prvním způsobem je krev sána přímo z krevní kapiláry. Parazitům, kteří přijímají potravu takto, říkáme solenofágní, a jsou to např. vši, ploštice či blechy. Druhým způsobem je krev čerpána z hematomů, vytvářejících se v místě vpichu. Těmto zástupcům říkáme thelmofágní a patří mezi ně například ovádi či muchničky. Skupiny mají odlišné vlastnosti slin a odlišnou rychlost, jakou jsou schopni krev nasát. Solenofágní hmyz má dlouhé a tenké bodavé stylety, krev saje rychleji, než je schopna vytékat z cévy. Vzniká tím podtlak, kdy je céva přitisknuta k ústnímu ústrojí a nevzniká hematom. U thelmofágního hmyzu se vyvinuly stylety silnější. Jeho sliny obsahují řadu enzymů a dalších faktorů, způsobující rozsáhlé poškození tkáně a stěn cév okolo místa vpichu. Krev nasává pomaleji, než vytéká z poškozené cévy, čímž v místě sání vzniká hematom (Volf a kol., 2007). Během sání krve musí paraziti inaktivovat hostitelské obranné mechanismy, které zapříčiňují srážení krve a stažení cévy, čímž úbytek krve zablokují. Na překonání těchto mechanismů se u hematofágů vyvinula celá řada antihemostatických a imunomodulačních faktorů schopných v místě sání inhibovat všechny fáze hemostázi. Přítomnost těchto reakcí je podmínkou pro úspěšné sání. Inhibiční látky jsou ve většině případů produkovány specializovanými slinnými žlázami. Např. u měchovců (Ancylostomatidae) byla přítomnost inhibičních molekul zaznamenána v jícnu v esofageálních žlázách (Thorson a kol., 1956). Klíčovou roli v příjmu krve u všech krevsajících živočichů mají antihemostatické molekuly (Law a kol., 1992), kam mimo apyráz, schopných inhibovat agregaci trombocytů, a vasodilatačních látek se schopností rozšiřovat cévy a zvyšovat průtok krve, spadají i antikoagulační faktory (Ribeiro, 1995; Ribeiro a Francischetti, 2003; Salzet, 2001; Hovius a kol., 2008), kterými se v této práci budu zabývat. 5. Koagulační kaskáda Mezi základní obranné mechanismy, odehrávajícími se při poranění cévy v krevním řečišti, řadíme procesy spojené se srážením krve (hemostáza) a následné rozpuštění vzniklé fibrinové zátky (fibrinolýza). Hemostatický systém tvoří tři základní složky: koagulační kaskáda (vede ke vzniku krevní sraženiny), agregace a degranulace krevních destiček (slouží k tvorbě krevní zátky) a vazokonstrikce (snižuje tok krve). Hemokoagulační systém je sled enzymatických reakcí vedoucí ke vzniku trombinu a ke tvorbě fibrinového koagula přeměnou rozpustného fibrinogenu na nerozpustný fibrin (Hellmann a Hawkins, 1964). Vytvořená fibrinová zátka blokuje místo poranění a nedochází 6

tak k dalšímu úniku krve. Agregaci a degranulaci krevních destiček lze vyvolat jejich navázáním na kolagen, obnaženým při poranění cévy, přes trombin, vznikající při srážení krve, nebo ADP, který je uvolňován ostatními destičkami. Aktivované trombocyty změní tvar a v přítomnosti fibrinogenu, který se na aktivované destičky váže, se shlukují a vytvářejí primární destičkovou zátku. Degranulující trombocyty uvolňují ADP a ATP, což vede k amplifikaci koagulační kaskády reakcí koagulačních faktorů, na jejímž konci se z fibrinogenu stane nerozpustný fibrin, vytvářející síť. Ta zpevní masu rozpadlých destiček a zachycených červených krvinek a vytvoří definitivní krevní sraženinu. Trombocyty při degranulaci uvolňují i tromboxan a serotonin, vyvolávajícím vasokonstrikci cév a zabraňují tak průtoku krve (Pecka, 2004). Ačkoli jsou všechny složky hemostatického systému stejně důležité a nezbytné ke správnému fungování, v této práci se podrobněji zaměřím pouze na koagulační kaskádu, jež s tématem souvisí nejvíce (viz. obr.1.). Koagulační kaskádu tvoří 13 koagulačních faktorů, označovaných římskými číslicemi v posloupnosti, v níž byly objeveny. Aktivované formy se označují písmenem a. Jsou to plazmatické globuliny, glykoproteiny přirozeně přítomné v krevní plazmě (s výjimkou TF), kde kolují v neaktivní formě. Pro svoji aktivitu vyžadují proteolytické štěpení, při němž vzniká koagulačně aktivní enzym. Jediný z faktorů, který v plazmě koluje v nepatrném množství v aktivované podobě, je faktor (f)viia. Ale i fvii je v plazmě přítomen převážně v neaktivní podobě. Faktory II, VII, IX, X, XI, XII a prekalikrein vykazují po rozštěpení enzymatickou aktivitu a patří mezi serinové proteázy. Jiné faktory se po rozštěpení účastní tvorby koagulačně aktivních komplexů (vnitřní tenáza, protrombináza) a chovají se jako kofaktory (fviii, fv a vysokomolekulární kininogen-hmwk). Syntéza většiny faktorů je závislá na vitamínu K (výjimku tvoří faktor XI a XIII), stejně jako jejich funkce je závislá na iontech vápníku. Aktivace faktoru XIa nevyžaduje ionty vápníku ani povrchové fosfolipidy. Aktivace koagulační kaskády může probíhat dvěma způsoby. V případě, že je spouštěcím impulzem reakce změněný endotel nebo změny, probíhající ve stagnující krvi, uplatňuje se tzv. vnitřní systém. Je-li to odpověď na poškození tkání, vstupuje do hry tzv. vnější systém koagulace. Oba systémy se v určitém bodě sbíhají do společné dráhy, která dále vede k samotné tvorbě fibrinové sraženiny (Šlechtová, 2007). K udržení fluidity krve jsou nezbytné neustále probíhající specifické buněčné a proteinové interakce. Pouze vyvážený stav mezi prokoagulačními, inhibičními a fibrinolytickými procesy zaručuje, že nedojde k nežádoucím krvácivým stavům či naopak k nekontrolovatelnému krevnímu srážení. 7

Obr.1. Koagulační kaskáda, (upraveno podle http://sbi.imim.es/web/files/projects/master/2010/coagulation_serine_proteases/coagulationprocess.ht ml) 5.1. Primární systém aktivace (vnější systém) Primární systém aktivace (zvaný také vnější systém) se spouští po vazbě volně kolujícího faktoru VIIa s tkáňovým faktorem (TF). Tkáňový faktor, nazývaný též faktor III, je transmembránový glykoprotein v subendoteliální tkáni. Jeho kofaktor (neenzymatický protein) je přítomný v cévních buňkách a běžně není v kontaktu s cirkulující krví (Weiss a kol., 1989). Při poranění cévy se dostává TF do kontaktu s krví a tedy i s cirkulujícím faktorem VII, který se v plasmě přirozeně vyskytuje. Po vazbě s TF se faktor VII aktivuje a spolu s destičkovými fosfolipidy a Ca 2+ vytváří komplex vnější tenáza (Nemerson, 1988), který dále aktivuje faktor X. Aktivovaný faktor Xa vstupuje společně se svým kofaktorem, faktorem Va, destičkovými fosfolipidy a Ca 2+ ionty do komplexu protrombináza. Protrombináza konvertuje přeměnu malého množství protrombinu na trombin. Takto vzniklý trombin však není schopen rozštěpit dostatečné množství fibrinogenu, ale dokáže 8

zpětně aktivovat koagulační faktory XI, IX, kofaktory fviii, fv a trombocyty. Tato fáze koagulace se nazývá iniciace. 5.2. Přídatný systém aktivace koagulace (vnitřní systém) Tato část kaskády se spouští zpětnými mechanismy. Malým množstvím trombinu, vzniklým cestou vnější tenázy a protrombinázy, se aktivují faktory XI a IX spolu s kofaktory fviii a fv. Celý proces koagulace je touto cestou významně urychlen. Faktor IXa se svým kofaktorem fviiia vytvářejí společně s destičkovými fosfolipidy a Ca 2+ ionty komplex vnitřní tenáza, která generuje již dostatečné množství faktoru Xa. Ten společně se svým kofaktorem fva přeměňuje v komplexu protrombinázy již dostatečné množství protrombinu na trombin. Vzniklý trombin aktivuje přeměnu glykoproteinu fibrinogenu na fibrinové, spontánně polymerující fibrinové monomery. Vzniklé polymery fibrinu jsou stabilizovány trombinem aktivovaným faktorem XIIIa (McKee a kol., 1972) a vzniká nerozpustná fibrinová sraženina. Dřívější představa o tom, že se vnitřní cesta koagulace (dnes zvaná akcesorní či přídatná) spouští ve fázi kontaktu aktivací faktoru XII s následnou aktivací faktoru XI, který tvoří komplex s neenzymatickým kofaktorem vysokomolekulárním kininogenem HMWK, byla v současné době opuštěna. V komplexu fxi/hmwk nedochází k aktivaci fxi. Faktor XI může být aktivován fxiia, trombinem či autoaktivací (Šlechtová, 2007). Oba systémy hemokoagulace působí v organismu společně. Pro iniciaci koagulace je nezbytný systém vnější tenázy. Systém vnitřní tenázy je nutný pro zesílení procesu. Celý proces probíhá na povrchu krevních buněk. Iniciace na povrchu monocytů, amplifikace a propagace na povrchu krevních destiček. Průběh koagulačních reakcí není přísně kaskádovitý, dochází k celé řadě zpětných vazeb. Obr.2. molekuly A) trombinu a B) faktoru Xa. Červeně jsou vyznačeny záporně nabité oblasti, modře oblasti nabité kladně (upraveno podle Corral-Rodríguez a kol., 2009). 9

6. Regulace koagulační kaskády V inhibici koagulačních faktorů hrají důležitou roli jednotlivé oblasti na povrchu molekuly. Exosite I a II (viz.obr.2.) na trombinu jsou vazebná místa pro fibrinogen. Pokud se do nich naváže inhibitor, zamezí vazbě fibrinogenu a tím přeruší tvorbu nerozpustného fibrinu. Zablokuje se i trombinem indukovaná agregace krevních destiček (Crawley a kol., 2007). Vazba inhibitoru do aktivního místa zapříčiní inhibici amidolytické aktivity trombinu. Stejně to funguje i u fxa po navázání antikoagulantu do aktivního místa. Vazba do exosite má za následek inhibici tvorby trombinu. Antikoagulace se dělí podle mechanismu účinku na přímou a nepřímou. Přímé inhibitory svojí vazbou na vybrané koagulační faktory blokují jejich funkci. Do této skupiny patří např. hirudin, antikoagulant z pijavky Hirudo medicinalis. Na rozdíl od přímých antikoagulantů, nepřímé inhibitory ovlivňují koagulační faktory snížením jejich tvorby v játrech. Takto fungují např. hepariny, uplatňující se jako katalyzující kofaktor pro antitrombin (Pecka, 2004). Inhibici můžeme dále rozdělit na nekompetitivní a kompetitivní. Nekompetitivní inhibitory se váží na alosterická místa enzymů a nebrání tedy substrátu, aby se navázal do jeho vazebného místa, zatímco kompetitivní inhibitory soutěží s molekulami substrátu o vazebné místo na enzymu. Regulace koagulačních faktorů je v organismu zajišťována řadou přirozených endogenních inhibitorů. Mezi hlavní inhibitory zařadíme TFPI (inhibitor tkáňového faktoru), protein C, antitrombin (AT), heparinový kofaktor II (HC II), mikroglobulin či serpiny. Hematofágní živočichové dokáží produkovat také celou škálu inhibitorů koagulační kaskády, inhibujících hlavně aktivitu serinových proteáz. Antikoagulačními faktory jednotlivých hematofágních skupin živočichů se budu podrobněji zabývat v další kapitole. Pro srovnání zde uvedu přehled nejvýznamnějších lidských endogenních inhibitorů koagulační kaskády. TFPI - Aktivace inhibitoru tkáňového faktoru probíhá současně se vznikem komplexu vnější tenázy a protrombinázy. Syntéza TFPI je vyvolána vzestupem hladiny faktoru Xa. Aktivovaný faktor Xa se váže s TFPI a je touto vazbou zablokován. Vzniklý komplex fxa /TFPI inhibuje aktivitu vnější tenázy (blokuje aktivitu tkáňového faktoru) (Sprecher, 1993). Antitrombin patří mezi hlavní fyziologické koagulační inhibitory, působící silně na řadu reakcí koagulace (Lechner a kol., 1995). Ačkoli se může zdát, že antitrombin má vliv pouze 10

na trombin, opak je pravdou. Ve skutečnosti dokáže inhibovat prakticky všechny koagulační enzymy. Kromě trombinu působí na aktivované serinové proteázy faktory Xa, IXa, XIa a XIIa. Vytvořením komplexu s heparinem má antitrombin posílenou inhibiční aktivitu a rychlost účinku především proti trombinu a faktoru Xa. Protein C (Stenflo, 1976) není enzymový inhibitor v klasickém slova smyslu. Dokáže kontrolovat koagulaci díky regulaci aktivity komplexů IXa/VIIIa a Xa/Va. Aktivovaný protein C (APC) upravuje jejich aktivitu pomocí proteolytické inaktivace jejich kofaktorů VIIIa a Va, čímž se inhibuje systém vnitřní tenázy a protrombinázy, a tím i vznik trombinu (Debize a spol., 1995). Prekurzor APC váže trombin na endoteliální buněčný receptor trombomodulin. Trombomodulin slouží ke změně substrátové specifity trombinu a převádí prokoagulant na antikoagulant. Tímto způsobem může trombin zastavit svou vlastní tvorbu stejně jako tvorbu faktoru Xa. Účinnost proteinu C je posilněna jeho kofaktorem proteinem S. Heparinový kofaktor II (HCII) je specifický inhibitor trombinu se zvýšenou aktivitou v přítomnosti heparinu (Briginshawem a Shanbergem, 1974). Svou aktivitou neohrožuje žádné další proteázy, které se účastní koagulace a fibrinolýzy. Serpiny tvoří velkou skupinu inhibitorů serinových proteáz (Serine Protease Inhibitor). Vyskytují se v tělních tekutinách nejen u savců, ale i u dalších druhů živočichů. Většinou se jedná o inhibitory tvořící komplex s cílovým enzymem. Společné pro serpiny je terciální struktura, skládající se z 9 alfa helixů a 3 beta listů. Funkční domény se nacházejí blízko C-terminální domény. Oblast zvaná reaktivní smyčka, která je vystavena na povrchu proteinu, narušuje strukturu cílové proteázy, přičemž proteáza je následně degradována (Carrell a Travis, 1985). Příkladem lidského serpinu je antitrombin, mající svojí roli v regulaci krevního srážení. 6.1. Inhibitory Kunitz typu jsou reverzibilní kompetitivní inhibitory serinových proteáz (Ascenzi a kol., 2003). Vyznačující se vysokým obsahem disulfidických můstků (Richardson, 1981), které zajišťují proteinům dostatečnou stabilitu (Read a James, 1986). Dalším znakem těchto domén je reaktivní smyčka- tzv. RSL ( reactive-site loop ), zasouvající se do aktivního centra proteinázy (Bode a Huber, 2000; Perona a Craik, 1997). Domény byly popsány ve slinách klíšťat, klíšťáků (Corral-Rodriguez a kol., 2009; Francischetti a kol., 2009) a některých lidských proteinů. Jsou to např. základní inhibitor pankreatické trypsinu, BPTI nebo inhibitor tkáňového faktoru TFPI. 11

6.2. Inhibitory Kazal typu jsou charakterizovány podle evolučně konzervované sekvence aminokyselin, obsahující tři disulfidické můstky a působí s různou specificitou na serinové proteázy (Laskowski a kol., 1980). Existují 2 typy kazal domén: Kazal I a Kazal II. Ve struktuře domén Kazal I se objevuje velké množství opakujících se krátkých alfa helixů a anti-paralelních beta listů (Williamson a kol., 1984), zatímco v doméně II se vyskytuje centrální alfa-šroubovice, krátké dvě antiparalelní beta-listy a několik sulfidických můstků (Schlott a kol., 2002; Stubbs a kol., 1997; van de Locht a kol., 1995). Amino-terminální sekvence této domény se váže do aktivního místa cílových proteáz, čímž brání jejich funkci. U lidí existuje skupina lymfo-epiteliálních inhibitorů Kazal typu (LEKTI), která hraje roli v morfogenezi kůže a vlasů nebo v protizánětlivé a antimikrobiální ochraně epiteliální sliznice (Furio a kol., 2011). Např. LEKTI-2 je inhibitor molekuly KLK5 (Kallikreinpeptidáza-5), což je serinová proteáza v epidermis, odpovědná za regulaci kožní hemostázy a odlupování kůže. Kromě lidských proteinů byly molekuly Kazal typu popsány také u Heteroptera a Diptera. 6.3. Metody k posouzení koagulační aktivity enzymů a inhibitorů Metody založené na chromogenních substrátech jsou schopné odhalit aktivitu jednotlivých složek koagulačního systému (enzym, inhibitor) bez návaznosti na ostatní složky tohoto systému. 6.3.1. Metody s chromogenními a fluorescenčními substráty Postupy využívající chromogenní substráty se používají hlavně ke zjištění funkčnosti serinových proteáz. Mezi přednosti patří snadné, jednoduché a přesné stanovení. K určení je možné použít větší ředění vzorku. Zjišťuje se schopnost katalytického místa serinové proteázy proteolyticky štěpit předem definovaný substrát na produkt. Syntetické chromogenní substráty se začaly používat k posouzení aktivity některých enzymů a inhibitorů, u kterých není možné zavést jednoduché koagulační testy (např. stanovení faktoru XIII) nebo byla obtížná standardizace pro jejich snadné ovlivnění řadou dalších faktorů (např. antitrombinem) (Pecka, 2004). 12

6.4. Koagulační testy Kvalita koagulace je vyjádřena časem potřebným k vytvoření fibrinového vlákna po přidání startovací reagencie a je ovlivněna souhrou prokoagulačních a protikoagulačních plazmatických složek. Mezi základní koagulační testy, umožňující detekovat poruchu vnitřní či vnější koagulační kaskády, patří aktivovaný parciální tromboplastinový čas, protrombinový čas a trombinový čas. 6.4.1. Aktivovaný parciální tromboplastinový čas (aptt, z angl. activated parcial tromboplastine time) Tento test sleduje aktivitu vnitřní koagulační dráhy a přeměnu protrombinu na trombin (Proctor a Rapaport, 1961). Zachycuje tyto složky koagulačního systému: faktory II, V, VIII, IX, X, XI, XII, fibrinogen, prekalikrein a HMWK (high molecular weight kininogen). Do plazmy je přidáván kaolín a fosfolipid (kefalinový komplex neboli parciální tromboplastin). Kaolín působí jako povrchový aktivátor, na němž se aktivují faktory vnitřní cesty (XII a XI) a fosfolipid je nutný k aktivaci faktoru X. Tímto se aktivuje vnitřní a poté i společná cesta. Měří se čas do vzniku fibrinové sraženiny. Za normálních podmínek se tato doba pohybuje mezi 35-45 s. Prodloužení aptt může způsobit deficit některého z vnitřních faktorů (VIII, IX, XI, XII), deficit více faktorů vnitřní cesty (např. při diseminované intravaskulární koagulaci) nebo deficit faktorů V, X, protrombinu a fibrinogenu (kdy je ovšem současně prodloužený PT). Dále může prodloužení způsobit přítomnost inhibitorů zmíněných koagulačních faktorů. 6.4.2. Protrombinový - Quickův čas (PT) Test protrombinového času slouží k detekci vnější koagulační cesty (Quick, 1935). Sleduje správnou funkci koagulačních faktorů II, V, VII, X a fibrinogenu. Normální hodnota protrombinového testu je obvykle 12 15 sekund. Protrombinový čas se často vyšetřuje společně s testem aptt, který monitoruje vnitřní systém hemokoagulace. Test se provádí přidáním tkáňového faktoru a vápníku k plazmě a měří se čas, který je potřebný k vytvoření sraženiny. S prodloužením PT se setkáváme u pacientů s deficitem faktoru VII (velmi vzácný), faktorů V, X, protrombinu, fibrinogenu, z nedostatku vitamínu K či v přítomnosti některých inhibitorů koagulačních faktorů. 13

6.4.3. Trombinový čas (TT) Trombinový test (Jim, 1957) postihuje třetí fázi koagulace, tj. štěpení fibrinogenu trombinem. Přidáním enzymu trombinu k testované plazmě dochází k přeměně fibrinogenu na fibrin. Fyziologický čas je 14-16 s. Prodloužení časů je nejčastější u kvalitativních a kvantitativných poruch fibrinogenu, u poruchy štěpení fibrinogenu trombinem či v přítomnosti heparinu. Stejně jako u ostatních koagulačních testu i tady lze prodloužení dosáhnout výskytem inhibitorů koagulačních faktorů. 7. Antikoagulační faktory vybraných skupin hematofágů 7.1. Helminti Helminti tvoří velmi rozsáhlou a různorodou skupinu živočichů, zahrnující několik kmenů. Hematofágní zástupci se objevují u většiny z nich. Mezi hlístice spadá např. významná krevsající čeleď Ancylostomatidae, u ploštěnců bychom nalezli hematofágy u některých čeledí motolic nebo u Monogenea. Přítomnost a charakter antikoagulačních faktorů u jednotlivých skupin budou popsány v následujících podkapitolách. 7.1.1. Trematoda Motolice jsou početná skupina ve většiny případů endoparaziticky žijících ploštěnců. Parazitují především v trávicí soustavě, ale mohli bychom je najít např. i v dýchací či nervové soustavě. V krevním řečišti bylo objeveno také několik zástupců, přičemž ty nejvýznamnější pocházejí z čeledi Schistosomatidae. 7.1.1.1. Čeleď Schistosomatidae Schistosomy jsou hematofágní motolice žijící většinou v krvi v cévách hostitele. K tomu, aby mohly takto přežívat, musí produkovat molekuly, modulující imunitní a hemostatické odpovědi hostitele ve svůj vlastní prospěch (Pearce a kol., 2002, Mountford a Secor, 2005; Ramajo-Hernández a kol., 2007; Escudero a kol., 2010). Dosud byly identifikovány u schistosom pouze dva typy molekul s antikoagulační aktivitou. 14

Annexiny Annexiny jsou rozpustné bílkoviny v cytosolu i v extracelulárních tekutinách. Spojením s membránami na povrchu buněk se zapojují do procesů hemostázy a protizánětlivých funkcí. Objevují se u živočichů i rostlin (Donnelly a kol., 1997). V tegumentu a sekrečních produktech schistosom byly identifikovány annexiny s antikoagulační aktivitou (Torre-Escudero a kol., 2011), patřící do evolučně konzervované multigenové rodiny. Tegument schistosom představuje důležitou roli při interakci s hostitelskou imunitou a hemostázou (Jones a kol., 2004; van Hellemond a kol., 2006; Ramajo-Hernández a kol., 2007; Torre-Escudero a kol., 2010). Annexiny jsou exprimovány na povrchu tegumentu dospělých červů i schistosomul, kde jsou v přímém kontaktu s krví hostitele (Tararam a kol., 2010). V přítomnosti vápníku se annexiny kompetitivně vážou na negativně nabité fosfolipidy a inhibují tak aktivované koagulační komplexy, které jsou na fosfolipidech závislé (Gerke a Moss, 2002). Vazebná místa pro extracelulární annexiny jsou na povrchu buněk. Annexiny byly identifikovány na povrchu tegumentu u Schistosoma mansoni (Braschi a Wilson, 2006; Borges a kol., 2011) a Schistosoma japonicum (Mulvenna a kol., 2010). V sekrečních produktech byl izolován annexin SbANX z Schistosoma bovis, vykazující inhibiční efekt vůči vnější i vnitřní koagulační dráze (Pérez-Sánchez a kol., 2006). Antigen Sm22.6 Antigen 22.6 byl identifikován v tegumentu Schistosoma mansoni (Sm22.6 Ag) během 24 hodin po transformaci cerkárie ve schistosomulu (Stein a kol., 1986), v období, ve kterém nedochází k buněčnému dělení. Protein byl později nalezen ve všech infekčních stádiích schistosomy, což naznačuje tomu, že může mít zásadní význam pro fyziologickou rezistenci helminta (Samuelson a kol., 1982; Jeffs a kol., Dunne a kol., 1997). Tento antigen je homogenní polymer s inhibiční aktivitou proti lidskému trombinu. Reverzní interakcí antigenu s trombinem dochází k inhibici jeho proteolytické aktivity. Sm22.6 Ag se skládá ze 190 aminokyselinových zbytků a jeho molekulová hmotnost je 22,6 kda. Přítomnost Sm22.6 antigenu prodlužuje dobu srážení 3-5 krát, což může hrát roli v imunitním úniku parazita (Lin a He, 2006). Antigen 22.6 je považován za významného kandidáta na vakcínu proti schistosomám (Su a kol., 1999; Wu a kol., 1999; Hu a kol., 2001). 15

7.1.2. Nematoda Hlístice jsou jednou z nejpočetnějších skupin živočichů. Zahrnují druhy parazitující na obratlovcích, bezobratlých, rostlinách i volně žijící. Převážná většina parazitických zástupců žije v trávicím traktu obratlovců, kde se živí tráveninou či krví. 7.1.2.1. Čeleď Ancylostomatidae Zástupci této parazitické skupiny žijí v tenkém střevě savců. Svou ústní kapsulou rozrušují střevní sliznici. Pokud je infekce rozsáhlá, může následná ztráta krve způsobit krevní anémii z nedostatku železa. Odhaduje se, že asi 600 milionů lidí na světě je infikováno měchovcem (de Silva a kol., 2003; Hotez a kol., 2006). U lidí je infekce nejčastěji způsobená druhy Ancylostoma duodenale a Necator americanus. Anti-trombické látky, vylučované měchovci, představují potenciální cíle pro rozvoj preventivní nebo léčebné vakcíny proti infekci měchovec (Cappello a kol., 1995, 2003; Stassens a kol., 1996). Antikoagulační proteiny NAPs Skupina peptidů NAPs (Nematode Anticoagulant Proteins) spadá do skupiny hlavních antihemostatických molekul, které byly nalezeny v měchovcích. Každý z těchto NAPs proteinů patří mezi inhibitory serinových proteáz. Do dnešní doby byly izolovány a charakterizovány molekuly rodiny NAPs z měchovce Ancylostoma caninum (Cappello a kol., 1996; Stassens a kol., 1996; Harrison a kol., 2001; Li a kol., 2010), Ancylostoma ceylanicum (Harrison a kol., 2002; Mieszczanek, 2004) či z Ancylostoma duodenale (Gan a kol., 1976-80). Z lidského druhu A. duodenale byl izolován antikoagulant AduNAP4. Obsahuje 104 aminokyselin se 23 zbytkovými signálními peptidy. Velice efektivně prodlužuje aktivovaný parciální tromboplastinový čas (aptt) a zároveň inhibuje katalytickou činnost faktorů Xa a Xla. Inhibice faktoru Xa funguje jako smíšená inhibice, kdežto inhibitor faktoru XIa jako kompetitivní inhibice. Inhibiční efekt proti trombinu nebyl prokázán. Antikoagulant NAP5 z A. caninum se váže do aktivního místa fxa a tím inhibuje jeho amidolytickou aktivitu. C-terminální konec interaguje s exosite fxa, čímž inhibuje tvorbu trombinu (Rios - Steiner a kol., 2007). Antikoagulant Ac-AP-12 z Ancylostoma caninum byl první inhibitor faktoru Xa izolovaný z esofageálních žláz (Thorson a kol., 1956). Vykazuje až 69% homologní 16

aminokyselinové sekvence s proteiny skupiny NAPs (Harrison a kol., 2002). Obsahuje 10 cysteinových zbytků, které jsou důležité pro tvorbu 5 disulfidických můstků. Ty zachovávají terciární strukturu a funkce proteinu (Grasberger a kol., 1994; Huang a kol., 1994; Bernard a kol., 1993). Další antikoagulant z Ancylostoma caninum AcAPc2 inhibuje komplex VIIa/TF a protrombinázu (Bergum a kol., 2001; Buddai a kol., 2002). Prodlužuje PT i aptt a spadá mezi serpiny (Bernard a kol., 1993; Stassens a kol., 1996; Harrison a kol., 2002). Druh Antikoagulant Lokalizace Inhibice Reference Ancylostoma ceylanicum Ancylostoma caninum AceAP-1 Neidentif. fvii/tf, fxa Harrison; Mieszczanek, 2004 AcAP-12 Esofageální žlázy fxa Jiang a kol., 2010 Ancylostoma caninum AcAP-5,6 Amphidialní/Cephalické žlázy fxa Cappello,1995; Strassens,1996 Ancylostoma duodenale Ancylostoma caninum Ancylostoma caninum AduNAP-4 Neidentif. fxa, fxia Gan a kol., 1976-1980 AcAP-2,3,4 Esofageální žlázy fvii/tf, fxa Strassens,1996; Mieszczanek,2004 AcaNAP-10,11 Neidentif. fviia/tf, fxia Li a kol., 2010 Tab.1. Přehled známých NAPs z různých druhů měchovců (upraveno dle Jiang a kol. Molecular & Biochemical Parasitology, 2011). 7.1.2.2. Čeleď: Trichostrongylidae Haemonchus contortus je významná patogenní parazitická hlístice, která výrazně ovlivňuje trávicí trakt přežvýkavců, zejména ovcí, koz a skotu, v různých oblastech světa (Meeusen a kol., 2005). Červi sají krev ve slezu, čímž mohou způsobit lokální poškození, chudokrevnost, ztrátu tělesné hmotnosti a špatnou kondici zvířat (Bakker a kol. 2004; Muleke a kol., 2006, 2007). Konečný výsledek může být smrt (White a kol., 2001). Přítomnost antikoagulační aktivity nebyla u této hlístice intenzivně zkoumána. Jako efektivní inhibitor trypsinu s antikoagulační aktivitou se ukázal být HC-Serpin (Haemonchus 17

contortus serpin). Byl lokalizován v epiteliálních buňkách gastrointestinálního traktu pouze u dospělců H. contortus, což naznačuje souvislost serpinu s trávením krve (Yi a kol., 2010). 7.2. Hirudinea U pijavek se vyvinul velký arzenál vysoce specifických inhibitorů, působících během sání na hostiteli v různých bodech koagulační kaskády. Inhibice trombinu Mezi nejznámější antikoagulanty, které byly z pijavek izolovány, patří bezpochyby hirudin ze slinných žláz Hirudo medicinalis. Řadí se mezi nejúčinnější inhibitory trombinu. Hirudin byl charakterizován jako 7 kda velký jednořetězcový polypeptid složený z 65 aminokyselin, třech disulfidických můstků uvnitř řetezce, se sulfatovanými tyrosinovými zbytky a 6 cysteiny (Markwardt a kol., 1959; 1960; 1987 a 1989 v Harvey, 1985). Díky přítomnosti 3 disulfidických můstků je jeho N-termiální konec velmi kompaktní. Naproti tomu C-terminální konec obsahuje četné negativně nabité aminokyselinové zbytky. Ve srovnání s nízkomolekulárním heparinem se hirudin těsně váže na trombin (Talbot, 1989) a pro svou aktivitu nepotřebuje kofaktor. Ve vytvořeném komplexu hirudin/trombin se N- terminální doména hirudinu váže v blízkosti aktivní strany trombinu, zatímco C-terminální doména se váže na vazebné místo fibrinogenu (Naski a kol., 1990). Podrobnější studie krystalické struktury hirudinu ukázaly, že posledních 10 aminokyselinových zbytků (55-65) C-terminální oblasti reaguje s vnější stranou trombinu a právě tato oblast je důležitá pro vazbu fibrinogenu (De Filippis a kol., 1995). Aminokyselinové zbytky na N-konci (1-48) jsou však také důležité pro inhibiční aktivitu hirudinu vůči trombinu (De Filippis a kol., 1995), interagují s jeho katalytickým místem. Kromě antikoagulantu hirudinu byly izolovány i další inhibitory trombinu různých druhů pijavek. Patří mezi ně granulin z Hirudo nipponia (Hong a Kang, 1999), bufrudin z Hirudinaria manillensis (Electricwala a kol., 1991), theromin z Theromyzon tessulatum (Salzet a kol., 2000) a haemadin z Haemadipsa sylvestris (Strube, 1993). Granulin je 6 kda velký antikoagulant bohatý na cystein (20%) pocházející z korejské krevsající pijavky Hirudo nipponia. Jeho aminokyselinové složení a N-terminální sekvence svou shodné s proteiny granulinového typu, proto název granulin (Hong a Kang, 1999). Bufrudin je 15,2 kda velký inhibitor z H. manillensis. Nejsilnější inhibiční efekt má na trombin a poté ještě na fvii a fxii. Ve všech koagulačních testech (aptt, PT a TT) prodlužoval čas srážlivosti. 18

Po hirudinu, druhý nejsilnější inhibitor - theromin byl izolován ze střeva pijavky Theromyzon tessulatum. Je to homodimer tvořený 67 aminokyselinovými zbytky a 16 cysteiny, které jsou zapojeny do 8 disulfidických můstků. Theromin tak patří mezi molekuly bohaté na cysteinové zbytky (Salzet a kol., 2000). Tento antikoagulant však nemá žádnou významnou sekvenční homologii s jiným inhibitory trombinu, které byly dosud izolovány. Další 5 kda velký inhibitor trombinu z pijavky Haemadipsa sylvestris - haemadin - obsahuje podobně jako hirudin konzervované aminokyselinové zbytky (46-48), které jsou důležité pro vazbu k trombinu (Strube a kol. 1993). Inhibice faktoru Xa Inhibice faktoru Xa je u pijavek také rozšířená. Jedná se např. o antistasin ze slinných žláz pijavky Haementeria officinalis (Nutt, Gasic, 1988), ghilanthen z Haementeria ghiliani (Blankenship a kol., 1990) nebo therostasin, který byl izolován ze slinných žláz Theromyzon tessulatum. Struktura therostasinu se skládá z 82 aminokyselinových a 16 cysteinových zbytků a spolu s antistasinem slabě inhibují i trypsin (Chopin a kol., 2000). Antistasin je těsně se vázající a 15 kda velký inhibitor fxa získaný z mexické pijavky H. officinalis. Protein obsahuje 119 aminokyselinových zbytků rozdělených do tří domén. Reaktivní místo, které se váže do aktivního místa fxa se nachází v doméně I (Nutt a kol., 1991). Ghilanthen je homologní inhibitor k antistasinu, skládající se z 119 aminokyselin a 20 cysteinů. Navíc ještě obsahuje konsensuální sekvenci pro vazbu heparinu v C-konci. Reaktivní zbytek (Arginin-34) se váže na aktivní místo fxa a tím dochází k inhibici faktoru (Blankenship a kol., 1900). 19

Molekula Druh Reference Inhibice trombinu Hirudin Hirudo medicinalis Markwardt,1959 Hirustasin Hirudo medicinalis Söllner a kol., 1994 Granulin Hirudo nipponia Hong a Kang, 1999 Bufrudin Hirudinaria manillensis Electricwala, 1991 Haemadin Haemadipsa sylvestris Strubea a kol., 1993 Theromin Theromyzon tessulatum Salzet a kol., 2000 Inhibice faktoru Xa Antistasin Haemanteria officinalis Nutt a kol., 1988 Ghilanten Haementaria ghilianii Blankeship, 1990 Therostasin Theromyzon tessulatum Chopin a kol., 2000 Tab. 2. Molekuly izolované od pijavek podílející se na inhibici koagulační kaskády (upraveno dle Salzet M., 2001). 7.3. Arthropoda Členovci představují nejpočetnější živočišnou říši. Krevsající paraziti, zde zmiňovaní, jsou řazeni do dvou různých skupin hmyz a roztoči. Mezi hmyz spadají ploštice, vši a dvoukřídlí, zatímco klíšťata a klíšťáci patří mezi roztoče. 7.3.1. Ixodida Tento řád zahrnuje z velké části obligátní parazity, které dělíme na klíšťata a klíšťáky. Stejně jako ostatní hematofágové i Ixodida umí modulovat hemostatický systém. Řada antikoagulantů obsahuje Kunitz domény, které jsou vysoce zastoupeny ve slinných žlázách obou čeledí. Inhibitory Kunitz typu mají za obvyklé cíle serinové proteázy. 7.3.1.1. Čeleď Ixodidae Klíšťata jsou obligátní ektoparaziti se širokým spektrem hostitelů. Zároveň patří mezi nejvýznamnější vektory účastnící se přenosu lidských onemocnění. Jedná se hlavně o virovou encefalitidu a bakteriální lymskou boreliózu. Sání klíšťat na hostiteli trvá většinou několik 20

dní, proto je přítomnost bioaktivních, protizánětlivých a antikoagulačních látek naprosto nezbytná (Ribeiro a kol., 1987). Inhibitory koagulační kaskády klíšťat patří převážně do proteinové rodiny Kunitz typu nebo do velké skupiny inhibitorů serinových proteáz - serpinů. Inhibice trombinu Cílená inhibice trombinu je velmi účinný způsob, jak potlačit hemostatickou reakci. V důsledku toho existuje několik antitrombinů popsaných z různých druhů klíšťat. Nejnověji popsaný antikoagulant s Kunitz doménou je rhipilin, který byl izolován z Rhipicephalus haemaphysaloides (Gao a kol., 2011). Prodlužuje PT i aptt. Specifičnost rhipilinu ještě není přesně určena. Tím, že zasahuje do vnitřní cesty, však může inhibovat faktor Xa, trombin či oba dva. Dva inhibitory o velikosti 7 kda - madanin 1 a 2 byly identifikovány z Haemaphysalis longicornis (Iwanaga a kol., 2003). Oba prodlužují aptt a PT a inhibují přeměnu fibrinogenu na fibrin, aniž by ovlivňovaly amidolytickou aktivitu trombinu. To naznačuje, že se inhibitory váží na exosite 1. Jedná se o serpiny s kompetitivní inhibicí. Inhibitory z H. longicornis mají jen nepatrné podobnosti s inhibitory jiných druhů klíšťat. Např. chimadanin izolovaný také z H. longicornis prodlužuje aptt a PT, ale na rozdíl od madaninů inhibuje amidolytickou aktivitu trombinu a váže se do jeho aktivního místa (Nakajima a kol., 2006). Další popsaný antikoagulant tohoto klíštěte je střevní inhibitor hemalin, který neblokuje činnost serinových proteáz v místě sání, ale ve střevě, kde pravděpodobně pomáhá i s trávením krve (Liao a kol., 2009). Microphilin je malý slinný peptid s molekulární velikostí 1,8 kda izolovaný z Boophilus microplus (Ciprandi a kol., 2006). Inhibuje tvorbu fibrinové sraženiny, trombinindukovanou agregaci krevních destiček, ale amidolytickou aktivitu trombinu nenarušuje. Váže se tedy na exosite trombinu I či II. Další antikoagulanty ze slinných žláz tohoto druhu jsou: 60 kda velký anti-trombin BmAP (Horn a kol., 2000), který se váže do aktivního místa i exosite trombinu a tím blokuje jeho aktivaci a inhibitor s dvěma Kunitz doménami boophilin, který není tak specifický. Kromě trombinu působí např. i na faktor VIIa (Macedo- Ribeiro, 2008). Ve střevě Boophilus microplus dochází také k inhibici trombinu. Střevní antikoagulant o velikosti 26 kda inhibuje trombinem indukovanou přeměnu fibrinogenu na fibrogen i trombinem indukovanou agregaci krevních destiček bez vazby na trombinovou aktivní stranu. Váže se tedy na jednu z exosite trombinu (Ricci a kol., 2007). 21

Variegin izolovaný z Amblyomma variegatum je jeden z nejmenších přírodních inhibitorů trombinu (32 zbytků). Je to peptid, který se váže na aktivní místo i exosite a i přes svou malou velikost to dělá s velkou afinitou. Aktivní místo trombinu inhibují aminokyselinové zbytky 8-14, zatímco exosite I inhibují zbytky 15-32 (Koh a kol., 2007). Americanin je další reverzibilní inhibitor trombinu izolovaný z Amblyomma americanum. Spadá mezi serpiny a kromě působení na trombin nevykazuje žádné jiné inhibiční aktivity (Zhu a kol., 1997). Dva inhibitory trombinu NTI-1 a NTI-2 byly izolovány také z nymf Hyalomma dromedarii (Ibrahimakol., 2001). Informace o primárních strukturách nejsou k dispozici. Mezi trombinové inhibitory pocházející z klíšťat patří i dva serpiny z Ixodes ricinus. Jedná se o IRIS (I. ricinus immuno suppressant) (Prevot a kol., 2006) a IRS-2 (I. ricinus serpin - 2) (Chmelař a kol., 2011). Oba serpiny inhibují trombin. IRS-2 inhibuje trombinem indukované srážení krevních destiček a IRIS prodlužuje čas fibrinolýzy či přilnavosti krevních destiček. 22

Druh Molekula Velikost (kda) Doména,vazba na trombin, lokalizace Inhibice trombinu Reference Amblyomma hebraeum Boophilus microplus Heamaphysalis longicornis Heamaphysalis longicornis amblin 14 Kunitz,exosite a AS, hemolymfa boophilin 14 Kunitz,exosite a AS, slinné žlázy hemalin 14 Kunitz,exosite a AS,střevo Madanin 1, 2 7 exosite,slinné žlázy Lai a kol., 2004 Macedo-Ribeiro a kol., 2008 Liao a kol., 2009 Iwanaga a kol., 2003 Heamaphysalis longicornis Hyalomma dromedari chimadanin 7 AS, slinné žlázy Nakajima a kol., 2006 NTI-I 3 AS, celé tělo Ibrahim a kol., 2001 Boophilus mircoplus Rhippicephalus heamaphysaloides Boophilus microplus microphilin 1,7 exosite, slinné žlázy rhipilin 14 Kunitz, slinné žlázy BmAP 60 Exosite, As, slinné žlázy Ciprandi a kol., 2006 Gao a kol., 2011 Horn a kol., 2000 Boophilus microplus Amblyomma variegatum Amlyomma americanum BmGTI 26 Exosite, střevo Rucci a kol., 2007 variegin 3-4 Exosite,slinné žlázy Koy a kol., 2007 americanin 12-16 Slinné žlázy Zhu a kol., 1997 Ixodes ricinus IRIS 41 Slinné žlázy Prevot a kol., 2006 Ixodes ricinus IRS-2 42 Slinné žlázy Chmelař, 2011 Tab.3. Inhibitory koagulační kaskády ze zástupců Ixodidae (upraveno podle Chmelař a kol., 2011). 23

Inhibice faktoru Xa a dalších faktorů Zajímavá proteinová multigenní rodina, skládající se z desítek homologů, byla objevena zejména u tří druhů rodu Ixodes. Tato rodina se označuje jako BTSP (basic tail secreted proteins), protože jejich C-konec se skládá hlavně z lysinu. Do této rodiny patří antikoagulační faktor z Ixodes scapularis - Salp14 (salivary protein). Tento protein účinkuje pouze proti faktoru Xa a žádné další proteázy neinhibuje (Narasimhan, 2002). Kromě tohoto faktoru byl u I. scapularis objeven ixolaris, který se váže na komplex TF/VIIa a inhibuje tak iniciaci koagulační kaskády (Francischetti a kol., 2002). Obsahuje dvě Kunitz domény a je specifický především pro larvální stádia. Po připevnění larvy k hostiteli rychle poklesla inhibiční aktivita ve žlázách, nejspíše v důsledku sekrece inhibitorů proteáz do hostitele. Také ze slinných žláz Rhipicephalus appendiculatus byl izolován 65 kda veliký inhibitor serinových proteáz. Je to mírně basický serpin, obsahující disulfidické můstky, které jsou důležité pro jeho aktivitu proti fxa. Působí na jiném místě molekuly než je aktivní místo faktoru Xa (Mulenga a kol., 2002). Další antikoagulanty namířené proti faktoru Xa byly izolovány z Ixodes ricinus (ixodin), Hyalomma dromedarii a Hyalomma truncatum. Jejich primární struktura však není objasněna (Joubert a kol., 1995; Ibrahim a kol., 2001). Inhibují vnější i vnitřní koagulační cestu. Druh Molekula Velikost (kda) Doména, vazba na trombin, lokalizace Inhibice fxa Ixodes scapularis Salp1a 14 BTSP rodina, AS, slinné žlázy Reference Narasimhan a kol., 2002 Ixodes ricinus IRIS 41 Slinné žlázy Prevot a kol., 2006 Inhibice FVIIa/TF Ixodes scapularis ixolaris 14 Kunitz, slinné žlázy Francischetti a kol., 2002 Inhibice fvii Boophilus microplus boophilin 14 Kunitz, slinné žlázy Macedo-Ribeiro a kol., 2008 Tab.4. Inhibitory koagulační kaskády izolované ze zástupců Ixodidae (upraveno podle Chmelař a kol., 2011). 24

7.3.1.2. Čeleď Argasidae Klíšťáci jsou hnízdní paraziti, přičemž jednotlivý zástupci vykazují poměrně velkou hostitelskou specifitu. Tato čeleď zahrnuje 3 hlavní rody: Argas, Ornithodoros a Carios. Rod Argas se živí především na ptácích, Ornithodoros na savcích a Carios na ptácích, netopýrech i savcích (Klompen a kol., 1996; Barker a Murrell, 2004). Na lidech sají jen výjimečně, v nepřítomnosti primárních hostitelů. Na rozdíl od klíšťat, kteří sají hodiny až dny, se klíšťácizdržují na hostiteli pouze v rozmezí několika minut. Obr.3. Schematický přehled hemostatických mechanismů, na které jsou zaměřeny slinné proteiny Ixodida (upraveno dle Chmelař a kol., 2012). Inhibice trombinu Z druhu Ornithodoros moubata byl izolován antikoagulant ornithodorin, který obsahuje dvě Kunitz domény a působí proti trombinu (van de Locht a kol., 1996). Nefunguje však na klasickém mechanismu inhibitorů Kunitz typu. Obvykle se reaktivní smyčka (RSL) váže do reaktivního místa trombinu. Ornithodorin do aktivního místa trombinu neváže RSL, nýbrž N-koncové zbytky. C-koncové zbytky se vážou na exosite 1, které dále interaguje s fibrinogenem (van de Locht a kol., 1996). Na podobném principu funguje inhibice trombinu i 25

u dalších zástupců z čeledi Argasidae. Jedná se např. o savignin z Ornithodoros savignyi (Nienaber a kol., 1999) nebo monobin z Argas monolakensis (Mans a kol., 2008). U antikoagulantu monobinu jde o kompetitivní inhibici. V případě interakce trombin - monobin existují dvě vazebná místa na trombinu (aktivní místo a exosite vázající fibrinogen) a dvě vazebná místa na monobinu (N a C - termínální konce BPTI domény). Dokáže inhibovat vnější (aptt) i vnitřní cestu (PTT) koagulační kaskády. Antikoagulant monobin je ortolog ornithodorinu a savigninu. Antikoagulační faktory se tedy vyvíjely v rodové linii klíšťáků a zároveň jsou udržovány u druhů klíšťáků dvou různých rodů s odlišnou hostitelskou preferencí (Mans a kol., 2007). Inhibice faktoru Xa U Ornithodoros moubata existuje kromě ornithodorinu také další antikoagulant Kunitz typu patřící do skupiny TAP (tick anticoagulant peptide) a působící proti faktoru Xa. Dokáže se navázat do aktivního místa faktoru Xa, bez vazby na proenzym X. Aktivní konformace faktoru X je tedy nezbytná k tomu, aby došlo k inhibici. Kinetická analýza prokázala, že TAP se nejprve váže na vnější stranu faktoru Xa a dále pokračuje na jeho aktivní místo. Faktor Xa je inaktivován a koagulační kaskáda se zastavuje. Strukturní podobnosti mezi těmito antikoagulanty však nebyly prokázány. Molekuly mají podobnou pouze inhibiční kinetiku. Tento peptid ze skupiny TAP vykazuje specifickou aktivitu proti fxa a dále již proti žádným jiným enzymům z koagulační kaskády (Gaspar a kol., 1996). 7.3.2. Heteroptera Mezi ploštice patří parazitičtí i neparazitičtí zástupci. Nejvýznamnější hematofágové patří do čeledí Reduviidae, Cimicidae a Polyctenidae. Rody z čeledi Reduviidae: Triatoma, Rhodnius a Panstrongylus jsou přenašeči prvoka Trypanosoma cruzi, který je původcem Chagasovy nemoci. Rhodnius prolixus šíří onemocnění především v severní části Jižní Ameriky (Schofield, 1994), Triatoma infestans se objevuje v celém jihovýchodním regionu Jižní Ameriky (Forattini a kol., 1982) a Triatoma brasiliensis je široce rozšířený v severovýchodní Brasílii (Gonçalves a kol., 2009). 26