Stanovení vybraných enzymů. Roman Kanďár

Podobné dokumenty
1. Napište strukturní vzorce aminokyselin E a W a vzorce guanosinu a uracilu

mezinárodní jednotka (U, IU) µmol/min 22. Jaké metody stanovení katalytické koncentrace jsou užívány? Která je v praxi nejčastější?

Aspartátaminotransferáza (AST)

METABOLISMUS SACHARIDŮ

9. Citrátový cyklus, oxidační dekarboxylace pyruvátu a anaplerotické dráhy

Enzymy - seminář. 15. Co je to počáteční rychlost reakce, jakou má hodnotu? 16. Co je to saturační křivka enzymové reakce?

Stanovení aktivity enzymů

Enzymy a Izoenzymy Principy metod a klinický význam Principy metod Petr Breinek brein nam.cz BC_Enzymy_

KA 2340/4-8up Chemické laboratorní metody v analýze potravin H1CL. Studijní podklady

1. Napište strukturní vzorce aminokyselin D a Y a vzorce adenosinu a thyminu

Test pro přijímací řízení magisterské studium Biochemie Napište vzorce aminokyselin Q a K

4. Enzymy. Obtížnost A

faktory ovlivňující enzymovou reakci : TEPLOTA, ph, koncentrace SUBSTRÁTU, koe,... v = V lim Ideálně: [S] 100 Km

7. Enzymy. klasifikace, názvosloví a funkce

Citrátový cyklus. Tomáš Kučera.

Kofaktory enzymů. T. Kučera. (upraveno z J. Novotné)

Enzymologie. Věda ležící na pomezí fyz. ch. a bioch. Zabývá se problematikou biokatalyzátorů.

Enzymy a Izoenzymy Petr Breinek

Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti. Citrátový a glyoxylátový cyklus

Enzymy: Struktura a mechanismus působení. Prof. MUDr. Jiří Kraml, DrSc. Ústav lékařské biochemie 1.LF UK

Bp1252 Biochemie. #8 Metabolismus živin

Úloha 1 Stanovení katalytické koncentrace aspartátaminotransferázy (AST)

Vzdělávací materiál. vytvořený v projektu OP VK. Anotace. Název školy: Gymnázium, Zábřeh, náměstí Osvobození 20. Číslo projektu:

ENZYMY. RNDr. Lucie Koláčná, Ph.D.

Analytické stanovení enzymů. M.Beňovská

Stanovení enzymů

Enzymy. Prof. MUDr. Jiří Kraml, DrSc.

Enzymy. Názvosloví enzymů

Enzymy. RNDr. Bohuslava Trnková ÚKBLD 1.LF UK. ls 1

Rychlost chemické reakce je dána změnou Gibbsovy energie a aktivační energií: Tudíž zrychlení reakce pomocí katalýzy může být vyjádřeno:

Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti. Glykolýza a neoglukogenese

Metabolismus mikroorganismů

Úvod do buněčného metabolismu Citrátový cyklus. Prof. MUDr. Jiří Kraml, DrSc. Ústav lékařské biochemie 1. LF UK

Enzymologie. Ústav lékařské chemie a klinické biochemie 2.LF UK a FN Motol Matej Kohutiar. akad. rok 2017/2018

Využití enzymů v medicíně

METABOLISMUS SACHARIDŮ

Obecný metabolismus.

Metabolizmus aminokyselin I

ENZYMOLOGIE. Pracovní sešit k přednáškám z biochemie pro studenty biologických kombinací ZDENĚK GLATZ

DYNAMICKÁ BIOCHEMIE. Daniel Nechvátal ::

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE

10. Metabolismus sacharidů

kofaktory nejsou: - stabilizující sloučeniny - allosterické aktivátory - post-translační modifikace mimo aktivní místo - proteinové podjednotky

Esenciální Isoleucin Leucin Lysin Methionin Phenylalanin Threonin Tryptofan Valin

Otázka: Metabolismus. Předmět: Biologie. Přidal(a): Furrow. - přeměna látek a energie

Enzymy. Názvosloví enzymů

Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti. ENZYMY I úvod, názvosloví, rozdělení do tříd

METABOLISMUS SACHARIDŮ

Pentosový cyklus. osudy glykogenu. Eva Benešová

Dýchací řetězec, oxidativní fosforylace, mitochondriální transportní systémy

Katabolismus - jak budeme postupovat

Důležité termíny enzymologie Kurz 2 / 210. Vladimíra Kvasnicová

Aminokyseliny, proteiny, enzymy

HISTORIE ENZYMOLOGIE

Klinicko-biochemická diagnostika

METABOLISMUS MONOSACHARIDŮ

Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti. Metabolismus dusíkatých látek

Srdce a atherosklerosa. Patologie. Ischemická choroba srdeční. Energetický metabolismus. 1. Ischemická choroba srdeční

Redoxní děj v neživých a živých soustavách

POZNÁMKY K METABOLISMU SACHARIDŮ

Charakteristika složky 3) cytochrom-c NADH-Q-reduktasa cytochrom-c- oxidasa ubichinon cytochromreduktasa

Centrální dogma molekulární biologie

pátek, 24. července 15 GLYKOLÝZA

Brno e) Správná odpověď není uvedena. c) KHPO4. e) Správná odpověď není uvedena. c) 49 % e) Správná odpověď není uvedena.

Intermediární metabolismus. Vladimíra Kvasnicová

Metabolizmus aminokyselin II

Metabolizmus aminokyselin II

Dýchací řetězec (DŘ)

Enzymy v diagnostice Enzymy v plazm Bun né enzymy a sekre ní enzymy iny zvýšené aktivity bun ných enzym v plazm asový pr h nár

>>> E A1 + E A2. . aktivační energie potřebná k reakci bez přítomnosti katalyzátoru E A E A1. energie potřebná ke vzniku enzym-substrátového komplexu

CZ.1.07/2.2.00/ Obecný metabolismu. Metabolismus glukosy, glykolýza, glukoneogeneze (3).

Metabolismus aminokyselin I. Jana Novotná 2. LF UK, Ústav lékařské chemie a klinické biochemie

Energetický metabolizmus buňky

Biochemicky významné reakce. Biochemický ústav LF MU (J.D.) 2013

Významné metabolické produkty a substráty

Příklady biochemických metod turbidimetrie, nefelometrie. Miroslav Průcha

Etanol Etanol je obsažen v alkoholických nápojích: whisky, slivovice apod. obsahují %, vína 6 12 % a pivo 2 5 % etanolu V klinické praxi se vysk

13. Enzymy aktivační energie katalýza makroergické sloučeniny

Aminokyseliny, proteiny, enzymologie

ENZYMY. Enzymy - jednoduché nebo složené proteiny, které katalyzují chemické přeměny v organismech

Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti. Metabolusmus lipidů - anabolismus

Vliv dusíkatých látek v kultivačním médiu na růst a metabolismus rostlin tabáku. UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE Přírodovědecká fakulta Katedra biochemie

CZ.1.07/2.2.00/ Obecný metabolismu. Cyklus trikarboxylových kyselin (citrátový cyklus, Krebsův cyklus) (8).

ENZYMY. Klasifikace enzymů

Eva Benešová. Dýchací řetězec

BIOCHEMICKÉ METABOLICKÉ DRÁHY PRO STUDENTY VFU BRNO

Bioenergetika a makroergické sloučeniny

Obecný metabolismus.

Metabolismus dusíkatých látek

Konsultační hodina. základy biochemie pro 1. ročník. Přírodní látky Úvod do metabolismu Glykolysa Krebsův cyklus Dýchací řetězec Fotosynthesa

OBECNÝ METABOLISMUS SACHARIDY I

substráty, ty, koenzymy, enzym,

1. OXIDOREDUKTASY (14.) 11 až 18 (různé typy oxygenačních

Glykolýza Glukoneogeneze Regulace. Alice Skoumalová

Enzymy. aneb. Není umění dělat co tě baví, ale najít zalíbení v tom, co udělati musíš. Luboš Paznocht

Biosyntéza sacharidů 1

Regulace metabolických drah na úrovni buňky

Parametry metod automatické fotometrické analýzy

11. Metabolismus lipidů

Co jsou to enzymy? pozoruhodné chemické katalyzátory

Transkript:

Stanovení vybraných enzymů Roman Kanďár

Takže prvně malé opakování ENZYM Protein (RNA) s katalytickou aktivitou Protein (RNA) kofaktor (prosthetická skupina, koenzym) Jaký je vlastně rozdíl mezi prosthetickou skupinou a koenzymem? Prosthetická skupina stabilní součástí enzymu Koenzym snadno disociuje

Příklady kofaktorů: NAD, NADP, FMN, FAD, lipoát, benzochinony (CoQ 10 ), biopterin, hem, glutathion, PLP, koenzym A, TPP, biotin, THF, methylkobalamin, SAMe, ATP, PAPS, Ac-CoA, To je zkratek, takže připomenout, zopakovat Musíme umět vzorce těch kofaktorů? Netřeba, ale poznat byste je měli! Takže zkuste si to

A B C D E

G F H

I J K L M N

O P Q

Nyní k diagnosticky významným enzymům ACP ALT ALP AMS AST CHS HBD CK LD LPS Princip stanovení? Využíváme reakcí, které katalyzují Je však zapotřebí, aby substrát nebo produkt významně absorbovaly v blízké UV nebo Vis Nyní si jednotlivé reakce, katalyzovány námi stanovovanými enzymy, probereme

ALT, AST Jedná se o aminotransferasy, vzpomeňte na odbourávání aminokyselin Hlavně se ty reakce neučte nazpaměť, pak to pletete Je to jednoduché, nejdříve obecně Aminokysel ina 2 Oxokyselin a Aminotrans ferasa 2 Oxokyselin a Aminokysel ina ALT (alaninaminotransferasa) L Alanin 2 Oxoglutarát Alaninaminotransferasa Pyruvát L Glutamát

Žádný z produktů ani substrátů významně neabsorbuje v blízké UV nebo Vis oblasti! Proto následuje další reakce, kde buď substrát, produkt nebo třeba kofaktor absorbuje. Zde je to redukovaná forma NAD (NADHH ), silně absorbuje kolem 340 nm! Ve výsledku je aktivita ALT úměrná poklesu absorbance NADHH Pyruvát Laktátdehydrogenasa NADH H Laktát NAD

AST (aspartátaminotransferasa) L Apartát 2 Oxoglutarát Oxalacetát NADH H Aspartátaminotransferasa Oxalacetát Malátdehydrogenasa Malát NAD L Glutamát Jak vidíte, jedná se o analogickou reakci, jako při stanovení ALT, z aspartátu vzniká odpovídající 2-oxokyselina (oxalacetát), ten je pak za katalýzy malátdehydrogenasy redukován na odpovídající 2-hydroxykyselinu (malát) a opět sledujeme úbytek NADHH ALP (alkalická fosfatasa) 4 Nitrofenylfosfát ALP H2 O 4 Nitrofenol Fosfát ALP katalyzuje hydrolýzu esterů kyseliny fosforečné Zde je použit 4-nitrofenylfosfát, protože produkt (4-nitrofenol) významně absorbuje kolem 405 nm!

CK (kreatinkinasa) Kreatinkinasa Kreatinfosfát ADP Kreatin ATP ATP Glukosa Glukosa 6 fosfát NADP Hexokinasa Glukosa 6 fosfát ADP Aktivita CK je úměrná přírůstku absorbance NADPHH Zde můžeme použít i obrácenou reakci, tedy: Kreatin ADP Fosfoenolpyruvát Pyruvát NADH H Zde naopak je aktivita CK úměrná poklesu absorbance NADHH Nyní k jednotlivým reakcím: Reakce katalyzována hexokinasou je prvním krokem glykolysy Reakce katalyzována glukosa-6-fosfátdehydrogenasou je prvním krokem pentosového cyklu Reakce katalyzována pyruvátkinasou je posledním krokem glykolysy Reakce katalyzována laktátdehydrogenasou je reakcí anaerobní glykolysy Je třeba se něco učit? Glukosa 6 P dehydrogenasa Kreatinkinasa ATP Kreatinfosfát Pyruvátkinasa Pyruvát Laktátdehydrogenasa Laktát 6 Fosfoglukonát NADPH H ADP ATP NAD

LD (laktátdehydrogenasa) Pyruvát Laktátdehydrogenasa NADH H Laktát NAD To už tu několikrát bylo, že?

No a jak to budeme měřit? Kineticky! Tudíž to má něco společného s časem Neměříme tedy okamžitou absorbanci, ale její změnu v čase (nejčastěji za minutu, tedy A/min) V jakých jednotkách jsou uváděné výsledky? kat/l (tedy spíše µkat/l nebo nkat/l) Jedná se tedy o katalytickou koncentraci U některých enzymů se uvádí hmotnostní koncentrace (např. µg/l), co to znamená? To znamená, že neměříme aktivitu toho enzymu, ale jeho množství pomocí imunochemických metod (specifická protilátka proti bílkovinné části enzymu) A co je vlastně ten katal? Definice:» Enzym má katalytickou aktivitu 1 kat, pokud je schopen při nasycení substrátem za definovaných podmínek (teplota, ph, složení, koncentrace) za přítomnosti aktivátorů a nepřítomnosti inhibitorů proměnit 1 mol substrátu za 1 sekundu» Tedy rozměr v SI jednotkách je mol/s

Jaké přístroje k měření lze použít? Míněny ty, které jsou na KBBV Tento spektrofotometr nelze, poněvadž nemá vyhřívaný (37 C) kyvetový prostor Navíc je zapotřebí stopek, a to už se dostáváme někam do hodně daleké minulosti Velmi drahý spektrofotometr s diodovým polem, vhodný spíše pro výzkumné účely Devítikanálový fotometr LabSystem, náš favorit

Biochemické analyzátory Cobas Mira Plus a Olympus AU640 Samozřejmě nejvhodnější, ale k výukovým účelům méně vhodné

Ještě několik poznámek Neříkejte, že enzym stanovujeme enzymaticky Kromě kinetického měření lze použít i tzv. end-point metodu O co se jedná? Neměříme změnu absorbance v čase, ale konečnou absorbanci produktu, tudíž reakce se zastaví Příklad: ALT L Alanin 2 Oxoglutarát Pyruvát H 2,4 DNPH Hydrazon L Glutamát