Blok: Nádorové markery Elektrochemická analýza metalothioneinu u pacientů s onkologickým onemocněním René Kizek 1,2*, JiříSochor 1,2, David Hynek 1,2, Soňa Křížková 1,2, Vojtěch Adam 1,2, Tomáš Eckschlager 3, Marie Stiborová 4, lga Štěpánková 5, Richard Průša 6 1 Ústav chemie a biochemie, Agronomická fakulta, Mendelova univerzita v Brně, Zemědělská 1, CZ 613 Brno 2 Středoevropský technologický institut, Vysoké učení technické v Brně, Technická 358/1, CZ 616 Brno 3 Klinika dětské hematologie a onkologie, II. Lékařská fakulta, Univerzita Karlova, V Úvalu 84, CZ 1 6 Praha 5 4 Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova, Albertov 23, CZ 128 4 Praha 2 5 Ústav kybernetiky, České učení technické v Praze, Praha 2 6 Ústav klinické biochemie a pathobiochemie, II. Lékařská fakulta, Univerzita Karlova, V Úvalu 84, CZ 1 6 Praha 5
Co víme o metalothioneinu Chemická struktura, fylogenetická analýza Molekulární efekty Vztah k nádorovým onemocněním, marker Zvýšení specificity MT Metalothionein v rezistenci na protinádorovou léčbu
Chemická struktura, fylogenetická analýza Babula P, et al., Metallomics 4 (212) 739-7.
Molekulární efekty Glucocorticoid + Cytokines STAT + + H 2 2 Electrophile reagents - Methylation GRE MRE ARE structure of MT gene MTF-1 Zn Pool Zn Apo-MT Zinc fingers Zinc level + - Zn Zn Zn 7 MT Zinc fingers - interactive Apo-MT Gene expression apoptosis Proliferation Differentiation degradation Zn-proteins Transcription factors Signal molecules xidative stess H, N, GSSG Apoproteins Gumulec J, et al., Curr. Med. Chem. 18 (212) 41-51.
Vztah k nádorovým onemocněním, marker centrifugation Schéma Brdičkovy reakce +e [Co(NH 3 ) 6 ] 3+ [Co(NH 3 ) 6 ] 2+ [Co(H 2 ) 6 ] 2+ +2e Co denaturation 25 g 3 3 min. 4 C + R(SH) 2 RS 2 Co + 2H +, 2e H 2 99 C 15 min. phosphate buffer (ph 6.8) N 2 (l) + 2H + +2e R(S ) 2 + Co tumour tissue electrochemical detection Co 2+ 4 fmol MT Krizkova S., et al., Sensors 8 (28) 316-3122. na RS 2 Co Ryvolova M., et al., Curr. Anal. Chem. 7 (211) 243-261 Cat1 Krizkova S., et al., Brat. Med. J. 11 (29) 93-97 scan Co 1 Cat2.3.8 1.3 1.8 Potenciál (V)
A 2 na scan -. -.75-1. -1.25-1. -1.75 Potential (V) B MT concentration (µm) 3. 3. 2. 2. 1. 1... T 1 2 3 4 4a 4b MT concentration (µm) 5. 4. 3. 2. 1.. N 1 2a 2b 2c 3 Tumour classification MT concentration (µm) 5. 4. 3. 2. 1.. Stage 1 C Control samples MT concentration (µm) MT concentration (µm) ropharyngeal cancer Sochor J, et al., Int. J. Electrochem. Sci. 7 (212) 1767-1766. Krejcova L, et al., Int. J. Electrochem. Sci. 7 (212) 2136-2152. Patient samples
Zvýšení specificity MT
-1-1 blood -1-1 brain -1-1 eye - Inflex point. Min. - Inflex point. Min. - Inflex point. Min. 1 1 1 1 1 1-1.5-1.55-1.6-1.65 Potential [V] -1.5-1.55-1.6 Potential [V] -1.65-1.5-1.55-1.6 Potential [V] -1.65-1 -1 gonad -1-1 heart -1-1 kidney - 1 Inflex point. Min. - 1 Inflex point. Min. - 1 Inflex point. Min. 1 1 1-1.5-1.55-1.6-1.65 Potential [V] -1.5-1.55-1.6-1.65 Potential [V] -1.5-1.55-1.6-1.65 Potential [V] -1-1 liver -1-1 muscle -1-1 spleen - Inflex point. Min. 1 1-1.5-1.55-1.6-1.65 Sobrova P., et al., PLS NE (212) v revizi - 1 1-1.5 Inflex point. Min. -1.55-1.6-1.65 Potential [V] - 1 1-1.5 Inflex point. -1.55-1.6 Potential [V] Min. -1.65
Sobrova P., et al., PLS NE (212) v revizi
Anti MT kda Mr NBHR HL MB S ES NF NB 75 37 25 2 15 1 kda Mr NBHR HL MB S ES NF NB 75 37 25 2 15 1 Anti Zn Krizkova S., et al., Electrophopresis (212) odesláno
Anti MT Anti Zn b) Krizkova S., et al., Electrophopresis (212) odesláno Examples of decision trees created from data representing aggregated characteristics of the brightness curves of studied samples. Western blotting was applied to produce two brightness curves for each sample one resulted from incubation with anti MT and the other with anti Zn chicken primary antibody. Those coefficients appearing in the nodes of the tree with prefix Zn correspond to anti Zn incubation, the remaining coefficients correspond to treatment with anti MT.
Metalothionein v rezistenci na protinádorovou léčbu carboplatin Heavy metals anticancer drugs H 3 N H 3 N cisplatin H 3 N NH 3 (a) H 3N NH 3 H 3N NH 3 H 3N H 3 N H 3 N NH 3 H 3 N NH 3 H 3 N H 3 N MT H 3N H 3N MTF-1 MTI MTF-1 (c) (b) MTF-1 H 3 N NH 3 MTI H 3 N MTI NH 3 mrna (d) MRE Nucleus Cytoplasm Krizkova S., et al., Int. J. Mol. Sci. (21) 11, 4826-4842
a Concentration of MT (µm) 7. 6. 5. 4. 3. 2. 1. Day 1 Day 27 Day 64 Day 92 3 na. hour 1. hour 4. hour b Concentration of MT (µm). 9. 8. 7. 6. 5. 4. 3. 2. 1 4 Day 1 Day 3 Day 35 Hours 3 na -. -.75-1.-1.25-1. -1.75 Potential (V) -. -.75-1.-1.25-1. -1.75 Potential (V) -. -.75-1.-1.25-1. -1.75 Potential (V). hour 1. hour 4. hour 24. hour 1.. 1 4 24 Hours -. -.75-1.-1.25-1. -1.75 -. -.75-1.-1.25-1. -1.75 -. -.75-1.-1.25-1. -1.75 -. -.75-1.-1.25-1. -1.75 Potential (V) Potential (V) Potential (V) Potential (V) Time dependent changes in the concentration of MT in the plasma of two patients (a, b) with retinoblastoma. MT levels were monitored 4 or 24 hours after application of the drug and the same procedure was repeated after a few days during the next treatment with carboplatin. Krizkova S., et al., Int. J. Mol. Sci. (21) 11, 4826-4842
A B Conservation Code (MT) [%] P52722 K - S C C S C C P S G 87,681 2 P67983 K - S C C S C C P V G 85,145 11 P52727 K - S C C S C C P A G 84,42 3 Q9383 K - S C C S C C P M G 84,42 16 18842 K - S C C S C C P P G 84,42 18 P28 K - S C C S C C P G G 84,58 12 P8294 K - S C C S C C P L G 84,58 15 13269 K - S C C P C C P S G 83,696 1 P5192 K - S C C E C C P S G 82,971 6 Q6S4N8 K - S C C A C C P S G 82,971 7 P8593 K - S C C T C C P S G 82,971 8 42152 K - S C C S C C P S E 81,159 5 Q1HEB5 K - S C C S C C P S T 81,159 1 Q499L1 K - S C C P C C P P G 8,435 22 P4731 K - S C C S C C P M S 77,899 13 P7438 K - C C C S C C P V G 77,899 14 Q6XUW5 K T S C C S C C P A G 77,899 19 P683 K A S C C D C C P S G 77,536 17 Q86YX3 T - S C C S C C P V G 77,536 2 P682 K - S C C P C C P S D 77,174 4 ARZE1 K P S C C D C C P S G 77,174 9 A6NER9 K - N C C S C Y P V G 7,29 21 CH77 K A S C W D C C P S G 69,928 23 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 conservation % 1 % Peptide No. Zitka., et al., Sci. Rep. (212) odesláno
Děkuji za pozornost Práce byla finančně podpořena projekty Liga proti rakovině Praha 211 a CEITEC CZ.1.5/1.1./2.68.