Sigma-Aldrich-aktuáně

Sigma-Aldrich-aktuáně

Sigma-Aldrich

Katalogy

The Reporter for Europe, Analytix Bezplatně SPE, SPME GC, HPLC Standardy Činidla Mikrobiologie Akce platí v ČR i SR 4

5

6 Speciální akce - únor

7

8

9

10

11 Brožury SPE

12 3M Empore Products

13 SupelMIP Solid Phase Extraction

SPME SPME CD Nové odkazy 14

15 Air Monitoring

Aktivní vzorkování Desorpce rozpouštědlem LpDNPH pro vzorkování aldehydů a ketonů ORBO ORBO PUF emisní vzorkovací trubičky pro rtuť Termální desorpce trubičky pro Dynatherm, Gertsel, Perkin Elmer, Tekmar Trubičky s barevným indikatorem (MSA/Auer) Vzorkovací pytle a myši 16

Trubičky LpDNPH Orbo PUF Trubičky pro termální desorpci Trubičky pro desorpci rozpouštědly Detekční trubičky Tedlar vaky Skleněné odběrové nádoby Další příslušenství 17

Pasivní vzorkování radiello Analyt Aldehydy (chemisorpce na 2,4-DNPH) VOCs/BTEX CS 2 chem. des. (aktivní uhlí) VOCs/BTEX tepelná desorpce (grafitický uhlík) NO 2 /SO 2 /HF (chemisorpce na triethanolamin) O 3 (chemisorpce na 4,4 -dipyridylethylen) H 2 S (chemisorpce na octan zinečnatý) NH 3 (chemisorpce na kys. fosforečnou) HCl (adsorpce na silikagel) Anestetika (adsorpce na aktivní uhlí/mol. síto) Stanovení Chromatografie Chromatografie Chromatografie fotom. / IC / Ion sel. elektroda Fotometrie Fotometrie Fotometrie Ion Chromatography TD/GC 18 Detaily jsou v radiello CD

19 GC

GC KOLONY 20

21

22 HPLC

Brožury HPLC 23

Laboratorní chemikálie Organická rozpouštědla,pufry, kyseliny, báze, soli, etc..

Nová generace GC kolon na bázi iontových kapalin RNDr. Dana Procházková

26 SUPELCO

Aplikace v plynové chromatografii Petrochemie plyn, ropa, produkty po rafinaci, bionafta Biochemie, farmacie, soudní chemie FAME, zbytková rozpouštědla, drogy, požářiště Potraviny a nápoje FAME, barviva a vůně, pesticidy,. Životní prostředí pitná,odpadní a povrchová voda, odpady, půdy Sledování ovzduší sledování vnitřních a venkovního ovzduší, kontrola emisí Chemie kontrola jednotlivých kroků syntéz 27

GC stacionární fáze Polysiloxanové polymery Začínají v na počátku 50. let, mnohokrát vylepšovány Nejběžnější fáze: -1, -5, -20, -1701, -35, -50, -2330, -2380, -2560 Polyethylenglykoly Začínají v polovině 50. let, několikrát vylepšovány Nejběžnější fáze : obsahují wax nebo PEG v názvu R 1 R 3 HO Si O Si O H O CH2 CH2 n 28 R 2 R 4 x R = metyl, fenyl, fluoropropyl, a/nebo cyanopropyl x,y = procento v celkovém složení polymeru y n = počet opakujících se monomerových jednotek v polymeru např. Carbowax 20M (nejčastěji užívaný) má MW 20 000

Stacionární fáze, jejich polarita a tepelná stabilita 360 C -1-5 310 C -20-1701 -35-50 280 C Wax (PEG) 275 C 250 C 145 C -2331-2560 TCEP Non-Polar Intermediate Polar Polar Highly Polar 0 15 25 50 100 GC kolony stupnice polarity 0 = squalane (nejméně polání GC stacionární fáze) 100 = TCEP (1,2,3-tris(2-cyanoethoxy)propane (nejpolárnější GC stacionární fáze) 29

Omezení konvenční 1D-GC Nedostatečná separace/citlivost při stanovení analytů u komplexních vzorků Složky aroma (např. aroma kávy: 600 700 sloučenin) Kontaminanty (PCB: 209 kongenerů, pesticidy) Chybná / nemožná identifikace analytů Nadhodnocení / podhodnocení výsledků Rešení Multidimensionální systém (heart-cut, kompletní dvourozměrná GC) Nové detekční techniky 30

Kompletní dvourozměrná GC (GC GC) Dvě kolony s odlišnou selektivitou spojeny modulátorem Injektor Modulátor Detektor 31 Primární kolona Obvykle narrow bore (nepolární) kolona (30 m 0,25 mm 0,25 µm) Sekundární kolona Obvykle microbore (polární) kolona (1 m 0,10 mm 0,10 µm)

KOMPLETNÍ DVOUROZMĚRNÁ GC Modulátor přenáší v pravidelném intervalu část efluentu z 1. kolony Kryogenicky zaostřené části jsou přeneseny na 2. kolonu Rychlá separace na 2. koloně Modulace (kryogenní zaostření) 32 Efluent z 1. kolony Efluent z 2. kolony

TVORBA GC GC CHROMATOGRAMU 1D chromatogram (výstup z první kolony) MODULACE Základní 2D chromatogram (výstup z druhé kolony) TRANSFORMACE 2D chromatogramy naskládané vedle sebe 33 Vrstevnicový půdorys 2D chromatogramu VIZUALIZACE

VÝHODY GC GC vs. 1D-GC Zvýšení kapacity píků Zlepšení detekce Tvorba strukturovaných chromatogramů 34

VÝHODY GC GC vs. 1D-GC Zvýšení kapacity píků (n c ) Maximální počet chromatografických píků, které je možné uspořádat za sebou do separačního prostoru (chromatogramu) zvýšení separační účinnosti 1. Dimenze 2. Dimenze Konvenční kapilární kolona n = 1 000 n c (celk) = n c (kolona 1) n c (kolona 2) GC GC (kolona druhé dimenze: n = 25) n = 1 000 25 = 25 000 35

Strukturované chromatogramy 36 Doplňující se separační mechanismy na obou kolonách GCxGC chromatogramy vykazují uspořádanost (přítomnosti charakteristických skupin) Specifické interakce Separace podle polarity Systém: nepolární polární kolony Separace podle bodu varu Tlak par (Těkavost)

aniont CF 3 O=S=O N - O=S=O CF 3 GC kolony s fází na bázi iontových kapalin cation linkage cation N + N N + N anion CF 3 O=S=O N - O=S=O CF 3 1,9-bis(3-vinylimidazolium)nonan-bis(trifluormethansulfonamidát) anorganické soli s teplotou tání nižší než pokojová teplota málo těkavé, stabilní až do 380 C určené pro analyty s širokým rozsahem polarit 37

Stanovení polarity GC kolon s iontovými kapalinami 38 P (Polarity) = sum of the first 5 McReynolds Constants. P.N. (Polarity Number) = Polarity (P) normalized to SLB-IL100 (set at 100). sigma-aldrich.com/il-gc

Stacionární fáze, jejich polarita a tepelná stabilita -Octyl 280 C -1 350 C -5 360 C -20 300 C -1701 280 C -35 300 C -50 310 C -225 240 C PAG 220 C PEG 280 C -2330 250 C -2331 275 C -2560 250 C TCEP 145 C Non- Polar Intermediate Polar Polar Highly Polar Extremely Polar 0 25 50 75 100 SLB-IL59 300 C SLB-IL76 270 C SLB-IL82 270 C SLB-IL100 230 C SLB-IL111 270 C 39 sigma-aldrich.com/il-gc

Mastné kyseliny a jejich methylestery Biochemie, farmacie, soudní chemie 1950 A.J.P. Martin laboratoře the National Institute for Medical Research at Mill Hill, Londýn G. Popjak studuje metabolismus mastných kyselin A.J.P. Martin a A.T. James navazují na poznatky z roku 1941 (Martin, Synge) separace mastných kyselin (C1-C12) až do C22 problém je nízká stabilita stacionárních fází při vyšších teplotách 1958 stacionární fáze Reoplex 400 (polyesterové změkčovadlo) 1959 první kapilární kolony a FID separace cis-trans izomerů nenasycených mastných kyselin aplikace potraviny (falšování rostlinných olejů) identifikace bakterií analýza FAME z buněčných stěn (knihovna 1500) přímá analýza triglyceridů klastry píků 40

41 FAME na náplňové koloně

42 1990 Omegawax 320

FAME Mix Omegawax 250 column: Omegawax 250, 30 m x 0.25 mm I.D., 0.25 µm (24136) 43 oven: 50 C (2 min.), 4 C/min. to 220 C (15 min.) inj.: 250 C det.: FID, 260 C helium, 30 cm/sec @ 205 C injection: 1 µl, 100:1 split sample: Supelco 37-Component FAME Mix (47885-U), analytes at concentrations indicated in methylene chloride

SLB-IL100 37-Component FAME Mix Shows the great selectivity for FAMEs by degree of unsaturation, allowing for increased resolution cis/trans isomer separations possible 44 column: SLB-IL100, 30 m x 0.25 mm I.D., 0.20 µm (28884-U) Low bleed and a oven: 50 C, 3.0 C/min. to 240 C stable baseline inj.: 240 C det.: FID, 240 C carrier gas: helium, 40 cm/sec constant injection: 1 µl, 50:1 split sample: Supelco 37-Component FAME Mix (47885-U), analytes at concentrations indicated in methylene chloride

Brožury HPLC 45

Obsah HPLC nosiče Silikagel Trendy vývoje Totálně porézní silikagel versus povrchově porézní silikagel Zmenšování velikosti častic sorbentu a problematika nárůstu tlaku Převod metod Stacionární fáze C18 - nejpoužívanější stacionární fáze Alternativní stacionární fáze k C18 Problematika MF s nízkých obsahem organické složky LC-MS Péče o kolony Závěr 46

Typy HPLC nosičů HPLC nosiče Anorganické oxidy Polymery Uhlík Silikagel Alumina Titania Zirconia (oxid křemičitý) (oxid hlinitý) (oxid titaničitý) (oxid zirkoničitý) PS/DVB PVA Polymetakrylát 47

Silikagel SiO SiO vlastnosti vlastnosti Hodnota 2 Hodnota 2 Hustota (g/ml) 2 Hustota (g/ml) 2 Plocha povrchu (m 2 /g) Plocha povrchu (m 2 ~100-500 /g) ~100-500 Velikost pórů (Å) ~100-300 Velikost pórů (Å) ~100-300 Porozita (ml/g) 0.9 Porozita (ml/g) 0.9 Velikost částic (µ) sub 2, 3, 5, 10 Velikost částic (µ) sub 2, 3, 5, 10 48 Nejčastěji používaným nosičem jsou porézní, sférickéčástice silikagelu. Amorfní síť polymerního oxidu křemičitého. Výhody: mechanicky stabilní, reaktivní, velká plocha povrchu. Nevýhody: reaktivní zbytkové silanolové skupiny, rozpustný při vysokém ph, při nízkém ph hrozí hydrolýza vazby u chemicky vázané fáze.

Historie vývoje HPLC nosičů 49 Majors R. E.: Fast and Ultrafast HPLC on Sub-2µm Porous Particles, LC-GC Europe June 2006

Vývoj v oblasti HPLC nosičů na bázi silikagelu 70s 80s 90s současnost 10µ 5µ 3µ sub-2µ nebo Fused-Core Proč se zkoušejí stále menší částice? snaha o dosažení vyšší účinnost separací lepší rozlišení díky uzším a vyšším píkům 50

Zmenšov ování častic přin ináší rychlejší nárůst tlaku než nárůst účinnosti a rozlišen ení P 1 2 d p N 1 d p 51 Lze dosáhnout stejné účinnosti jakou poskytují sorbenty sub-2µm za tlaku do 400 barů?

Vysokoúčinn inná kapalinová chromatografie HPLC High Performance Liquid Chromatography vysokoúčinn inná (vysoce vysoceúčinn inná) kapalinová chromatografie 3-10 µm různ zné,, tlak do 400 barů RRLC Rapid Resolution Liquid Chromatography rychle rozlišovac ovací kapalinová chromatografie 1,8 µm - porézn zní směsn sné,, tlak do 600 barů UPLC Ultra Performance Liquid Chromatography extrémn mně účinn inná kapalinová chromatografie UPLC: sub 2 µm - porézn zní unif., tlak do 1500 barů UHPLC Ultra High Pressure Liquid Chromatography vysokotlaká kapalinová chromatografie 1,0 µm neporézn zní,, tlak do 5000 barů 52

Povrchově porézn zní částice versus zcela porézn zní částice stice: 0.5 µm Difuzní vrstva 1.5 µ 2.7 µm 1.7 µm 53 Fused-Core is a trademark of Advanced Materials Technology Inc. Ascentis is a trademark of the Sigma-Aldrich Corp.

Ascentis Express Fused-Core tm specifikace Sorbent: vysoce čistý silikagel 1.7 µ neporézní jádro a 0.5 µ porézní vrstva jsou type B Velikost částic: 2.7 µ Distribuce velikosti částic: 2.7 +/- 0.16 µ (6% standardní odchylka*) Velikost pórů: 90 Å Velikost povrchu: 150 m²/g (220-300 m²/g efektivní) ph rozsah: 2 9 (minimálně) Limitní tlak: 600 barů (testováno na UHPLC) LC-MS: vysoce kompatibilní 54 * Typický rozsah pro malé totálně porézní částice je 15-20% standardní odchylka.

Distribuce částic 55

Účinnost versus velikost částic Columns: All C18, All 150 x 4.6mm Flow: 1.8mL/min Detection: 254nm Temp: 30 C Injection Vol: 5µL Analytes: 1. o-xylene (0.04mg/mL 2. p-xylene (0.01mg/mL 60 60 60 60 40 40 40 3µm 40 2.7µm Fused-Core 5µm 20 10µm 20 20 20 0 56 2.0 3.0 0 2.0 3.0 0 2.0 3.0 0 2.0 3.0

57 Výhody silikagelových častic s pevným jádrem

58 Výhody silikagelových častic s pevným jádrem

59 Výhody silikagelovýchčástic s pevným jádrem

Vysoké průtokové rychlosti, rychlé separace H = A + B/u + Cu P = 1000FηL P = πr 2 d 2 p 16,000 35.00 16,000 14,000 1.7 µm 30.00 12,000 HETP (µm) 25.00 20.00 15.00 Tlak (psi) 10,000 8,000 6,000 2.7 µm FC 10.00 4,000 3 µm 5.00 2.7 µm Ascentis Express 2,000 1 2 3 4 5 Průtoková rychlost MF (mm/sec) 2 4 6 8 10 12 Průtoková rychlost MF (mm/sec) 60

Ascentis Express UHPLC na klasických HPLC chromatografech Zpětný tlak versus průtoková rychlost Maximální limit 450 400 Pressure drop (bar) 350 300 250 200 150 Limit tradičních HPLC systemů N = >30,000 35 60 80 100 50 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2 2.4 2.6 2.8 3 3.2 3.4 3.6 3.8 4 Flow rate (ml/min) Experimentáln lní zavislost celkového zpětn tného tlaku jako funkce průtokov tokové rychlosti pro C18, 15 cm x 4.6 mm, 2.7 m Ascentis Express kolony při různých teplotách ch.. MF: 30:70 voda:acetonitril 61 Autor Prof. Luigi Mondello University of Messina

Rozlišen ení Velikost částic a maximální N Kolony s částicemi menší než 2-µm zvyšují 1.55 x rozlišení a 8 x tlak vzhledem k 5 µm sorbentům U kolon Ascentis Express 2,7-µm je zvýšení rozlišení také 1.55 x ale zvýšení tlaku 4 x vzhledem k 5 µm sorbentům Délka kolony dp N Rs faktor Tlak (psi) Tlak (bar) 10cm 5µm 10 000 1 750 50 10cm 3µm 14 000 1,18 2250 150 10cm 2.7µm FC 24 000 1,55 2800 190 10cm 1.7µm 24 000 1,55 6000 400 62

Zpětný tlak na kolonách Ascentis Express Ascentis Express kolony mají obecně poloviční zpětný tlak než kolony se sub-2µm částicemi ale jaký zpětný tlak můžeme ve skutečnosti očekávat? Ascentis Express se mohou používat, jak pro tradiční HPLC, tak i pro UHPLC chromatografy. Nicméně otázkou zůstavá, do jakého tlaku se dá na klasických (600-bar) přístrojích měřit a kdy už by měl analytik přejít na UHPLC? Na následujících dvou obrázcích budou uvedeny tlaky, které můžete při určitém složení MF očekávat. 63

Podmínky testování Ascentis Express C18 kolony v různých rozměrech byly instalovány do klasického HPLC chromatografu (400-bar). Zpětný tlak byl zaznamenávám při jednotlivých průtokových rychlostech, a to se dvěma MF(40% acetonitrile) a vysoce viskozní MF(60% metanol). Zpětný tlak byl měřen na výstupu z kolony. Data byla měřena při pokojové teplotě. Uvedená data jsou uvádějí celkový tlak; tlak systému se neodečítá. Zpětný tlak je uváděn v barech. 64

Zpětný tlak MF: 40% acetonitril 40% Acetonitril ml/min: ID L 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.8 1.0 1.2 1.5 2.0 2.5 3.0 2.1 150 130 250 365 470 568 >600 3.0 150 66 130 194 254 319 376 494 600 4.6 150 40 76 114 150 186 223 293 357 432 527 >600 2.1 50 55 109 162 212 262 308 400 490 577 >600 3.0 50 36 68 99 131 162 191 251 306 363 446 572 >600 4.6 50 25 45 65 86 105 125 165 205 245 303 400 493 572 system: 18 29 41 52 64 75 100 124 149 185 245 300 350 65 < 480 bar 480 bar 540 bar Zelená barva označuje tlaky do 80% tlakového limitu přístroje, oranžová 80 % nebo lehce nad 80% limit; červená 90% nebo lehce nad 90% tlakového limitu přístroje (600 bar). Pokud se tlak dostene nad tuto hodnotu, je doporučeno přejít UHPLC system.

Zpětný tlak MF: 60% metanol 60% Metanol ml/min: ID L 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.8 1.0 1.2 1.5 2.0 2.5 3.0 2.1 150 190 375 548 >600 3.0 150 113 221 324 427 531 >600 4.6 150 64 126 184 246 304 366 480 586 >600 2.1 50 95 183 269 350 425 504 >600 3.0 50 58 112 165 217 266 318 419 505 >600 4.6 50 41 76 112 150 185 219 290 354 421 510 >600 system: 27 47 67 88 107 129 170 210 250 305 365 412 465 66 < 480 bar 480 bar 540 bar Zelená barva označuje tlaky do 80% tlakového limitu přístroje, oranžová 80 % nebo lehce nad 80% limit; červená 90% nebo lehce nad 90% tlakového limitu přístroje (600 bar). Pokud se tlak dostene nad tuto hodnotu, je doporučeno přejít UHPLC system.

Převod metod 67

Rychlá LC versus tradiční HPLC (3 mm vnitřní průměr) 5 µ porézní Column: 5µ C18; 3 x 150 mm Flow: 0.4 ml/min Mobile Phase: 20:80, water : acetonitrile Inj: 1.5 µl Temp: 35 C Pressure: 885 psi (61 bar) N (naphthalene) : ~11000 k (naphthalene) : 1.78 1.5 ml celkový objem 1.0 2.0 3.0 4.0 Time (min) elution order: Fused-Core (zelená chromatografie) uracil, phenol, acetophenone, benzene, toluene, naphthalene Column: Ascentis Express C18; 3 x 50 mm Flow: 0.6 ml/min Mobile Phase: 31:69, water : acetonitrile Inj: 0.5 µl Temp: 35 C Pressure: 1750 psi (121 bar) N (naphthalene) : ~11000 k (naphthalene) : 1.75 Rs (acetophenone) : 3.2 0.5 ml celkový objem 68 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Time (min) 4x rychlejší analýza, 3x menší spotřeba rozpouštědel

Ascentis Express Fused-Core tm Stacionární fáze: C18 C8 RP-Amide Phenyl-hexyl HILIC (silikagel) F5 ES-C18 Kolony: Vnitřní průměr 2,1; 3,0; 4,6 mm Délka 3; 5; 7,5; 10; 15 Kapilární kolony: 75 µ x 50 mm 100 µ x 50 mm 200 µ x 50 mm 300 µ x 50 mm 75 µ x 150 mm 100 µ x 150 mm 200 µ x 150 mm 300 µ x 150 mm 69

Fázov zové systémy v kapalinové chromatografii Rozdělovací: normální (klasická x HILIC) reverzní fáze (klasická x semipolární) iontově párová (na reverzní fázi) Iontově výměnná (IE) katex, anex Chirální cyklodextrinové fáze Afinitní 70

Fázov zové systémy v kapalinové chromatografii Chromatografie v systémech s normálními fázemi <1% Chromatografie v systémech s obrácenými fázemi 75% Chromatografie iontové výměny 4% Chromatografie stérické výluky (gelová chromatografie) 7% Afinitní chromatografie <1% Chirální chromatografie 1.5% Source: HPLC in the Life Sciences. The 1997/8 US MSPPSA Series, Phortech International, Inc. (a) SEC and GPC not separated in this report 71

Stacionárn rní fáze C18 C8 Fenylové F5 RP-Amide CN HILIC (silikagel) 72

RP-HPLC C18 CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 10 CH 2 CH 2 CH 2 CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 10 CH 2 CH 2 CH 2 CH 3 CH 2 CH 3 CH 3 CH 2 CH 3 CH 3 CH 2 CH Si CHCH 2 CH 3 CH 3 CH 2 CH Si CHCH 2 CH 3 O OH OH OH O Silikagel 73

C18 s odstíněnými silanolovými skupinami Si OH O Si O Si O O Si Si O OH Si C18 Ligand O Si Odstínění O Volné silanolové skupiny 74

Odstínění zbytkových silanolových skupin Hydrofobní (Van der Waalsovy) interakce mezi analytem a stacionární fází Si OH 1.395 1.506 6.117 6.704 8.940 Si σ = 1.07 Si Si OH H 2 N 0 2 4 6 8 10 12 σ = 2.4 6.577 8.684 10.379 0 2 4 6 8 10 12 Sekundární 75 interakce (vodíková vazba) s nezreagovanými silanolovými skupinami

Kde C18 nestačí? Vyhovuje (50%) Mezní Nevyhovuje Problémy: Selektivita Překrývající se píky, eluce v pořadí nevhodném pro spolehlivou kvantifikaci Retence Malá, analyt eluuje téměř v mrtvém čase kolony. Nestabilní separace; nízké smočení stacionární fáze vlivem MF s nízkým obsahem organické složky. Tvar píků chvostující nebo s rozmytým čelem. Příliš vysoká retence a selektivita (použití gradientu). 76

77 Alternativnířešení v případech, kde C18 fáze nestačí

Mechanizmus zhroucení fáze C18 Si O Si O Si O H O Si O Si O Si O Si H 2 O H 2 O ACN ACN ACN H 2 O ACN 100% H 2 O Si O Si O Si O H O Si O Si O Si O Si H 2 O H 2 O H 2 O 78

Alternativy k C18 fázi Fáze s vloženou polární skupinou (PEP*, EPG**) Fenylové fáze Pentafluorofenylová fáze (PFPP) *PEP polar embedded alkyl phases 79 **EPG embedded polar group

Discovery a Ascentis TM F HS C18, C18 Si O Si CH 3 CH 3 (CH 2 ) 17 CH 3 HS F5 CH 3 Si O Si CH 3 F F F F RP-Amide Cyano CH 3 CH 3 Si O Si (CH 2 ) 3 CN Si O Si (CH 2 ) 3 NHCO(CH 2 ) 14 CH 3 CH 3 C8 CH 3 CH 3 Phenyl Phenyl-hexyl Si O Si (CH 2 ) 7 CH 3 80 CH 3

Retenční mechanism echanismy C18/C8 RP Amide Fenyl F5 Silikagel Hydrofobní/dispersní interakce Vodíkové můstky (donor/akceptor) Dipól-dipólová interakce π π donor π π akceptor Hydrofilní/iontová výměna? 81

Fenyl ylov ové fáze L Si L 19.5% C L Přítomnost aromatického jádra umožňuje π π interakci s dalšími aromáty π-donor Fáze s podobným chromatografickým chování jako fáze alkylové nebo EPG Je vysoce stabilní, vhodná pro všechny typy HPLC detektorů včetně MS 82

π π intera nterakce na fenylové fázi NO 2 π-π interakce způsobí významný rozdíl v selektivitě a retenci pro analyty, které obsahují aromatické jádro. Např. nitro skupina způsobí, že benzenové jádro se chová jako π-akceptor. Nitrobenzen Si Fenyl enylov ová fáze 83

π π interakce u analytů obsahujících ch různý počet NO 2 - skupin 2 1 3 4 Ascentis Phenyl 0 10 20 1 0 10 20 1 4 0 10 20 1 4 4 3 3 3 2 2 2 0 10 20 Kolona: : 150x4.6 mm 5 µm MF: : 50 % Metanol anol,, 50 % voda Průtokov toková rychlost: : 1.0 ml/min Detekce kce: : 254 nm 84 Teplota: : 40ºC Ascentis RPA Ascentis C8 Ascentis C18 π π interakce na fenyl enylov ové fázi mají významný vliv na selektivitu pro nitro skupiny. S rostoucím počtem skupin roste jejich retence. 1. Močovina ovina 2. Nitrobenzen 3. 1,4-dinitrobenzen 4. 1,3,5-trinitrobenzen

Pentafluorofenylová fáze Pentafluorofenylpropylová fáze (PFPP) Pracuje v obou módech RP a NP/ANP Retenční mechanismy Disperzní Dipole-dipole p-p interakce H-můstky - akceptor iontová výměna O Si δ - F δ - F δ + F δ - F F δ - δ - Discovery HS F5 85

Discovery HS F5 Pentafluorofenylpropyl fáze je fáze s mnohostranným využitím, s retenčním profilem ve tvaru písmene U a charakteristickou selektivitou. F F Si O Si F F F 86

Discovery HS F5 retenční profil RP NP Retence F5 C18 87 0 50 % organického modifikátoru v MF

Discovery HS F5 retenční profil F5- Retention vs % Organic Retention Time 80 60 40 20 0 RP NP 0 20 40 60 80 100 tr-methcathinone tr-ephedrine O OH N H H N % MeCN 88 Column: 15cm x 2.1mm 3µm Discovery HS F5;. Mobile Phase: 10mM NH4 Acetate, ph 6.8 : ACN; 0.2mL/min; Detection: 35 C; esi, pos.

Discovery HS F5 Co-elution Methcathinone Ephedrine C18 Ephedrine Impurity F5 Discovery HS F5 a HS C18, 15cm x 2.1mm, 3µm; CH3CN:octan amonný, ph 6.8 (70:30); 200µL/min; 35 C; esi (+) detekce, 2µL, koncentrace každého analytu 25µg/mL 89

Struktura hydrocortisonu a prednisolonu 90

F5 versus C18 91

Povrchově porézn zní versus porézn zní sorbent 92

RP-Amid Amidov ová fáze 19.5% C CH 3 (CH 2 ) 14 NH O L Si L L RP-Amide obsahuje 18 uhlíkových atomů + jeden v amido skupině Jednokroková připrava eliminuje přítomnost residuálních aminů Fáze je vysoce stabilní, vhodná pro všechny typy HPLC detektorů včetně MS 93

Porovnání retence a selektivity fází C18 a RP-Amide Ascentis Express 100x4.6mm, 35%ACN 65%water, 0.2% formic acid 1.8 ml/min, 230nm, 35C, 5uL, Ascentis Express C18 1 3 2 4 6 5 7 Phenols: 1. p-methoxyphenol 2. phenol 3. p-cyanophenol 4. p-fluorophenol 5. p-methylphenol 6. p-nitrophenol 7. p-chlorophenol 1 2 3 4 5 6 7 Ascentis Express RP-Amide 1.0 2.0 3.0 Time (min) 94

Vodíkov ková vazba versus hydro ydrofob obní reten etence 1. Nordoxepin 2. Protriptyline 3. Nortriptyline C O N CH 3 CH N CH 3 C N CH 3 Vodíkov ková vazba; větší retence na RP Amide H H H Ascentis RP-Amide N Větší retence na C18 N CH 3 CH 3 N CH 3 CH 3 4. Impramine 5. Amitriptyline Ascentis C18 0 10 20 95 15 cm x 4.6 mm; 25 mm NH 4 H 2 PO 4, ph 7: CH 3 OH (30:70); 254 nm; 1.0 ml/min;10 µl

Co je ANP? Aqueous normal phase chromatography (ANP)je chromatografická technika, která přes změnu složení mobilní fáze spojuje RPLC a NPLC. Povrch silikagelových nosiců je většinou tvořen primárními silanolovými skupinami (-Si-OH), které mohou být dále modifikovány např. uhlovodíky s dlouhým řetězcem. Mobilní fáze v ANPC je složena z organických rozpouštědel metanol nebo acetonitril) s malým obsahem vody. Mobilní fáze tedy obsahuje vodnou složku a zároveň i složku, která je méně polární než stacionární fáze. Polární analyty jsou tedy silně zadržovány. S rostoucím procentem vody v mobilní fázi jejich retence klesá. Skutečná ANP stacionární fáze musí být schopna pracovat v obou módech od 100% vodné až po čistě organickou. (.J. Pesek, M.T. Matsyka, J. Sep. Sci. 28 (18): 2437-2443 ). 96

Co je HILIC? Chromatografie hydrofilních interakcí - HILIC (HydrophILic Interaction Chromatography or Hydrophilic Interaction LIquid Chromatography) je jednou z verzí NPLC. Poprvé toto označení použil ve své publikaci roku 1990 Dr. Andrew Alpert (J. Chromatogr. 499 (1990) 177) Jedná se o kapalinovou chromatografii v módu, kde stacionární fáze je relativně polární a mobilní fáze relativně nepolární. Mobilní fáze je složena z 60-95% organického rozpouštědla ve vodě nebo pufru. Používá se acetonitril, metanol nebo další s vodou mísitelná rozpouštědla Typické složení 70-90% acetonitrilu v 10 mm octanu amonném 97

Ascentis Si NP separace v tucích rozpustných vitamínů 1 4 1. alpha tocopherol (100 µg/ml) (E) 2. menadione (150 µg/ml) (K3) 3. gamma tocopherol (200 µg/ml) (E) 4. chlolecalciferol (100 µg/ml) (D) 2 3 0 2 4 6 8 10 12 Time (min) 98 column: Ascentis Si, 15 cm x 4.6 mm I.D., 5 µm particles (581512-U) mobile phase: A Hexane, B Ethylacetate gradient: time %B 0 10 10 30 12 30 13 10 flow rate: 1.0 ml/min. temp.: 30 C det.: UV at 290 nm

LC/MS: Ascentis RP-Amide 1 Low bleed: good sensitivity and no interferences Ascentis RP-Amide 2 3 4 HO HO H 7.304 0 10 20 Ascentis C18 11.416 14.823 15.515 HO 1. Cannabidiol (m/z 315.5) HO O H 3. 9 -TetrahydroCannabinol (m/z 315.5) HO H 0 10 20 Time (min) O 2. Cannabinol (m/z 311.4) O H 4. 8 -TetrahydroCannabinol (m/z 315.5) Ascentis C18 & Ascentis RP-Amide, 5µm: 15 cm x 4.6 mm; Mobile Phase: 25:75, 10mM ammonium acetate (ph: 4.5) / CH 3 CN 1 ml/min; 35 ºC; ESI(+), SIR mode; 10 µl (100 µg/ml each in mobile phase) 99

Separace peptidů s TFA Fáze C18 používá se TFA pro lepší tvar píků; TFA - iontová suprese v LC-MS. 100x4.6mm, A: Water w/ 0.1% TFA, B: Acetonitrile w/ 0.1% TFA, 1% - 30% B in 15 minutes,1.5ml/min, 210nm, 35ºC, 1µL (0.5mg/mL sample) Ascentis Express C18 1 2 3 4 / 5 1. Gly-Tyr 2. Val-Tyr Tyr-Val 3. Met enkephalin 4. Angiotensin II 5. Leu enkephalin Ascentis Express RP-Amide 1 2 3 4 5 0 2 4 6 8 10 12 14 100

Separace peptidů s kyselinou mravenčí Kyselina mravenčí je vhodná pro LC-MS. 100x4.6mm, A: Water (0.1% formic acid), B: Acetonitrile (0.1% formic acid), 1% - 30% B in 15 minutes, 1.5mL/min, 210nm, 35ºC, 1µL (0.5mg/mL sample) 1 2 3 / 4 5 1. Gly-Tyr 2. Val-Tyr Tyr-Val 3. Met enkephalin 4. Angiotensin II 5. Leu enkephalin Ascentis Express C18 1 3 4 5 2 Ascentis Express RP-Amide 0 2 4 6 8 10 12 14 101

Péče o kolony a prodloužen ení jejich životnosti Nová kolona je dodávána ve směsi ACN/H 2 O. Skladování kolon Krátkodobé (3-4 dny) v MF Nahrazení pufru stejným podílem H 2 O Dlouhodobé 100 % ACN Prodloužení životnosti kolony Doporučené je filtrování MF a vzorku Používání in-line filtrů Používání předkolon Problematika ucpaných frit a odstranění silně zadržovaných látek Obrácený průtok MF 95/5 Dichlorometan/metanol 102

Příslu slušenstv enství chromatografických kolon HPLC kolony se sorbenty 5; 3 jsou uzavřeny ocelovými fritami s porozitou 2 µm robustnější, odolnější k ucpání HPLC kolony se sorbenty < 2µm jsou uzavřeny ocelovými fritami s porozitou 0,2 µm V každém případě je třeba odstranit z MF pevnéčástice 103

Filtrování mobilní fáze Velikost pórů filtrů o velikosti 47 mm 0, 20µm 0, 45µm 104

Frity a filtry 105

OPTI-SOLV EXP Pre-Column Filter 106

Předkolony 107

Systém předkolon předkolony 2 cm a vnitřní rozměr 2,1 mm 3,0 mm 4,0 mm pro analytické kolony 4,0 a 4,6 mm sorbent 3 a 5 µm 108

Speciální UHPLC spojky Ferrule jsou přesně přizpůsobeny fittingům Určeny pro tlak do 103,4 MPa Dotažení prsty Finger tight 109

Závěr Ascentis Express kolony s povrchově porézním sorbentem Mají lepší rozlišení než kolony se sorbenty 5µ a 3µ se stejnou délkou. Vzhledem k nižšímu zpětnému tlaku lze použít kolony 2x delší než kolony se sub-2m částicemi, takže mají minimálně stejné rozlišení. Lze je použít v tradičních HPLC chromatografech. Vzhledem k vyšší účinnosti se dají použít kratší kolony, čímž se zkrátí doba analýzy a ušetří rozpouštědla. Díky k úzké distribucičastic sorbentu mají kolony frity s porozitou 2 µm - menší pravděpodobnost ucpání. Alternativní fáze Zkuste využít pro problematické separace Prodlouženíživotnosti kolon filtrování MF a vzorků, použití in-line filtrů předkolony 110

111 Děkuji za pozornost