Pražské analytické centrum inovací Projekt CZ.04.3.07/4.2.01.1/0002 spolufinancovaný ESF a Státním rozpočtem ČR
Obsah 1. Úvod 1.1. Miniaturizace v analytické chemii 1.2. Přednosti a nevýhody kapilárních technik 1.2.1. Kapilární zónová elektroforéza 1.2.2. Kapilární kapalinová chromatografie 1.2.3. Nanokapalinová chromatografie na čipu 2. Použití miniaturizovaných separačních technik 2.1. NanoLC-ESI-MS/MS 2.2. Srovnání CZE a CLC 2.3. Monolitické kolony pro CLC Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 2
Miniaturizace významný trend dnešní doby Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 3
Miniaturizace v separačních metodách Mikroextrakce na tuhé fázi SPME Kapilární separační techniky CLC, CZE a CEC Tištěná mikropole Microarrays Čipy Lab-on-chip Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 4
Proč zmenšujeme separační prostor? Vysokoúčinná kapalinová chromatografie HPLC 1 ml/min 525 L Kapilární kapalinová chromatografie CLC 3 µl/min 1,6 L Nano kapalinová chromatografie nanolc 0,3 µl/min 158 ml Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 5
Požadavky analytické praxe Tlak analytické praxe na zlepšení některých parametrů vyvinutých a vyvíjených analytických metod 1. zvýšení citlivosti 2. zlepšení selektivity 3. zrychlení analýzy 4. zmenšení vzorku 5. použití méně běžných substancí 6. snížení neurčitosti 7. zajištění správnosti a přesnosti 8. snížení nákladů 9. minimalizace vlivu na životní prostředí 10. kompatibilita s hmotnostní spektrometrií miniaturizace Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 6
Kapilární separační metody používané v analytické chemii 1. Kapilární zónová elektroforéza (CZE) 2. Kapilární kapalinová chromatografie (CLC) 3. Kapilární elektrochromatografie (CEC) 4. Kapilární plynová chromatografie (CGC) 5. Nanokapalinové mikrofluidní techniky realizované na čipu v plošném uspořádání (Lab-on-a-chip) Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 7
Problémy miniaturizace vyplývají z principu separačních metod a technických možností doposud známých technologií 1. instrumentální náročnost 2. zmenšení průtoku eluentu a detekční cely 3. nestabilita elektroosmózy u CZE 4. reprodukovatelnost dávkování malých objemů 5. plnění kolon pro CLC 6. frity u kolon pro CLC Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 8
Kapilární zónová elektroforéza + - +25000 V Signál detektoru, mau 0,8 0,6 0,4 0,2 1 3 ropinirol 2 4 5 254 nm 0,0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Migrační čas,min Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 9
Přednosti a nevýhody CZE vhodná pro látky iontové povahy (rozdílné elektroforetické pohyblivosti) 1. velká separační účinnost 2. rychlý vývoj metody 3. krátká doba analýzy 4. malá spotřeba vzorku 5. snadné odstranění všech látek z předchozí analýzy 6. snadné a rychlé určení pk a analytů 7. dobrá kompatibilita s MS detekcí 1. menší selektivita 2. malá robustnost 3. nestabilita elektroosmotického toku 4. horší opakovatelnost a reprodukovatelnost 5. problémy s validací Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 10
Kapilární kapalinová chromatografie 12 6 MPa Signál detektoru, mau 10 8 6 4 2 1 2 3 4 5 0 0 2 4 6 8 10 12 Retenèní èas,min 210 nm Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 11
Přednosti a nevýhody CLC vhodná pro neutrální látky a ionty (rozdílná distribuce mezi mobilní a stacionární fází) 1. velká separační účinnost 2. velká selektivita 3. možnost gradientové eluce 4. velká robustnost 5. výborná opakovatelnost a reprodukovatelnost 6. možnost validace 7. dobrá kompatibilita s MS detekcí 1. komplikovaná příprava separační kolony 2. pomalejší vývoj metody 3. delší doba analýzy 4. větší spotřeba vzorku 5. látky z předchozí analýzy mohou zůstat v koloně Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 12
Nanokapalinová chromatografie na čipu Prekoncentrace 4 µ L/min 1µ L 0,3 µ L/min 300-1800 m/z Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 13
Nanokapalinová chromatografie na čipu Separace 4 µ L/min 1µ L 0,3 µ L/min 300-1800 m/z Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 14
Čip a jeho příslušenství Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 15
Přednosti a nevýhody nanolc na čipu vhodná pro neutrální látky a ionty (rozdílná distribuce mezi mobilní a stacionární fází) 1. výborná kompatibilita s MS detekcí 2. dobrá selektivita, robustnost a opakovatelnost 3. žádná šroubovací spojení 4. prekoncentrace vzorku 5. možnost výměny plastového čipu po několika analýzách 1. instrumentální náročnost na pumpy 2. instrumentální náročnost na dávkovací ventil 3. obtížná výroba čipu ve vlastní laboratoři Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 16
Identifikace bílkovin pomocí nanolc-esi-ms/ms 1. bílkovina 2. štěpení trypsinem 3. specifické peptidy 4. separace na čipu 5. elektrosprej 6. hmotnostní spektrometrie 7. sekvence aminokyselin 8. porovnání s databází 9. identifikace peptidů 10. identifikace bílkoviny MS/MS proteomika nanolc ESI Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 17
Chromatogram Identifikováno 10 fmol hovězího α-s1 kaseinu. 70 ze 214 aminokyselin, 3 peptidy identifikovány, 32% pokrytí MKLLILTCLVAVALARPKHPIKHQGLPQEVLNENLLRFFVAPFPEVFGKEKVNELSKDIGSESTEDQAMEDIKQMEAESI SSSEEIVPNSVEQKHIQKEDVPSERYLGYLEQLLRLKKYKVPQLEIVPNSAEERLHSMKEGIHAQQKEPMIGVNQELAYF YPELFRQFYQLDAYPSGAWYYVPLGTQYTDAPSFSDIPNPIGSENSEKTTMPLW Intens. x10 7 W568J053.D: BPC300-1800 ±All MS 6 4 2 0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 Time [min] Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 18
Štěpení bílkovin trypsinem Trypsin je bílkovina o Mr = 23300. Enzym katalyzující hydrolýzu peptidických vazeb za Lys (K) a Arg (R) nenásleduje-li Pro (P). hovězí α-s1 kasein MKLLILTCLVAVALARPKHPIKHQGLPQEVLNENLLRFFVAPFPEVFGKEKVNE LSKDIGSESTEDQAMEDIKQMEAESISSSEEIVPNSVEQKHIQKEDVPSERYLGY LEQLLRLKKYKVPQLEIVPNSAEERLHSMKEGIHAQQKEPMIGVNQELAYFYPE LFRQFYQLDAYPSGAWYYVPLGTQYTDAPSFSDIPNPIGSENSEKTTMPLW YLGYLEQLLR H 3 N + -Tyr-Leu-Gly-Tyr-Leu-Glu-Gln-Leu-Leu-Arg-COOH Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 19
Fragmentace peptidu v MS Kolizí indukovaná disociace (CID) srážkou iontu peptidu s atomem hélia v iontové pasti MS dochází k fragmentaci peptidu na peptidické vazbě -CO-NHa vznikají fragmenty b a y. YLGYLEQLLR + H 3 N + -Tyr-Leu-Gly-Tyr-Leu-Glu-Gln-Leu-Leu-Arg-COOH Y + b 1 LGYLEQLLR + y 9 YL + b 2 GYLEQLLR + y 8 YLG + b 3 YLEQLLR + y 7 YLGY + b 4 LEQLLR + y 6 YLGYL + b 5 EQLLR + y 5 YLGYLE + b 6 QLLR + y 4 YLGYLEQ + b 7 LLR + y 3 YLGYLEQL + b 8 LR + y 2 YLGYLEQLL + b 9 R + y 1 Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 20
Experimentální podmínky kapalinová chromatografie gradientová eluce: eluent A: voda s 0,1 %HCOOH 0 min 2% B eluent B: acetonitril s 0,1 %HCOOH 40 min 42% B 42 min 85% B 44 min 85% B 45 min 2% B 50 min 2% B průtok nanopumpy: 300 nl/min průtok kapilární pumpy: 4 µl/min eluentu A objem vzorku: 1 µl, prekoncentrace vzorku: 5 minut hmotnostní spektrometrie sušící plyn: N 2, průtok: 2,5 L/min, teplota 230 C napětí ESI: -2400 V, skenovaný rozsah: 300 1800 m/z Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 21
NanoLC-ESI-MS/MS je vynikajícím analytickým nástrojem pro identifikaci bílkovin v proteomice ale i menších organických molekul, jako např. metabolických produktů léčiv ve farmacii. Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 22
Nanokapalinová nebo kapilární kapalinová chromatografie Mikrokapalinová chromatografie Kapilární kapalinová chromatografie Nanokapalinová chromatografie Průměr kolony 1 mm 300 μm 75 μm CLC NanoLC Vhodná detekce UV-VIS, CCD, ED MS, LIF, CCD, ED Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 23
CZE látky iontové povahy rozdílné elektroforetické pohyblivosti výborná separační účinnost rychlý vývoj metody krátká doba analýzy malá spotřeba vzorku snadné odstranění všech látek z předchozí analýzy nestabilita elektroosmotického toku horší opakovatelnost a reprodukovatelnost problémy s validací CLC neutrální látky a ionty rozdílná distribuce mezi mobilní a stacionární fází velká separační účinnost výborná opakovatelnost a reprodukovatelnost možnost validace komplikovaná příprava separační kolony pomalejší vývoj metody delší doba analýzy větší spotřeba vzorku látky z předchozí analýzy mohou zůstat v koloně Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 24
Ropinirol a jeho nečistoty N(CH 2CH 2CH 3) 2. HCl N(CH 2CH 2CH 3) 2. HCl N(CH 2CH 2CH 3) 2. HCl O Cl N H O ropinirol 1 2 N H O N H O HCl.HN HNCH 2CH 2CH 3. HCl N(CH 2CH 2CH 3) 2. HCl N H 3 O N O N H H 4 5 O Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 25
Experimentální podmínky Obě analytické metody byly optimalizovány pro separaci a stanovení ropinirolu v reálných vzorcích ze syntézy. CZE křemenná kapilára 50 μm x 40 cm x 47 cm 100 mm boritanový pufr 30 mm MgSO 4 ph = 8,7 20 % acetonitril 2 nl vzorku +30 kv, 51 μa detekce při 254 nm CLC Nucleosil 100-5 C18, 5 μm 320 μm x 41 cm 8,7 mm pufr MES ph = 6,0 55 % acetonitril 60 nl vzorku 4 μl/min detekce při 254 nm Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 26
Separace a stanovení pomocí CZE a CLC Signál detektoru, mau 0,8 0,6 0,4 0,2 CZE 1 3 ropinirol 2 4 5 Signál detektoru, mau 0,8 0,6 0,4 0,2 thiomočovina ropinirol 1 2 3 4 5 CLC Signál detektoru, mau 0,0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Migrační čas, min 0,4 0,3 0,2 0,1 CZE 1.vzorek ropinirol 1 0,0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Migrační čas, min 3 2 5 Signál detektoru, mau 0,0 0 5 10 15 20 25 30 Retenční čas, min 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 ropinirol 1 CLC 1.vzorek 0,00 0 5 10 15 20 25 30 Retenční čas, min 2 3 5 Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 27
Kvantifikace pomocí CZE a CLC Korelační koeficient (r) lineárních kalibračních křivek a limity stanovení (LOQ) v µg/ml. ------------------------------------------------------------------------------------ CZE CZE CLC CLC Analyt r LOQ r LOQ ------------------------------------------------------------------------------------ Ropinirol 0-2,5 mg/ml 0,998 0,995 0-25 µg/ml 0,996 3,6 0,997 5,6 1 0,998 2,3 0,998 3,6 2 0,998 3,0 0,998 4,3 3 0,998 2,0 0,999 6,9 4 0,999 2,6 0,996 6,3 5 0,996 3,3 0,997 7,9 ------------------------------------------------------------------------------------ Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 28
Porovnání obou kapilárních metod Dva různé vzorky ropinirolu ze syntézy byly analyzovány pomocí optimalizovaných metod CZE a CLC. CZE CLC Doba analýzy 13 min 27 min Opakovatelnost 0,1 19,7 % 0,1 2,9 % (n = 6) Čistota ropinirolu 1.vzorek 98,69 % 98,24 % 2.vzorek 99,65 % 99,59 % (1.vzorek metodou HPLC: 98,3%) (2.vzorek metodou HPLC: 99,6%) Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 29
Optimalizace ph základního elektrolytu Optimalizace ph základního elektrolytu v CZE poskytuje hodnoty pk a separovaných látek. Elektroforetická pohyblivost, 10-4 cm 2 /Vs 3 2 1 0-1 ropinirol 1 2 3 4 5-2 0 2 4 6 8 10 12 14 ph Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 30
Určení disociačních konstant m = m i 1 1+ 10 (ph pk a ) ---------------------------------------------------------------------------- Analyt pk a (CZE) m i r ---------------------------------------------------------------------------- Ropinirol 9,79 2,27 0,991 1 9,43 2,26 0,955 2 9,52 2,22 0,989 3 9,95 2,21 0,991 4 10,06 2,47 0,992 5 9,36 2,12 0,986 ---------------------------------------------------------------------------- Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 31
Reprodukovatelnost a opakovatelnost v CZE Elektroosmotický tok se často mění i v průběhu jedné analýzy. Nestabilní elektroosmotický tok vede ke špatné a) reprodukovatelnosti a opakovatelnosti migračních časů (řešení: kovalentní či dynamické pokrytí vnitřní stěny) b) opakovatelnosti plochy píků (řešení: normalizace plochy A/t, vnitřní standard) Validace analytických metod v CZE je obtížná. Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 32
Elektroosmotický tok, EOF Pohyblivost EOF, 10-4 cm 2 /Vs 7 6 5 TRIS pufr ph = 8,2 bez promytí fosforečnanový pufr, ph = 6,8 promytí NaOH promytí HNO 3 bez promytí 4 0 5 10 15 20 Číslo analýzy Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 33
Analýza aminokyselin pomocí CZE Experimentální podmínky: křemenná kapilára 50 μm x 66,5 cm x 80 cm 2,3 M CH 3 COOH (ph 2,1) s 0,1% hydroxyethylcelulosou 300 mbar.s, 0,1 0,5 mm roztok aminokyselin +30 kv, 15,3 μa, 25 C bezkontaktnívodivostnídetekce (CCD) Hydroxyethylcelulosa (HEC) významně zlepšuje reprodukovatelnost a opakovatelnost použité analytické metody. Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 34
20 nederivatizovaných aminokyselin -0,220 Signál detektoru CCD, V 2 1 3 4 5 6 7 8 9 18 20 14 21 1 Lys 8 Leu 15 Glu 2 Arg 9 Ser 16 Phe 3 His 10 Thr 17 Pro 4 Gly 11 Asn 18 Tyr 5 Ala 12 Met 19 Cys-Cys 6 Val 13 Gln 20 Cys 7 Ile 14 Trp 21 Asp -0,221 0 5 10 15 20 25 30 35 Migrační čas, min Elektroosmotická pohyblivost bez HEC 0,12 10-4 cm 2 /Vs Elektroosmotická pohyblivost s 0,1% HEC 0,03 10-4 cm 2 /Vs RSD migračních časů prolinu 0,19 % (n = 12) RSD migračních časů kys. asparagové 0,22 % (n = 12) Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 35
Efektivní elektroforetické pohyblivosti -0,220-0,221 Signál detektoru CCD, V 6 7 8 9 1112 10 14 16 17 18 19 20 Signál detektoru CCD, V Thr Cys-Cys allo-thr Cys -0,221 20,0 22,5 25,0 27,5 30,0 Migrační čas, min -0,222 0 5 10 15 20 25 30 35 Migrační čas, min 1 Lys 2,91 10-4 8 Leu 1,40 10-4 15 Glu 1,16 10-4 2 Arg 2,74 10-4 9 Ser 1,39 10-4 16 Phe 1,13 10-4 3 His 2,67 10-4 10 Thr 1,26 10-4 17 Pro 1,10 10-4 4 Gly 2,00 10-4 11 Asn 1,24 10-4 18 Tyr 1,08 10-4 5 Ala 1,77 10-4 12 Met 1,23 10-4 19 Cys-Cys 1,02 10-4 6 Val 1,47 10-4 13 Gln 1,19 10-4 20 Cys 1,00 10-4 7 Ile 1,44 10-4 14 Trp 1,18 10-4 21 Asp 0,96 10-4 allo-thr 1,17 10-4 cm 2 /Vs Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 36
CZE a CLC jsou slibným konkurentem konvenční HPLC. Vyznačují se lepší separační účinností, sníženou spotřebou základního elektrolytu / eluentu, menšími nároky na množství vzorku a nízkou cenou každodenního provozu. Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 37
Separační kolony pro CLC Náplňové kolony s částicemi stacionární fáze 320 μm x 450 μm 75 μm x 280 μm Monolitické kolony s roubíkem monolitu 320 μm x 450 μm 220 μm x 375 μm Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 38
Charakter monolitických kolon 1. snadná příprava kolony radikálovou polymerizací 2. žádné frity k udržení sorbentu 3. polarita monolitu závisí na funkčním monomeru 4. kolony libovolného průměru a délky 5. nízká cena kolony organické polymery silikagelové monolity Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 39
Polyakrylamidový monolit hydrofilní sorbent akrylamid H 2 C=CH-CONH 2 methylenbisakrylamid H 2 C=CH-CONH-CH 2 -NHCO-CH=CH 2 H H H CH 2 C CH 2 C CH 2 C H OC 2NOC H a 2NOC HN CH NH 2 b H OC H CH 2 C CH 2 C CH 2 C H NOC 2 c H H NOC 2 d Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 40
Polystyrenový monolit hydrofobní sorbent styren H 2 C=CH-C 6 H 5 divinylbenzen H 2 C=CH-C 6 H 4 -CH=CH 2 H C 5 6 H H C 5 6 CH 2 CH CH e 2 C CH 2 CH f CH 2 CH CH 2 C CH CH H 5 C 6 H g H C 2 5 6 h Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 41
Polybutylmethakrylátový monolit středně hydrofobní sorbent butylmethakrylát H 2 C=C(CH 3 )-COO-CH 2 CH 2 CH 2 CH 3 ethylendimethakrylát H 2 C=C(CH 3 )-COO-CH 2 CH 2 -OOC-C(CH 3 )=CH 2 H 3 C H 3 C H 3 C CH 2 C CH 2 C CH 2 C H 9 C 4 O 2 C r O 2C H 9 C 4 O 2 C CH CH 2 2 s H C 3 O C 2 H C 3 CH 2 C CH 2 C CH 2 C H 9 C 4 O 2 C H C t 3 H 9 C 4 O 2 C u Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 42
Příprava polybutylmethakrylátového monolitu Silanizace kapiláry silanizační činidlo: 3-(trimethoxysilyl)propylmethakrylát Polymerizační směs (40:60) funkční monomer: butylmethakrylát síťovací monomer: ethylendimethakrylát iniciátor polymerizace: α,α -azobisisobutyronitril porogenní rozpouštědlo: 1-propanol 1,4-butandiol voda Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 43
Složení polymerizační směsi funkční monomer: butylmethakrylát 17,8 % síťovací monomer: ethylendimethakrylát 21,8 % iniciátor polymerizace: α,α -azobisisobutyronitril 0,4 % porogenní rozpouštědlo: 1-propanol 36,0 % 1,4-butandiol 18,0 % voda 6,0 % Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 44
Vliv síťovacího monomeru Signál detektoru, mau 5 4 3 2 1 Polymerizační směs Hmotnostní % butylmethakrylát 23,8 19,8 17,8 ethylendimethakrylát 15,8 19,8 21,8 α,α -azobisisobutyronitril 0,4 0,4 0,4 1-propanol 36,0 36,0 36,0 1,4-butandiol 18,0 18,0 18,0 voda 6,0 6,0 6,0 uracil anilin 2 µl/min 65:35 (v/v) acetonitril-voda toluen Signál detektoru, mau 6 4 2 uracil anilin 2 µl/min 65:35 (v/v) acetonitril-voda toluen 0 0 5 10 15 20 Retenční čas, min 0 0 5 10 15 20 Retenční čas, min Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 45
Separace malých organických molekul Signál detektoru, mau 20 15 10 5 1 µl/min uracil fenol benzen toluen ethylbenzen Signál detektoru, mau 12 10 8 6 4 2 uracil fenol benzen toluen ethylbenzen 4 µl/min 65:35 (v/v) acetonitril-voda 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Retenční čas, min 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Retenční čas, min HETP v μm: Analyt 1 μl/min 4 μl/min uracil 52 134 fenol 44 132 benzen 27 57 toluen 26 63 ethylbenzen 30 77 Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 46 0
Separační účinnost kolony Signál detektoru, mau 20 15 10 5 1 µl/min uracil fenol benzen toluen ethylbenzen 150 125 HETP = A + B u + C u Signál detektoru, mau 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Retenční čas, min 12 10 8 6 4 2 0 4 µl/min fenol uracil benzen toluen ethylbenzen HETP, µm 100 75 50 25 uracil fenol ethylbenzen toluen benzen 0 0 1 2 3 4 5 Průtok eluentu, µl/min 0 2 4 6 8 10 12 Retenční čas, min Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 47
Kapilární monolitické kolony jsou slibnou alternativou ke kapilárním náplňovým kolonám. Vyznačují se srovnatelnou separační účinností a jejich předností je jejich cena a jednoduchost přípravy. Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 48
Budoucnost kapilárních separačních technik Problém reprodukovatelnosti CZE je řešitelný použitím kapilárních kolon s pokrytým vnitřním povrchem. Problém přípravy kapilárních kolon pro CLC je řešitelný využitím monolitických kolon. Domnívám se, že CLC a CZE budou postupně nahrazovat HPLC i v komerční sféře chemické analýzy. CZE se bude více využívat k rychlé kontrole vzorků z výrobního procesu a CLC bude sloužit především ke kontrole kvality konečných produktů. Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 49
Děkuji Vám za pozornost. Chemický ústav Přírodovědecká fakulta Univerzita Karlova v Praze Pavel Coufal, Univerzita Karlova v Praze, Katedra analytické chemie, 4.9.2006 50