Moderní biofyzikální přístupy v experimentální biologii

Oddělení funkční genomiky a proteomiky Ústav experimentální biologie, Přírodovědecká fakulta Masarykova univerzita Praktický kurz Moderní biofyzikální přístupy v experimentální biologii Místo konání: Brno, Univerzitní kampus Bohunice blok A2, seminární místnost 1.21 Datum: 17.1. 19.1. 2012 24.1. 26.1.2012 Začátek vždy v 9:00 Vedoucí kurzu: Mgr. Ctirad Hofr Ph.D hofr@sci.muni.cz Kurz je organizován v rámci projektu OP VK Moderní biofyzikální metody: pokročilé vzdělávání v experimentální biologii registrační číslo CZ.1.07/2.3.00/09.0046. www.modernibiofyzika.cz

Časový plán Moderní biofyzikální přístupy v experimentální biologii Úterý Středa Čtvrtek Úvod organizace kurzu Anisotropie fluorescence přednáška Fluorescenční mikroskopie přednáška 9-13 1.Měření spektrálních charakteristik proteinů a DNA návod Skupina A Nanophotemeter 2.Stanovení koncentrace proteinů Bradfordové metodou návod Skupina B Spektrofotometr záměna skupin A a B na stanovištích 1 a 2 5. Příprava fluorescenčně značeného proteinu Skupina A, B návod 6. Předvedení měření anizotropie fluorescence Skupina A, B 9. Příprava mikroskopických preparátů pro lokalizaci transgenních proteinů (každý si připraví vlastní preparát) návod 10. Sledování připravených preparátů rostlin obsahujících GFP a RFP v živých buňkách za použití fluorescenční mikroskopie Skupina A, B oběd záměna skupin záměna skupin záměna skupin 14-17 3. Vliv ph a teploty na spektrální vlastnosti fluorescenčních sond návod Skupina C (3 účastníci) Fluorimetr Fmax4 4. Fluorescenční stanovení koncentrace DNA návod Skupina D (3 účastníci) SpectroVis záměna skupin C a D na stanovištích 3 a 4 7. Vizualizace makromolekul při horizontální elektroforetické separaci (EMSA) návod 8. Agarosová elektroforéza sledovaná v reálném čase Skupina C, D společně 11. Měření vlastní fluorescence aminokyselin a proteinů Skupina C návod 12. Stanovení koncentrace DNA a proteinu za použití komerčně dostupných kitů 1 návod Skupina D Záměna skupin C a D na stanovištích 11 a 12

Měření spektrálních charakteristik a stanovení koncentrace DNA a proteinů Spektroskopie v UV oblasti umožňuje stanovit koncentraci a čistotu biologických molekul. Molekuly DNA mají absorpční maximum kolem 260 nm, molekuly proteinů kolem 280 nm. Pro přímé spektrální určení koncentrace se využívá Lambert-Beerova zákona pro monochromatické světlo, který lze zapsat ve tvaru A = c.ε za předpokladu, že měříme v 1 cm kyvetě a známe extinkční koeficient ε, který má jednotku [M -1 cm -1 ] pro molární koncentraci nebo [ml.mg -1 cm -1 ] pro koncentraci v mg/ml. V případě, že neznáme extinkční koeficient, můžeme pro určení koncentrace DNA o vysoké molekulární hmotnosti použít zjednodušeného předpokladu, že roztok dvouřetězcové DNA o absorbanci 1 má koncentraci 50 µg/ml a pro převod na molární koncentraci nukleotidu DNA pak vztah 320 µg/ml = 1 mm. Pro určení koncentrace proteinů spektroskopicky lze využít absorbance proteinů při 280 nm. Jestliže známe primární sekvenci aminokyselin proteinu, lze extinkční koeficient vypočítat http://www.expasy.org/tools/protparam.html. Ze změřené absorbance pak určíme koncentraci proteinu. Znalost extinkčního koeficientu není nutná v případě univerzální Bradfordové metody. Bradfordové metoda je v současnosti nejrozšířenější způsob určování koncentrace proteinu. Bradfordové metoda využívá posunu absorpčního maxima Coomasie Blue po vazbě na protein. Za použití kalibrační křivky se známou koncentrací proteinu lze určit skutečnou koncentraci neznámého proteinu nebo směsi proteinů. Materiál DNA DNA (Salmon sperm; přibližná koncentrace = 7,5 mg/ml) Oligonukleotid CNF2_Bot (5 GTTATCCTTTGAGGGTTTAG; přibližná koncentrace = 0,02 mg/ml) BSA (hovězí sérový albumin; ε = 0.677 ml mg -1 cm -1, MW = 66430; přibližná koncentrace 5 mg/ml) TE pufr, destilovaná voda Bradford reagent (BioRad) Kyvety a spektrofotometr 1. Připravte roztok DNA v TE pufru ze zásobního roztoku tak, aby bylo možno přesně určit koncentraci DNA. 2. Změřte absorpční spektrum DNA v rozsahu vlnových délek 220 až 350 nm. 3. Určete polohu absorpčního maxima. 4. Stanovte přesnou koncentraci DNA v zásobním roztoku z hodnoty absorbance naředěného roztoku při 260 nm. Koncentraci vyjádřete v mg/ml a v OD/mL. 5. Nařeďte roztok oligonukleotidu v TE pufru ze zásobního roztoku tak, aby bylo spektroskopicky možno přesně stanovit jeho koncentraci. 6. Změřte absorpční spektrum v rozsahu vlnových délek 220 až 600 nm. 7. Nastavení NanoPhotometer: Functions Wavescan nastavte min a max λ OK Blank - vzorek 8. Na základě zadané sekvence oligonukleotidu stanovte extinkční koeficient ε 260 a spektroskopicky určete jeho koncentraci. http://eu.idtdna.com/analyzer/applications/oligoanalyzer/default.aspx?c=eu 9. Změřte spektrum značeného oligonukleotidu ve stejném rozsahu vlnových délek a porovnejte jej se spektrem neznačeného oligonukleotidu.

Protein UV spektroskopie 1. Připravte roztok BSA v TE pufru ze zásobního roztoku tak, aby bylo možno přesně určit koncentraci BSA. 2. Změřte absorpční spektrum BSA v rozsahu vlnových délek 240 až 350 nm: Nastavení přístroje Beckman DU 730 :Wavelength Scan Options λ nastavit hodnoty min a max λ OK blank - vzorek 3. Určete polohu absorpčního maxima. 4. Stanovte přesnou molární koncentraci BSA v zásobním roztoku z hodnoty absorbance naředěného roztoku při 280 nm. Bradfordové metoda 1. Připravte standardní kalibrační křivku pro měření koncentrace proteinu Bradfordové metodu. 2. Změřte koncentraci BSA pomocí této metody. 3. Vezměte roztok reakčního Bradfordové činidla z lednice a nechte jej zahřát na pokojovou teplotu a promíchejte. 4. Připravte roztoky blanku a standardů BSA o celkovém objemu 1mL do mikrozkumavek tak, že do 980 µl reakčního Bradfordové činidla přidejte vždy 20 µl TE pufru nebo 20 µl 0.125 mg/ml, 0.25 mg/ml, 0.5 mg/ml, 0.75 mg/ml, 1 mg/ml a 1.5 mg/ml standardů. 5. Současně připravte stejným způsobem roztok BSA ze zásobného roztoku, který jste naředili tak, aby bylo možno přesně určit jeho koncentraci. 6. Všechny roztoky dobře promíchejte a nechte inkubovat 5 min při pokojové teplotě. Inkubace by neměla přesáhnout 1h. 7. Nastavení spektrofotometru: Beckman DU 530: Protein assay Bradford STD Curve Units: mg/ml tlačítko MORE Create table vypište hodnoty koncentrací standardů od nejmenší Entry Done Změřte absorbanci blanku Změřte absorbanci roztoku standardů. Při měření postupujte od nejnižší koncentrace standardu k nejvyšší. Po posledním standardu se vytvoří kalibrační křivka. Změňte rovnici: Next formula Entry Done Beckman DU 730: Protein Assay Analysis Bradford Start Standard Curve Standards Setup - vypište hodnoty koncentrací standardů od nejmenší přes Edit concentration Done změřte absorbanci blanku, poté standardů. Změňte rovnici na Non-linear - Done 8. Změřte absorbanci blanku, jednoho standardu (pro kontrolu) a poté neznámého vzorku a pomocí kalibrační křivky určete jeho koncentraci. 9. Porovnejte hodnoty koncentrace zásobního roztoku BSA určené spektroskopicky při 280 nm a pomocí Bradfordové metody.

Vliv ph a teploty na spektrální vlastnosti fluoroforů V tomto experimentu je ukázán vliv ph na fluorescenci a absorpci fluorescenční značky fluoresceinu rozpuštěné ve stejné koncentraci v roztocích o různém ph. Je rovněž demonstrován vliv teploty na intenzitu fluorescence. Materiál Fluorescein - NIST-traceable standard - 50 µm (Molecular Probes, Invitrogen) Pufr 5 (20 mm MES, ph 5.0) Pufr 7 (50 mm fosfát sodný, ph 7.0) Pufr 9 (50 mm glycin, ph 9.0) Spektrofluorometr vybavený kryostatem (chlazenou vodní lázní) Kyveta Postup 1. Připravte vzorky fluoresceinu 10 000x naředěním roztoku NIST standardu jeho přidáním 1,5 µl do 1499 µl roztoku pufru 5, pufru 7 a pufru 9 a následným dalším naředěním (150 µl 1000x zřeď. roztoku do 1350 µl příslušného pufru). 2. Změřte excitační spektra vzorků při λ(em) = 515 nm 3. Změřte emisní spektra vzorků při λ(ex) = 488 nm 4. Změřte spektra při 20, 25 a 37 C. Výsledky Obr. 1: Vliv ph na excitační a emisní spektrum fluoresceinu. Při změně pufru z ph 7 na ph 5 a při zvýšení teploty dochází ke snížení intenzity fluorescence fluoresceinu.

Fluorescenční stanovení koncentrace DNA Určení koncentrace DNA je často základním krokem při analýze biologického materiálu a je součástí mnoha laboratorních protokolů. Znalost přesné koncentrace DNA je důležitá pro celou řadu technik (např. sekvenování, klonování cdna, transkripce RNA). Koncentrace DNA je nejčastěji měřena UV spektroskopií, určením hodnoty absorbance při 260 nm (Abs 260 = 1 pro dvouřetězcovou DNA o koncentraci 50 µg/ml; v 1 cm kyvetě). Ke kvantifikaci nižších koncentrací DNA, než jsou detekovatelné za použití UV spektroskopie lze použít fluorescenční sondy, které se vážou na dvouřetězcovou DNA a vykazují několikanásobný nárůst intenzity fluorescence po navázání. K sondám, které lze použít ke stanovení koncentrace DNA patří GelStar. Tato fluorescenční sonda má excitační maximum kolem 493 nm a emituje v oblasti 530 nm. Materiál Spektrofluorometr SpectroVis Plus (Vernier) Kyveta (2 ml) Roztok DNA (Salmon sperm) GelStar (10000x) 1x TE pufr Destilovaná voda Příprava roztoků 1x TE: 10 mm Tris-HCl 1 mm EDTA ph 8,0 100x GelStar 2 µl zásobního 10000x koncentrovaného roztoku GelStar nařeďte na objem 200 µl 1x TE pufrem Standardní roztok DNA Abs 260 = 0,369 koncentrace =?

Vytvoření standardní křivky 1. Připravte následná ředění roztoku DNA v 1X TE s koncentrací: 5 ng/µl, 2,5 ng/µl, 1,25 ng/µl, 0,625 ng/µl, 0,3125 ng/µl po 1mL) 2. Připravte blank: 1 ml 1x TE pufru 3. Ke každé koncentraci 1mL standardního roztoku DNA a k blanku přidejte vždy 20 µl 100x GelStar roztoku a 980 µl 1xTE pufru. Promíchejte a postupně pipetujte do kyvety. Celková koncentrace DNA standardů v kyvetě je nyní poloviční (2,50, 1,25,... ng/µl) 4. Všechny standardy a vzorky s GelStar uchovejte v temnu až do měření. 5. Zapněte spektrofluorometr podle návodu. 6. Spusťte program Logger Pro 3.8.2 7. Změřte intenzitu fluorescence Experiment Change units Spectrometer Fluorescence excitační vlnová délka 8. Změřte nejdříve intenzitu fluorescence blanku, následně standardy: vložte kyvetu, měření spustíte tlačítkem Collect a zastavíte Stop 9. Hodnoty intenzity zapište do tabulky a vyneste do grafu hodnoty intenzity fluorescence standardů na koncentraci vzorku. Měření neznámého vzorku 1. Nařeďte neznámý vzorek v 1x TE na celkový objem 1mL. Objem v eppendorfce: 0,5 ml 2. Přidejte 20 µl 100x GelStar a 980 µl 1xTE pufru. 3. Změřte intenzitu fluorescence neznámého vzorku. 4. Určete podle standardní křivky koncentraci DNA v neznámém vzorku. Výsledky Stanovení koncentrace DNA v původním neředěném neznámém vzorku.

Fluorescenční značení proteinu Fluorescenční značení proteinu bude provedeno za použití soupravy Alexa Fluor 594 Protein Labeling Kit. Proteiny značené tímto fluoroforem vykazují excitační maximum 590 nm a emisní maximum 617 nm. Alexa Fluor 594 je ve formě NHS (sukcinimidyl) esteru viz Obr. 1. Za použití následujícího postupu lze fluorescenčně naznačit 0.1 až 1 mg proteinu. Příprava proteinu Obr. 1 AlexaFluor 594 Pro optimální efektivitu značení by měl být protein ve fosfátovém pufru bez amonných inontů a primárních aminů. V případě, že protein je v jiném pufru (Trisový, glycinový), je možno dialýzou pufr změnit. Výsledná koncentrace roztoku proteinu na značení by měla být 2 mg/ml. Materiál Alexa Fluor 594 Mikrozkumavka s magnetickým míchadlem Roztok proteinu ve fosfátovém pufru (Thyroglobulin, MW = 669 000, extinkční koeficient ε = 353465 M -1 cm -1, zásobní koncentrace 10 mg/ml) 1M roztok hydrogenuhličitanu sodného (NaHCO 3, MW = 84), 1ml Fosfátový pufr (50 mm NaCl, 50 mm fosfát sodný) Kolona s náplní Sephadex G-25 Kyvety NanoPhotometer (Implen) Značení proteinu 1. Do mikrokyvety napipetujte 50 µl roztoku proteinu (c= 10 mg/ml). Jestliže je koncentrace proteinu vyšší než 2 mg/ml, roztok se naředí přidáním fosfátového pufru na výslednou koncentraci 2 mg/ml. 2. Zkumavku s fluorescenční značkou nechte zahřát na laboratorní teplotu. Přidejte 25 µl 1M NaHCO 3 a promíchejte pipetováním nahoru a dolů. Odpipetujte do mikrozkumavky s proteinem a promíchejte pipetováním nahoru a dolů. 3. Vše nechte míchat v mikrozkumavce s magnetickým míchadlem po dobu 30 minut při laboratorní teplotě.

4. 5-10 minut před koncem inkubace připravte kolonu pro separaci proteinu a nenavázané fluorescenční značky. Purifikace proteinu Náplň kolony Sephadex G-25 umožňuje gelovou filtrací oddělit nenavázanou fluorescenční značku od proteinu podle rozdílné velikosti a molekulové hmotnosti. 1. Kolonu umístěte do stojánku, odstraňte víčko a zátku a nechte obsah kolony vykapat. 2. Promyjte kolonu 5 ml fofátového pufru. 3. Opatrně naneste reakční směs proteinu a značky pipetou do středu kolony. Použijte 100 µl fosfátového pufru k vypláchnutí mikrozkumavky s reakční směsí a opět naneste na kolonu. Roztok nechte zaputovat do kolony. 4. Po 1 ml přidávejte fosfátový pufr. Postupně jímejte frakce vytékající z kolony do mikrozkumavek po 1 ml. Po cca 2-3 ml začíná vytékat značený protein. Zachyťte značený protein do jedné frakce. 5. Vzorek (frakci se zachyceným značeným proteinem) proměřte na spektrofotometru. Na základě absorpčního spektra určete, jaké množství proteinu bylo naznačeno a jaký je stupeň značení. Nastavení spektrofotometru: Functions Wave scan interval vlnových délek (260-600 nm) vložte kyvetu s blankem Blank vložte kyvetu se vzorkem Sample Options Graph scale upravit rozsah osy y, aby byly píky viditelné kde 73000 je molární extinkční koeficient značky Alexa Fluor 594 při 590 nm a Cm molární koncentrace proteinu, (ředění: pokud jste ředili do kyvety) Výsledky Získané množství proteinu a stupeň značení.

Vizualizace makromolekul při elektroforetické separaci Fluorescenční značení lze využít při sledování elektroforetické migrace makromolekul. V případě, že jsou protein a DNA naznačeny rozdílnou fluorescenční značkou, lze nezávisle detekovat polohu DNA a proteinů a sledovat jejich vzájemnou interakci. Materiál DNA fragment s navázanou fluorescenční značkou Rhodamin Red X (excitace 572 nm, emise 595 nm) protein s navázanou fluorescenční značkou Alexa Fluor 488 (excitace 496 nm, emise 519 nm) roztok akrylamidu 30% (akrylamid : bisakrylamid ~ 37:1) Upozornění: Akrylamid je neurotoxin. Je nutno pracovat v rukavicích! 5X TBE (450 mm Tris, 450 mm kys. boritá, 10 mm EDTA) 30% APS (ammonium persulfate) TEMED (N, N, N -tetramethylethylendiamin) Fosfátový pufr (50 mm NaCl, 50 mm fosfát sodný) ddh 2 O n-butanol nasycený vodou (45 ml n-butanolu smíchano s 5 ml ddh 2 O) mikrozkumavky 6x nanášecí pufr (0.15% orange G, 60% glycerol, 10 mm Tris-HCl ph 7.6, 60 mm EDTA) aparatura pro horizontální elektroforézu fluorescenční scanner FLA-7000 Postup 1. Připravte směs pro horizontální akrylamidový gel tak, že smícháte odpovídající množství zásobního roztoku akrylamidu (neurotoxin!), 5X TBE a ddh2o, aby výsledná koncentrace akrylamidu byla 5 % v 0.25X TBE a celkový objem směsi byl 80 ml. Jednotlivé složky přidávejte v pořadí: ddh 2 O, 5x TBE, dále 400 µl 30% APS a 26,4 µl TEMED a až nakonec 30% akrylamid. Dobře promíchejte, nalijte do formy a nasaďte hřebínek na 10 jamek. Směs se po nalití do formy přelije vrstvou n-butanolu, aby mohlo dojít k polymeraci bez přístupu vzduchu. Nechte 1 hodinu polymerizovat na stole. 2. Připravte roztok fluorescenčně značené DNA ve fosfátovém pufru tak, aby byla jeho výsledná koncentrace 1,5 pmol/µl (zásobní DNA: vysušených 30 pmol) 3. Připravte roztok fluorescenčně značeného proteinu ve fosfátovém pufru tak, aby byla jeho koncentrace 3 pmol/µl. (zásobní protein: přibližně 7,5 pmol/µl bude upřesněno) 4. Připravte vzorky do mikrozkumavek podle následující tabulky bez přídavku nanášecího pufru:

zkumavka číslo: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 pouze DNA DNA : protein 1:2 1:4 1:6 1:8 1:12 1:16 1:20 1:24 DNA (1,5 pmol/μl) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 - pouze protein protein (3 pmol/μl) - 1 2 3 4 6 8 10 12 1 fosfátový pufr 14 13 12 11 10 8 6 4 2 14 6x nanášecí pufr 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 5. Nechte 10 minut inkubovat za laboratorní teploty. 6. Sestavte aparaturu pro horizontální elektroforézu a naplňte ji 0.25X TBE pufrem (cca 1,5 l). 7. Ke každému vzorku přidejte 6x nanášecí pufr podle tabulky. 8. Vložte gel do elektroforetické vany. 9. Naneste vzorky na gel v pořadí jako je v tabulce. 10. Spusťte elektroforézu při napětí 40 V. Po 30 minutách zvyšte napětí na 90 V a nechte pokračovat dalších 90 minut. 11. Detekujte fluorescenci značené DNA na fluorescenčním scanneru s nastavením budícího záření a detekčního filtru na Rhodamin red-x [ROX]. 12. Detekujte fluorescenci značeného proteinu na fluorescenčním scanneru s nastavením budícího záření a detekčního filtru na Alexa fluor [Alexa488]. 13. Porovnejte obě výsledná zobrazení a určete oblasti, ve kterých se vyskytují komplexy vzniklé vazbou proteinu na DNA. Obr. 1 Příklad překryvu zobrazení při různém fluorescenčním značení DNA a proteinu

Stanovení koncentrace DNA a proteinu pomocí mikrofluorometru Materiál Quant-iT dsdna BR Assay Kit, Quant-iT ssdna Assay Kit, Quant-iT protein Assay Kit Standardy dsdna, ssdna a proteinu Vzorek dsdna, ssdna a proteinu o neznámé koncentraci Qubit mikrozkumavky Mikrofluorometr Qubit (Invitrogen) Postup 1. Připravte si cca 1 ml Working solution smícháním Quant-iT reagent a Quant-iT buffer v poměru 1:200 (1 µl reagent : 200 µl buffer) zvlášť pro ssdna, dsdna a protein 2. Připravte standardy smícháním 190 µl Working solution + 10 µl příslušného standardu #1 a #2 (#3 pro protein) 3. Připravte vzorek o neznámé koncentraci ve dvou mikrozkumavkách smícháním 195 µl Working solution + 5 µl vzorku 4. Standardy i vzorky krátce promíchejte na vortexu (2-3 sec), opatrně - ve vzorku nesmí být bublinky!! 5. Inkubace 5-10 minut při laboratorní teplotě 6. Zapněte Qubit fluorometr, vyberte příslušnou metodu (metoda v přístroji musí mít stejný název jako kit, který používáte), nová kalibrace (standardy), poté změřte neznámý vzorek (od každé zkumavky 3 měření) Pozn.: Měření by mělo probíhat za laboratorní teploty (22-28 C). Teplota vzorků by měla být stejná, proto nedržte zkumavku se vzorkem před měřením dlouho v rukách, po každém měření zkumavku ihned vytáhněte z přístroje a mezi jednotlivými měřeními ji ponechte inkubovat alespoň 30 sec při laboratorní teplotě. Výsledky Stanovení koncentrace DNA a RNA v neznámých vzorcích.

Vlastní fluorescence proteinů Vlastní fluorescenci proteinů je způsobena aromatickými aminokyselinami v nich obsaženými: tryptofanem (Trp), tyrozinem (Tyr) a fenylalaninem (Phe). Dominující je fluorescence tryptofanu, naopak prakticky vůbec se neuplatňuje fenylalanin. V této úloze jsou změřena fluorescenční excitační a emisní spektra albuminu a čistého tryptofanu, tyrozinu a fenylalaninu. Vlastnosti L-tryptofanu MW = 204,23 absorpční maximum: λ exmax = 295 nm fluorescenční emisní maximum: λ emmax = 353 nm emise Trp je vysoce závislá na polaritě a okolním prostředí Vlastnosti L-tyrozinu MW = 181,19 absorpční maximum: λ exmax = 275 nm fluorescenční emisní maximum: λ emmax = 304 nm emise Tyr je relativně málo citlivá na polaritu rozpouštědla Vlastnosti L-fenylalaninu MW = 165,19 absorpční maximum: λ exmax = 260 nm fluorescenční emisní maximum: λ emmax = 282 nm emise Phe je strukturovaná Fluorescence proteinů je obvykle excitována při 280 nm nebo při delších vlnových délkách, takže fenylalanin není ve většině experimentů excitován. Navíc je kvantový výtěžek fluorescence Phe velmi malý (kolem 0,02). Tryptofanovou fluorescenci v proteinech lze selektivně excitovat při 295-305 nm. Materiál L-tryptofan (Applichem), L-tyrozin (Applichem), L-fenylalanin (Applichem) Hovězí sérový albumin (BSA, MW = 67000) pufr A (120 mmol/l NaCl, 10 mmol/l KCl, 30 mmol/l Tris HCl, ph 7,4) Postup 1. Připravené zásobní roztoky 10 mm Trp, 2 mm Tyr, 10 mm Phe a 0,25 mmol/l albumin pro vlastní měření nařeďte pufrem A na koncentrace: 5 µμ Trp, 20 µm Tyr, 200 µm Phe a 0.6 µm albumin 2. Změřte excitační a emisní spektra vzorků za podmínek uvedených v tabulce.

excitační spektrum emisní spektrum λ em (nm) λ ex (nm) λ ex (nm) λ em (nm) L-tryptofan 350 240-300 280 290-420 L-tyrozin 300 240-290 270 280-450 L-fenylalanin 280 240-270 250 260-360 albumin 350 240-320 280 300-420 Výsledky Změřená excitační a emisní spektra vlastní fluorescence tryptofanu (Trp), tyrozinu (Tyr), fenylalaninu (Phe) a albuminu v pufru A jsou na Obr.1 a Obr 2. Z výsledných spekter je zřejmé, že prakticky veškerá vlastní fluorescence albuminu pochází od tryptofanu. Měření byla provedena na spektrofluorometru FluoroMax-4. Intenzita fluorescence 1.2x10 6 1.0x10 6 8.0x10 5 6.0x10 5 4.0x10 5 2.0x10 5 0.0 PHE ALB TRP TYR 240 260 280 300 320 λ (nm ) Obr. 1 Excitační spektra 5 µm Trp (λ em = 350 nm), 20 µm Tyr (λ em = 300 nm), 200µM Phe (λ em = 280 nm) a 0.6 µm albuminu (λ em = 350 nm). 1.2x10 6 1.0x10 6 ALB TRP Intenzita fluorescence 8.0x10 5 6.0x10 5 4.0x10 5 2.0x10 5 PHE TYR 0.0 250 300 350 400 λ (nm ) Obr. 2 Emisní spektra 5 µm Trp (λ ex = 280 nm), 20 µm Tyr (λ ex = 270 nm), 200 µm Phe (λ ex = 250 nm) a 0.6 µm albuminu (λ ex = 280 nm).

Studium vazby molekul za použití anizotropie fluorescence Změna anizotropie fluorescence je používána při popisu vzájemné interakce molekul. V případě, že se fragment DNA s fluorescenční značkou volně pohybuje (rotuje) v roztoku, je pozorovaná anizotropie relativně nízká. V případě, že dojde ke vzniku komplexu DNA a proteinu, dochází k výraznému snížení pohyblivosti DNA s fluorescenční značkou, což má za následek zvýšení anizotropie fluorescence. Při titrování roztoku fluorescenčně značené DNA roztokem DNA-vazebného proteinu dochází k postupné vazbě molekul proteinu na vazebná místa jednotlivých molekul DNA a tedy k postupnému zvyšování anizotropie fluorescence. Protein se na vazebná místa na DNA váže až do okamžiku, kdy je koncentrace proteinu tak vysoká, že jsou všechny molekuly DNA obsazeny. V tomto momentě anizotropie fluorescence dosáhne maximální hodnoty a přestane se dále zvyšovat. Koncetrace proteinu, při které hodnota anizotropie fluorescence tvoří 50 % maximální hodnoty, se nazývá disociační konstanta (Kd). Ta reprezentuje afinitu (sílu vazby) konkrétního proteinu k DNA. Studium změn Kd v závislosti např. na iontové síle či teplotě umožňuje získat cenné poznatky o povaze komplexu protein-dna a o mechanismu, jakým spolu obě makromolekuly interagují. Materiál 30 pmol vysušeného fragmentu DNA (GTTAGG) 4 značeného Rhodaminem Red X (λ ex = 572, λ em = 591 nm) Roztoky proteinu (lidský telomer-vazebný protein TRF1, MW = 110 kda) o koncentracích 1µM a 20µM Pufr P (20mM HEPES, 180mM KCl, 0,1mM EDTA, 3mM MgCl 2, ph 8.0) 1M DTT Spektrofluorometr vybavený polarizátory pro měření anizotropie fluorescence Mikrokyveta s magnetickým míchadlem

Postup 1) Resuspendovat vysušenou DNA v 1,5 ml pufru P a důkladně vortexovat. Výsledná koncentrace DNA bude 20nM. 2) Pufrem P naředit resuspendovanou DNA na 2nM, resp. 10nM roztok o objemu 1,5 ml. Přidat 1.5 µl 1M DTT. Roztok přenést do kyvety. Kyvetu při manipulaci odzátkovávat jen na nezbytně dlouhou dobu, aby bylo zamezeno vnášení částic prachu do vzorku. 3) Na fluorimetru 5x změřit anizotropii fluorescence pomocí funkce batch experiment a nastavení uloženém v souboru./redx_titrator/p0.xml (λ ex = 572 nm, λ em = 591 nm, šířka štěrbin 8/8 nm). Hodnoty anizotropie zaznamenat do tabulky v software SigmaPlot. 4) Postupně přidávat 1µM roztok proteinu tak, aby celkový objem přidaného roztoku byl 3, 5, 10, 20 a 50 µl. Po každém přídavku 5x změřit hodnotu anizotropie fluorescence a zaznamenat do tabulky v software SigmaPlot. 5) Postupně přidávat 20 µm roztok proteinu tak, aby celkový objem přidaného roztoku byl 3, 5, 10 a 20 µl. Po každém přídavku 5x změřit hodnotu anizotropie fluorescence a zaznamenat v software SigmaPlot. 6) V software SigmaPlot provést úpravu hodnot anizotropie na změnu objemu po přídavku roztoků proteinu. 7) Pomocí software SigmaPlot vynést do grafu závislost korigovaných hodnot anizotropie fluorescence na koncentraci přidaného proteinu. 8) Pomocí software SigmaPlot analyzovat křivku vazby proteinu a stanovit disociační konstantu Kd. Kd = 17 ± 1 nm Obr. 1. Závislost anizotropie fluorescence značeného fragmentu DNA na koncentraci proteinu.

Pokročilé biofyzikální přístupy v experimentální biologii 2012: Fluorescenční mikroskopie při lokalizaci transgenních proteinů exprimovaných a) v semenáčcích Arabidopsis thaliana b) v listech Nicotiana benthamiana Cíl praktické úĺohy: Teorie: a) osvojení si protokolu pro přípravu preparátu pro in vivo mikroskopii a analýzu distribuce fluorescenčních proteinů v semenáčcích A. thaliana b) praktický nácvik infiltrace bakteriální kultury do listů N. benthamiana a příprava mikroskopického preparátu z transientně transformovaných listů. Fluorescenční proteinové markery jako je například GFP a RFP jsou využívány pro analýzu lokalizace proteinů zájmu v buněčných strukturách. Základní princip je takový, že se vytvoří fúzní gen, ve kterém je v totožném čtecím rámci exprimován marker a cílový protein jako jediná molekula. Expresní vektory s fúzními geny jsou u rostlin nejčastěji založené na vnášení T-DNA do rostlinného genomu. V případě semenáčků procházejí rostliny selekčním tlakem na přítomnost transgenu a jsou tak upřednostněni stabilní transformanti. U agroinfiltrace do listů není žádná taková selekce prováděna a pozorujeme pouze transientní expresi, která je po určité době umlčena. Exprimované cílové proteiny jsou lokalizovány podle signálních sekvencí a v místě kumulace pozorujeme po excitaci fluorescenční signál (viz přiložené excitační a emisní spektra GFP a RFP). RFP GFP Dotazy směřujte na 51932 @mail.muni.cz nebo 21286@mail.muni.cz

Postup při přípravě preparátu pro in vivo mikroskopii a analýze distribuce fluorescenčních proteinů v semenáčcích A. thaliana: Materiál je nutné udržovat ve fyziologicky blízkých podmínkách, proto připravíme tzv. biochamber obsahující rostlinné kultivační medium Murashinge/Skoog (MS). Vzorky jsou uzavřeny biofolií, která propouští vzduch. 1. Oboustranná lepící páska je vystřihnuta do tvaru čtverce, jehož strana je asi 24mm ~ krátké straně krycího skla. V tomto čtverci je pak vyříznuto okénko, jak ukazuje schéma, a páska je nalepena na KRYCÍ sklo. lepící páska lepící páska nalepená na krycím skle 2. Dovnitř tohoto okénka napipetujeme 20µl MS media a vložíme 2-3 dny staré semenáčky Arabidopsis, které byly ve svislé poloze pěstovány na agarové plotně obsahující MS medium. Tyto semenáčky obsahují protein GFP nebo GFP fúzován s AtTRB1 proteinem. 3. Okénko zakryjeme biofolií. 4. Takto připravený preparát je přilepen páskou na nosič obsahující otvor pro cirkulaci vzduchu, a to biofolií směrem do otvoru. Preparát vložíme do mikroskopu krycím sklem směrem k objektivu. V této komůrce semenáčky Arabidopsis rostou až několik dní. 5. Preparát obsahující GFP pozorujeme na fluorescenčním mikroskopu nejdříve v procházejícím světle, následně pak pod filtrem specifickým pro GFP/FITC. Mikroskopie jaderného proteinu AtTRB1 byla provedena v časovém rozmezí asi 2 hod. Každých 30sec byl materiál proskenován v 15-ti optických rovinách odpovídajícím 0,4µm. Dotazy směřujte na 51932 @mail.muni.cz nebo 21286@mail.muni.cz

Postup při infiltraci bakteriální kultury do listů N. benthamiana a přípravě mikroskopického preparátu z transientně transformovaných listů 1. kolonie agrobakteriálního klonu se odpíchne do 5ml media a kultivuje se do OD600 = 0.8-1.0. Pokud je OD vyšší kultura se na požadovanou koncentraci naředí (cca 24h) 2. napěstovaná kultura se stočí ve výkyvném rotoru (8000 RPM) a pak se rozsuspenduje ve stejném objemu infiltračního media (10mM MES, 10mM MgCl2, ph~5.7, sterilní) 3. pro samotnou infiltraci se kultura smíchá se stejně připraveným pomocným kmenem agromabteria p19 nebo HcPro, které potlačují mechanizmy umlčování genů. Kultury se smíchají v poměru 1:1 a nechají odpočívat 10 min na ledu 4. žlutou špičkou se naruší spodní epidermis listu a 1ml inzulinkou se vlačí bakteriální suspenze do pletiva. Infiltrovaná oblast listu se označí fixou a místo vpichu se prorazí skrz. (Rostliny by měly být 4-6 týdnů vzrostlé, cca 30 cm, dobře zalité před infiltrací a pouze primární listy by měly být infiltrovány. 5. Analýza se provádí po 3 4 dnech buď na listových výsečích nebo sloupnuté epidermis. Dotazy směřujte na 51932 @mail.muni.cz nebo 21286@mail.muni.cz