PROTEOMIKA CERVIKÁLNÍHO HLENU A VZTAH K REPRODUKCI Autor: Eliška Konupková Úvod Cervikální hlen má významnou roli v ochraně vnitřního prostředí dělohy. Nejen že řídí průchod spermií při ovulaci a mimo ni, ale také brání proniknutí infekce do dělohy a během gravidity ochraňuje před infekcí i plod. V jeho složení převažuje voda (95-99%) a dále se zde nacházejí ionty, enzymy, baktericidní látky, plazmatické proteiny a muciny [10]. Obsah jednotlivých látek se mění s menstruačním cyklem ženy. Cylindrické epiteliální buňky jsou pod vlivem nejprve hormonu estrogenu a později progesteronu. Na počátku cyklu je hlen hustý a viskózní a tím tvoří bariéru proti vstupu spermií do dělohy [1]. Těsně před ovulací sekreční buňky produkují mnoho řídkého vodnatého hlenu, který umožňuje proniknutí spermií do uteru, po ovulaci vlivem progesteronu se hlen opět 10 až 20krát zredukuje a zhoustne [10]. Zároveň se kolem ovulace mění prostředí cervixu z nepříznivého pro spermie na vyhovující [2]. Neplodnost žen Neplodnost je ve společnosti stále větším problémem, v současnosti postihuje 10 15 % párů. WHO ji definuje jako stav, kdy žena není schopna otěhotnět během 12 měsíců pravidelného nechráněného pohlavního styku. Dělí se na primární, kdy žena nebyla ani jednou těhotná, a sekundární, která se vyskytne až po porodu, potratu, či mimoděložním těhotenství. Příčinou bývá ovariální faktor porucha funkce vaječníků, tuboperitoneální faktor, kam patří poškození či chybění vejcovodů a srůsty v okolí adnex, dále endometrióza, děložní faktor (změny dělohy), cervikální faktor (změny hlenu, anatomie, záněty), imunologické a psychogenní příčiny [12]. In vitro fertilizace (IVF) Jedná se o základní metodu asistované reprodukce, která je zahájena hormonální stimulací ovarií. Stimulované folikuly jsou následně punktovány a oplozeny předem připravenými spermiemi. Mezi druhým až šestým dnem po oplození jsou vybrána nejvhodnější embrya pro transcervikální embryotransfer do dutiny děložní, nebo kryokonzervaci [12]. Změny ve složení cervikálního hlenu S fázemi menstruačního cyklu se mění i množství proteinů ve hlenu - během ovulace vlivem estrogenu probíhá největší proteosyntéza [4]. Hlavními funkcemi všech nalezených proteinů
byl buněčný pohyb, imunitní odpověď, buněčná smrt, signalizace mezi buňkami a buněčná stavba a organizace [14]. Výskyt a množství některých látek je možno spojit přímo s konkrétními patologickými stavy provázejícími graviditu. Jedná se například o zvýšené hladiny fetálního fibronektinu [9], či snížené hladiny prozánětlivých cytokinů [5], které předpovídají předčasný porod. Další podrobnější analýza vzorků pacientek v jednotlivých trimestrech gravidity by mohla mít užitečné výsledky pro posuzování zdraví matky a plodu [3]. Imunologická funkce cervikálního hlenu Jak již bylo řečeno, cervikální hlen má důležitou imunologickou funkci. Po průniku spermií do dělohy musí odlišit, zda se jedná o nebezpečný patogen, či o alogenní spermii nezbytnou pro reprodukci. Hladinami cytokinů se zabývá mnoho studií. Je například prokázáno, že po inseminaci stoupá hladina IL-8, což má za následek vzrůst populace neutrofilů, a tak dojde k úmrtí velkého množství spermií [15]. Další studie popisuje pokles produkce IL-6, IL-8 a endogenních antimikrobiálních látek uprostřed cyklu a jejich následné nízké hladiny až do počátku menstruace [6, 16]. Produkce cytokinů závisí na mnoha endogenních a exogenních faktorech, kam patří například věk, fáze hormonálního cyklu, přítomnost ektropia, infekce, kouření či kontakt s ejakulátem během pohlavního styku [7]. Obranu dělohy dále zajišťují haptoglobin, defensiny, laktoferin, azurocidin a dermicidin [14]. Současné pokusy o nalezení biomarkeru pro použití při IVF Doposud byl již hledán marker pro použití při metodě IVF pouze v obsahu proteinů v endometriu a děložní tekutině. Tento výzkum zároveň porovnává data s jinými studiemi, a tak získává přehled o složení proteinů u těhotných a netěhotných žen, v proliferační a sekreční fázi cyklu a u receptivního a proreceptivního endometria. Zvláštní pozornost věnuje proteomice v době implantace. Implantaci zahajují především změny vnější vrstvy trofoektodermu a epitelu endometria, v jejichž důsledku dojde k molekulárním změnám děložního sekretu. Ten obvykle obsahuje nutriety, cytosiny, antiproteázy a transportní proteiny s biologicky aktivními faktory [8]. Neméně důležité změny taktéž probíhají v mucinech, integrinech a dalších adhezivních molekulách na vnitřní ploše epitelu [11]. Již dřívější studie označily Leukemia inhibitory factor a PC6 jako nezbytné pro implantaci. Dále byly zkoumány kvantitativní rozdíly v cytokinech mezi uměle stimulovaným cyklem a přirozeným u těhotné ženy a byly identifikovány IL-1β a TNF-α jako možné ukazatele gravidity [13].
Metodika Tato studie bude zkoumat vzorek cca 100 žen do 35 let s primární i sekundární neplodností, které podstupují 1. nebo 2. IVF cyklus s dlouhým analogovým protokolem (stimulace pomocí FSH a agonisty gonadotropin uvolňujícího hormonu (GnRH), po kterém následuje embryonální transfer 1 embrya ve stadiu blastocysty. Po IVF vzniknou dvě skupiny pacientek těhotné (HCG pozit.) a netěhotné (HCG negat.). Odběr hlenu bude proveden dvakrát, a to v den ukončení hormonální stimulace a následně v den odběru oocytů, a následně analyzován a porovnáván na Ústavu molekulární a translační medicíny LF UPOL. Tabulka č. 1: Kritéria pro výběr pacientek Kriteria pro zařazení do studie: věk ženy do 35 let pravidelný menstruační cyklus (25 35 dnů) délka neplodnosti do 5 let nekuřačka reaktivní vaječníky spermie získané z ejakulátu méně než 3 selhání v cyklech asistované reprodukce, zahrnující čerstvý IVF/intracytoplasmatická injekce spermie ICSI embryo transfer cyklus a/nebo zamražené, rozmražené embryo transfer cyklus BMI 19 29 kg/m 2 FSH < 10 IU/I třetí den cyklu počet antrálních folikulů 5 15 standardní stimulační schéma agonisty gonadotropin uvolňujícího hormonu ve dlouhém protokolu Vylučující kritéria: genetické onemocnění metabolické a/nebo endokrinní onemocnění (DM, metabolický syndrom, syndrom polycystických ovarií definovaný dle Rotterdamských kritérií, hyperprolaktinemie, onemocnění štítné žlázy) endometriosa nebo adenomyosa v anamnéze předchozí gynekologicko/pánevní chirurgické zákroky s výjimkou salpingektomie opakované spontánní aborty (2 a více) zisk méně než 5 oocytů v předchozím cyklu a/nebo sérové hodnoty anti- Mülleriánského hormonu < 0,5 miu/l předchozí ovariální hyperstimulační syndrom přítomnost jakékoli strukturální abnormality reprodukčního ústrojí
dárcovství spermií i oocytů vážný mužský faktor neplodnosti < 5 milionů spermií/ml sérové hladiny estradiolu < 1000 pg/ml (3671 pmol/l) nebo < 4000 pg/ml (14680 pmol/l) v den aplikace cg počet získaných oocytů < 5 a > 20 nízký fertilizační potenciál (oplodnění < 20 %) jiný než elektivní single embryo transfer kvalitní blastocysty IVF cyklus zrušený před embryotransferem Cíle výzkumu: Cílem studie je nález vhodných markerů bílkovinné povahy, které by bylo možno použít pro zvýšení šance úspěchu při IVF. Současné výsledky IVF dávají párům šanci okolo 45 % pravděpodobnosti úspěchu a snahou je tuto pravděpodobnost zvyšovat. Závěr: Cervikální hlen je prokazatelně dobrým zdrojem širokého spektra látek, jejichž výskyt a množství odráží současný stav dělohy. Z tohoto důvodu je možné, že zde díky této studii bude nalezen marker, který by mohl ovlivnit prognózu současné léčby pomocí IVF. Seznam použité literatury [1] BIGELOW J. L., DUNSON D. B, STANFORD J. B., ECOCHARD R., GNOTH C., COLOMBO B. Mucus observations in the fertile window: a better predictor of conception than timing of intercourse. Hum. Reprod., 2004, 19(4): 889. [2] CHANTLER E., SHARMA R., SHARMA D. Changes in cervical mucus that prevent penetration by spermatozoa. Symp. Soc. Exp. Biol., 1989, 43: 325.
[3] DASARI S., PEREIRA L., REDDY A. P., MICHAELS J. E. A., XINFANG L., JACOB T., THOMAS A., RODLAND M., ROBERTS C. T., GRAVETT M. G., NAGALLA S. R. Comprehensive Proteomic Analysis of Human Cervical-Vaginal Fluid. Journal of Proteome Research 2007, 6: 1258-1268. [4] GRANDE G., MILARDI D., VINCENZONI F., POMPA G., BISCIONE A., ASTORRI A. L., FRUSCELLA E., DE LUCA A., MESSANA I., CASTAGNOLAB M., MARANA R. Proteomic characterization of the qualitative and quantitative differences in cervical mucus composition during the menstrual cycle. Mol. BioSyst. 2015, 11: 1717 1725. [5] KALINKA J., SOBALA W., WASIELA M., BRZEZINSKA-BLASZCZYK E. Decreased proinflammatory cytokines in cervicovaginal fluid, as measured in midgestation, are associated with preterm delivery. American Journal of Reproductive Immunology. 2005; 54: 70-76. [6] KELLER M. J., GUZMAN E., HAZRATI E., KASOWITZ A., CHESHENKO N., WALLENSTEIN S., COLE A. L., COLE A. M., PROFY A. T., WIRA C. R. PRO 2000 elicits a decline in genital tract immune mediators without compromising intrinsic antimicrobial activity. AIDS. 2007, 21: 467-476. [7] KYONGO J. K., JESPERS V., GOOVAERTS O., MICHIELS J., MENTEN J., FICHOROVA R. N., CRUCITTI T., VANHAM G., ARIEN K. K. Searching for lower female genital tract soluble and cellular biomarkers: defining levels and predictors in a cohort of healthy Caucasian women. PLoS One. 2012, 7, e43951. [8] LEESE H. J., HUGENTOBLER S. A., GRAY S. M., MORRIS D. G., STURMEY R. G., WHITEAR S. L. et al. Female reproductive tract fluids: composition, mechanism of formativ and potential role in the developmental origins of health and disease. Reproduction, Fertility and Development. 2008, 20: 1 8. [9] LOCKWOOD C. J., SENYEI A. D., DISCHE M. R., CASAL D., SHAH K. D., THUNG S. N., JONES L. DELIGDISCH L., GARITE T. J. Fetal fibronectin in cervical and vaginal secretions as a predictor of preterm delivery. N Engl J Med. 1991 Sep 5;325(10):669 674. [10] MARTYN F., MCAULIFFE F. M., WINGFIELDM. The role of the cervix in fertility: is it time for a reappraisal? Human Reproduction. 2014, 29: 2092-2098.
[11] QUENBY S., ANIM-SOMUAH M., KALUMBI C., FARQUHARSON R., APLIN J. D. Different types of reccurent miscarriage are associated with varying patterns of adhesion molekule expression in endometrium. Reproductive Biomedicine Online. 2007, 14: 224 234. [12] ROB L., MARTAN A., CITTERBART K. Gynekologie. 2. vyd. Praha: Galén, 2008. ISBN 978-80-7262-501-7 [13] SALAMONSEN L. A., EDGEIL T., ROMBAUTS L. F. K., STEPHENS A. N., ROBERTSON D. M., RAINCZUK A., NIE G., HANNAH N. J. Proteomics of the human endometrium and uterine fluid: a pathway to biomarker discovery. Fertility and Sterility. 2013, 99: 1086 1092. [14] SHAW J. L. V., SMITH C., R., DIAMANDIS E. P. Proteomic Analysis of Human Cervico- Vaginal Fluid. Journal of Proteome Research 2007, 6: 2859-2865. [15] THOMPSON L. A., BARRATT C. L., BOLTON A. E., COOKE I. D. The leukocytic reaction of the human uterine cervix. American Journal of Reproductive Immunology. 1992, 28: 85-89. [16] WIRA C. R., FAHEY J. V., SENTMAN C. L., PIOLI P. A., SHEN L. Sex hormone regulation of innate immunity in the female reproductive tract: the role of epithelial cells in balancing reproductive potential with protection against sexually transmitted pathogens. American Journal of Reproductive Immunology. 2010, 63: 544-565. Seznam tabulek Tabulka č. 1: Kritéria pro výběr pacientek