HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 Ref. 3010 2018/07
POUŽITÍ KITU HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 kit je určen k separaci normálních hemoglobinů (A a A 2 ) a pro detekci hlavních variant hemoglobinu : S nebo D, C nebo E, a to elektroforézou na agarózových gelech o ph 8.5. Výsledky jsou vyhodnocovány buďto vizuálně nebo denzitometricky (relativní kvantifikace jednotlivých zón). Elektroforéza na kyselých gelech (např. HYDRAGEL ACID(E) HEMOGLOBIN(E) K20) by měla pak sloužit k potvrzení identifikace hemoglobinových variant zvláště k rozlišení hemoglobinu S od D a E od C. Každý agarózový gel HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 je určen k analýze 7 mi vzorků. Určeno pro diagnostické použití in vitro. PRINCIP TESTU Hemoglobin je komplexní molekula složená ze dvou párů polypeptidových řetězců. Každý řetězec je připojen k hem-chelátovému komplexu protoporfyrinu s dvojmocným Fe. Hem je u všech hemoglobinů stejný - typ hemoglobinu je určen proteinovou částí, zvanou globin. Polypeptidové řetězce alfa, beta, gama a delta tvoří normální lidské hemoglobiny. - hemoglobin A... = alfa 2 beta 2 - hemoglobin A 2... = alfa 2 delta 2 - fetální hemoglobin F... = alfa 2 gama 2 Alfa řetězec je totožný u všech těchto tří hemoglobinů. Prostorová struktura hemoglobinu a ostatní vlastnosti jeho bílkovinné molekuly (stejně jako u ostatních bílkovin) závisí na prostorovém uspořádání a sekvenci aminokyselin, které tyto řetězce tvoří. Substituce aminokyselin mutací je zodpovědná za tvoření variant hemoglobinu, které mají různý povrchový náboj a následně rozdílnou pohyblivost v elektroforetickém poli, jež rovněž závisí na ph a iontové síle pufru. Výsledné kvalitativní (nebo strukturální) abnormality se nazývají hemoglobinopatie. Snížená syntéza jednoho z hemoglobinových řetězců vede ke kvantitativním (nebo regulačním) abnormalitám zvaným talasemie. Test je prováděn s hemolyzovanými propranými erytrocyty. Hemoglobiny jsou separovány elekroforeticky na alkalických gelech a frakce jsou vizualizovány obarvením amidočerní. Suché gely je možno ihned interpretovat. REAGENCIE A MAT. OBSAŽENÝ V KITU HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy. POLOŽKA KAT. Č. 3010 Agarózové gely (připraveno k použití) 10 gelů Tris-barbitálový pufr (zásobní roztok) 3 lahv. po 75 ml Ředící roztok pro amidočerň (zásobní roztok) 1 lahv. 60 ml Amidočerň (zásobní roztok) 1 lahv. 20 ml Odbarvovací roztok (zásobní roztok) 1 lahv. 100 ml Hemolyzační roztok (připrav. k použití) 1 lahv. 20 ml Aplikátory (7 zubů) (připraveno k použití) 1 bal. po 10 ks Tenké filtrační papíry 1 bal. po 10 ks OPTIMÁLNÍ ŘÍZENÍ VYSLEDOVATELNOSTI : Všechna činidla ze stejné sady se musejí používat společně. DOSAŽENÍ OČEKÁVANÝCH VÝKONŮ : Musí se dodržovat pokyny z příbalového letáku. 1. AGARÓZOVÉ GELY Agarózové gely jsou připraveny k použití. Každý gel obsahuje : agarózu ; tlumicí roztok ph 8.5 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Nosné medium pro elektroforézu. Skladování, stabilita a známky poškození Skladujte v horizontální poloze v originálních ochranných obalech šipkou na přední straně krabice směrem nahoru. Lze skladovat při pokojové teplotě (15-30 C) nebo v chladničce (2-8 C). Zamezit prudkým změnám teploty neskladovat v blízkosti oken nebo tepelného zdroje. Stabilní do doby expirace vyznačené na krabici či štítcích na obalech gelů. NEMRAZIT! Nepoužívejte : (i) v případě nálezu krystalů nebo precipitátů na povrchu gelů a pokud struktura gelu v důsledku zmrazení změkne, (ii) jsou-li přítomny mikroby a plísně, (iii) abnormální množství tekutiny v obalu gelu (výsledek vypocení pufru z gelu v důsledku nesprávného skladování). - 106 - SEBIA NÁVOD - Czech
2. HYDRAGEL TRIS-BARBITAL PUFR Každá lahvička zásobního tlumivého roztoku se může zředit destilovanou nebo deionizovanou vodou až na 1 litr. Pracovní roztok po naředění obsahuje : tlumicí roztok ph 9.2 ± 0.5. Elektroforetický pufr. HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20-2018/07 Skladování, stabilita a známky poškození Pufr lze skladovat při pokojové teplotě nebo v ledničce. Je stabilní několik let, při nejmenším do data expirace vyznačeného na balení či lahvičkách. Zředěný pufr je stabilní po dobu 1 roku při pokojové teplotě v uzavřené láhvi. Při zjištění zákalu v roztoku, který je obvykle známkou mikrobiální kontaminace, je nutno pufr vylít. 3. ŘEDÍCÍ ROZTOK PRO AMIDOČERŇ Zásobní ředicí roztok barvicího roztoku musí být použit podle pokynů v odstavci "AMIDOČERŇ". Obsahuje kyselý roztok ph 2. barvícího roztoku s amidočerní. Skladování, stabilita, známky znehodnocení roztoku Zásobní roztok ředícího roztoku pro amidočerň se skladuje při pokojové teplotě nebo při teplotě 2-8 C. Zásobní roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu či na štítku lahvičky. NEMRAZIT. Nepřidávat azid sodný. 4. AMIDOČERŇ Koncentrát amidočerni je viskózní roztok, který může gelovatět. Citlivost zásobního barvícího roztoku není změněna zvýšením viskozity nebo ztuhnutím. V každém případě je pro dosažení správného rozpuštění barvícího roztoku nutné dodržet následující postup : 1. Přidejte 15 ml ředícího roztoku pro amidočerň do lahvičky s koncentrovanou amidočerní. 2. Pečlivě uzavřete lahvičku. 3. Lahvičku pořádně protřepejte po dobu cca 5 sekund. 4. Přelijte tento roztok do odměrného válce pro přípravu barvicího roztoku. 5. Opakujte tento krok 2-3x, až do úplného rozpuštění koncentrované amidočerni. 6. Nalijte zbylý obsah lahvičky s ředícím roztokem pro amidočerň do odměrného válce a doplňte do 300 ml destilovanou nebo deionizovanou vodou. 7. Promíchávejte obsah válce po dobu 5-10 minut. Barvící roztok je připraven k použití. Pracovní barvicí roztok po naředění obsahuje : kyselý roztok o ph 2 ; amidočerň ; ethylenglykol ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Barvení gelů s rozdělenými bílkovinami po elektroforéze. DŮLEŽITÉ : Barvicí roztok je určen k obarvení pouze 10 gelů. Roztok vyměňte po 10 použitích k barvení. Skladování, stabilita, známky znehodnocení roztoku Zásobní i pracovní barvicí roztok se skladuje při pokojové teplotě nebo v chladničce v těsně uzavřených nádobách tak, aby nedošlo k odpařování. Zásobní barvicí roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky rozpouštědla pro barvicí roztok. Pracovní barvicí roztok je stabilní 1 měsíc. Stabilita roztoku může být prodloužena na 3 měsíce, pokud je uchováván v chladničce. Ihned po použití musí být uzavřené nádoby uloženy v chladničce. Neskladujte pracovní barvicí roztok v blízkosti zdrojů tepla. Zásobní ředicí roztok pro barvicí roztok skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce. Roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky rozpouštědla pro barvicí roztok. NEMRAZIT. 5. ODBARVOVACÍ ROZTOK Každá lahvička zásobního odbarvovacího roztoku je určena k přípravě 100 litrů pracovního odbarvovacího roztoku. Je výhodné připravovat jen 1 litr pracovního roztoku doplněním 1 ml zásobního roztoku do 1 litru destilovanou nebo deionizovanou vodou. Po zředění vznikne odbarvovací roztok obsahující kyselý roztok ph 2. Roztokem se odstraňuje přebytečné množství barvičky a odbarvuje se pozadí agarózové plotny. Skladování, stabilita, známky znehodnocení roztoku Zásobní odbarvovací roztok skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce. Roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu či na štítku lahvičky odbarvovacího roztoku. Pracovní odbarvovací roztok je stabilní jeden týden při skladování při pokojové teplotě v uzavřené láhvi. Nepřidávat azid sodný. Pracovní odbarvovací roztok zneškodněte, pokud se změní jeho vzhled, například se stane zakaleným v důsledku bakteriální kontaminace. Pro zabránění mikrobiální proliferace ve zředěném odbarvovacím roztoku, který má být skladován déle než dva týdny, přidejte 5 μl/dl roztoku ProClin 300 nebo roztoku CLEAN PROTECT (SEBIA, KAT. Č. 2059, 1 lahvička, 5 ml). Viz příbalový leták s návodem k použití roztoku CLEAN PROTECT. Pracovní odbarvovací roztok s přídavkem roztoku ProClin nebo CLEAN PROTECT je při pokojové teplotě nebo v chladničce v uzavřené nádobě stabilní do doby exspirace vyznačené na obalu sady nebo na štítku lahvičky. - 107 -
6. HEMOLYZAČNÍ ROZTOK HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20-2018/07 Hemolyzační roztok je připraven k použití. Obsahuje : tlumicí roztok ph 6.1 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. K hemolýze erytrocytů. Skladování, stabilita a známky poškození Skladovat při pokojové teplotě nebo v chladničce. Stabilní do data expirace vyznačeného na štítcích lahviček a obalu kitu. Nepoužívat při změně vzhledu roztoku, např. při výskytu zákalu, který znamená mikrobiální kontaminaci. 7. APLIKÁTORY Jednorázové aplikátory k nanesení vzorků - připraveny k použití. Skladování Skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. 8. TENKÉ FILTRAČNÍ PAPÍRY Proužky tenkého filtračního papíru, na jedno použití. Jsou určeny k odsání přebytečné tekutiny z povrchu gelu před aplikací vzorků. Skladování Skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. POTŘEBNÉ REAGENTY NEOBSAŽENÉ V BALENÍ 1. FYZIOLOGICKÝ ROZTOK samostatně v laboratoři 0,15 M (9 g/l) roztok NaCl v destilované vodě. K proprání erytrocytů. Skladování, stabilita a známky zhoršení kvality Skladuje se při teplotě místnosti, nebo v chladničce. Po třech měsících nebo při známkách mikrobiálního znečištění zákalu vylijte. Po přidání 0.1 g/dl azidu sodného lze skladovat i delší dobu. 2. FIXAČNÍ ROZTOK (volitelná položka) Nejméně 15 minut před použitím, připravte roztok obsahující (obj./obj.) : 60 % etanolu ; 10 % kyseliny octové a 30 % destilované vody. Dobře promíchejte. Používá se k fixaci separovaných hemoglobinů v agarózových gelech. Skladování, stabilita a známky zhoršení kvality Skladujte fixační roztok v těsně uzavřených nádobách při pokojové teplotě Vydrží asi 3 měsíce. Používejte každých 150 ml maximálně na 4 gely. POZNÁMKY : Zkoušky provedené pro ověření reagentů prokázaly, že pro různé roztoky a použití přizpůsobeného vybavení pro rekonstituci objemu, nemají odchylky objemu ± 5 % z konečného objemu vliv na výsledek analýzy. Destilovaná nebo deionizovaná voda používaná k ředění roztoků musí být prostá bakteriální proliferace a plísní (použijte filtr 0,45 µm) a musí mít vodivost nižší než 3 µs/cm, což odpovídá rezistivitě vyšší než 0,33 MΩ x cm. ZAŘÍZENÍ NEZBYTNÁ K PROVEDENÍ TESTU 1. Zdroj proudu : MG 300 SEBIA, kat. č. 1302 nebo MG 500 SEBIA, kat. č. 1303. 2. HYDRAGEL K20 APPLICATOR SEBIA, kat. č. 1409, včetně nosiče aplikátorů HYDRAGEL K20. 3. Vlhká komůrka kat. č. 1270. 4. Elektroforetická komora, K20 SEBIA, kat. č. 1400. 5. Nádobky a držáky gelů pro manipulaci s nimi HYDRAGEL Accessory Kit SEBIA, kat. č. 1420. 6. Pipety 5 µl, 10 µl a 200 µl. 7. Sušička - Inkubátor, IS 80 SEBIA, kat. č. 1430. 8. Denzitometr / skener pro skenování gelových ploten 82 x 51 mm : software pro plochý skener HYRYS SEBIA, DVSE SEBIA nebo PHORESIS. Pro postupy činnosti a kalibrace viz pokyny výrobce. - 108 -
ANALYZOVANÉ VZORKY Odběr a skladování vzorků Nejlepších výsledků se dosahuje analýzou čerstvých nesrážlivých vzorků krve. Lze použít antikoagulancia jako EDTA, citrát, heparin - vyhnout se jodoacetátu. Po odběru lze skladovat až 5 dní v chladničce. vzorku Před odebráním krve pro přípravu promíchejte zkumavku. Centrifugujte krev s antikoagulačním činidlem pro získání červených krvinek. Odstraňte plazmu. Erytrocyty promyjte 2 x 10 objemy fyziologického roztoku ; pokud pracujeme s objemy erytrocytů menšími než 10 µl je nutné věnovat práci velkou péči. Odstraňte přebytek fyziologického roztoku z povrchu (nad erytrocyty) a promíchejte erytrocyty na vortexu před odebráním 10 µl pro hemolyzaci. Hemolyzujte 10 µl erytrocytů se 130 µl hemolyzačního činidla. Promíchejte na vortexu po dobu 10 sekund a po dobu 5 minut nechte inkubovat při pokojové teplotě. POZN. : - příprava hemolyzátu z krve u anemiků (100 g/l Hb) a anemiků s Hb pod 70 g/l objem erytrocytů musí být zvýšen z 10 µl na 15 µl resp. 20 µl, - hemolyzát se nemusí filtrovat ani centrifugovat, - hemolyzační roztok ze setu nepůsobí na nestabilní hemoglobin Bart. POZNÁMKA : Odběrové zkumavky a centrifugační parametry pro biologické vzorky jsou popsány v dostupné dokumentaci k předanalytické fázi pro biomedicínskou analýzu (údaje poskytnuté výrobci for zkumavek, návody a doporučení k odběru biologických vzorků ). Nejsou-li v návodu k použití pro typ zkumavek, které mají být použity, nebo k centrifugaci uvedeny žádné pokyny, postupujte podle této dokumentace a v případě rozměrů zkumavek, které mají být použity, postupujte podle dokumentu SEBIA "Charakteristiky zkumavek používaných podle přístroje". Předanalytická fáze musí být provedena podle stavu poznání, různých doporučení, mimo jiné doporučení výrobců zkumavek a platných předpisů. PRACOVNÍ POSTUP I. MIGRACE 1. Umístěte HYDRAGEL K20 aplikátorový nosič na rovnou plochu (viz Obr. 1) a zvedněte část s očíslovanými zuby. 2. Naneste 120 µl destilované(deionizované) vody na dolní třetinu rámečku vyznačené na nosiči aplikátoru. 3. Z obalu opatrně vyjměte agarózovou plotnu. 4. Gelovou plotnu rychle osušte tenkým filtračním papírem tak, že jej z jedné strany narolujete, aby přilnul k celé ploše a rychle odstraňte. UPOZORNĚNÍ : Neponechávejte tento filtrační papír delší dobu na povrchu hrozí dehydratace gelu! 5. Opřete plotnu okrajem o zarážku v dolní části vyznačeného rámečku - gelem k sobě (Obr. 2). 6. Nyní gel ohněte a pokládejte tak, aby se voda rovnoměrně rozprostřela pod celým gelem bez tvorby vzduchových bublinek. Gel musí být v rámečku zarovnán (viz obr. 2). 7. Snižte nosič aplikátoru očíslovanými zoubky dolů do střední polohy se západkou v horní poloze. 8. Umístěte jeden aplikátor na rovnou plochu s čísly jamek v pravé horní pozici (Obr. 3). 9. Do jamek aplikátoru pipetujte 10 µl vzorku. Vzorky je nutno napipetovat do aplikátoru v průběhu 2 minut! - aplikátor použijte okamžitě, - pro delší uchování (až 8 hodin) umístěte aplikátor do vlhké komory zoubky nahoru, uchopte za plastikovou část chránící zoubky a celou komoru umístěte do chladničky. Podrobnosti najdete v návodu pro vlhkou komoru. 10. Odlomte ochranný rámeček zoubků aplikátoru 11. Umístěte aplikátor do pozice č. 4 na nosiči. DŮLEŽITÉ : Čísla natištěná na aplikátoru musí směřovat k obsluze (Obr. 4). 12. Nyní snižte nosič tak, aby se aplikátor dostal do kontaktu s povrchem gelu. NESNIŽOVAT PRUDCE! 13. Po 60 sekundách aplikátor uvolněte, vyjměte a vyhoďte. 14. Gelovou plotnu vložte do migrační elektroforetické komory dle polarity vyznačené na gelu - dolní částí gelu na katodickou stranu. Při použití komory SEBIA K20 vložte HYDRAGELovou plotnu do zubů můstku gelem dolů a ten pak ponořte do pufru. Okraje plotny budou ponořeny asi 1 cm. Podrobnosti najdete v návodu pro migrační komoru K20. 15. Připojte dělící komoru ke zdroji proudu. PODMÍNKY DĚLENÍ Objem pufru ke každé elektrodě Celkový objem pufru Čas dělení Konstantní napětí Počáteční proud (na gel) SEBIA K20 150 ml 300 ml 15 minut 165 V 7 ± 2 ma 16. Po migraci odpojte komoru a vyjměte gelovou plotnu. - 109 -
II. FIXACE Zpracujte gel jedním z následujících postupů : Horkovzdušná fixace (doporučuje se pouze s Inkubátorem-Sušičkou SEBIA IS 80) : Gel zcela osušte v inkubátoru-sušičce při 80 C (asi 10 min). Fixace pomocí fixačního roztoku : 1. Vložte gel do držáku. 2. 150 ml fixačního roztoku nalejte do jedné z nádobek HYDRAGEL K20 Acc. Kitu. 3. Gel ponořte na 15 minut do fixačního roztoku. 4. Gel vyjměte a osušte při 80 C. DŮLEŽITÉ : Gel musí být perfektně suchý. III. BARVENÍ A ODBARVOVÁNÍ 1. Po usušení a ochlazení ponořte usušený gel do barvícího roztoku na 5 minut. 2. Odbarvěte ve třech po sobě následujících lázních s odbarvovacím roztokem dokud není pozadí zcela bezbarvé a průhledné. 3. Odsajte přebytečnou tekutinu z povrchu gelu tenkým papírem a osušte gel při 80 C teplého vzduchu. Je-li třeba, očistěte zadní plastikovou podpůrnou část gelové plotny vlhkým měkkým hadříkem nebo buničinou. IV. SKENOVÁNÍ Nasnímejte denzitometrem / skenerem výběrem vhodného programu snímání. Při použití denzitometrů HYRYS nebo DVSE, přiložte frakci A 2 na 5 mm značku skenovací plochy nulové pozadí se vytvoří mezi A 2 a frakcemi karbonát-anhydrázy v nejnižším bodě. POZNÁMKA : Pro zajištění nejpřesnějších a nejkonzistnějších výsledků, proveďte následující : - Upravte délku snímání, aby zahrnula celý elektroforetický záznam ( 30 mm). - Pokud je zapotřebí, umístěte minima na obě strany frakce A 2 (pokud nikoli, nechte minima tam, kde jsou automaticky umístěna). Je nutné výsledek odečítat bez jakéholiv prodlení. Pro porovnání v budoucnosti max. 3 měsíce, lze skladovat v ochranném obalu na suchém, tmavém místě, v bezpečné vzdálenosti od zdrojů tepla. KONTROLA KVALITY Doporučuje se zahrnout do každé série analýz zkoušku kontrolní krve (například Normal Hb A2 Control, SEBIA, kat. č. 4778 nebo Pathological Hb A2 Control, SEBIA, kat. č. 4779) nebo vyšetření kontrolního vzorku krve s obsahem hemoglobinů A, F, S a C (například Hb AFSC Control, SEBIA, kat. č. 4792). VÝSLEDKY Hodnoty Denzitometrické skenování nabarvených polí elektroforegramů (procentuálních hodnot) jednotlivých hemoglobinových zón. Referenční hodnoty (průměr ± 2 SD) 200 zdravých mužů a žen metodou HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 : Hemoglobin A 96.5% Hemoglobin F < 2.0% (*) Hemoglobin A 2 3.5% (*) viz čl. Interference a Omezení Doporučuje se, aby každá laboratoř stanovila své vlastní referenční hodnoty. Interpretace 1. Kvalitativní abnormality : hemoglobinopatie Většina hemoglobinopatií vzniká následkem jiného uspořádání genomu (Hb genu) Změněný gen tvoří hemoglobiny, u kterých může docházet ve srovnání s HbA k jinému pořadí nebo záměně aminokyselin v globinu. Klinický význam takových změn závisí na typu a pořadí aminokyselin. U klinicky významných onemocnění jsou postiženy řetězce alfa, beta (gama). Dnes je známo více než 200 variant hemoglobinů u dospělých jedinců. Existují čtyři hlavní abnormální hemoglobiny, zasluhující zvláštního klinického zájmu S, C, E a D. HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 kity jsou určeny k předběžné identifikaci hemoglobinopatií a talasemií. K potvrzení abnormálních nálezů je nutno použít další testy (např. elektroforézu na kyselých agarózových gelech). Hemoglobin S Nejčastěji detekovaný hemoglobin. Vzniká záměnou kys. glutamové (kyselé AK) za valin (neutrální AK) v beta řetězci. Elektroforetická pohyblivost je snížena. Na alkalicky pufro-vaném gelu HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20, Hb S migruje mezi frakcemi A a A 2. Hemoglobin C Glutamová kyselina beta řetězce je nahrazena lyzinem (bazická AK). Jeho pohyblivost je silně omezena. Na alkalicky pufrovaném gelu HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 metody je Hb C navrstven s Hb E a Hb A 2 ve společné zóně. Pokud tato frakce přesahuje 15 % je velmi pravděpodobná přítomnost Hb C a Hb E. Hemoglobin E Glutamová kyselina v beta řetězci je nahrazena lyzinem. Pohyblivost Hb E je stejná jako Hb C na gelech soupravy HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20. Na rozdíl od Hb C se však při dělení na kyselém gelu (HYDRAGEL ACID(E) HEMOGLOBIN(E) K20) neodděluje od Hb A. Tato jeho vlastnost dovoluje odlišení Hb E od Hb C. - 110 -
Hemoglobin D Glutamová kyselina beta řetězce je nahrazena glutaminem. Na gelech soupravy HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 se Hb D pohybuje stejně jako hemoglobin S. Na kyselém gelu (HYDRAGEL ACID(E) HEMOGLOBIN(E) K20) se však Hb D neoddělí od Hb A ; tato vlastnost dovoluje odlišení Hb S od Hb D. 2. Kvantitativní abnormality : Talasemie Talasemie představují nesourodou skupinu genetických poruch charakterizovanou sníženou syntézou jednoho nebo několika typů polypeptidových řetězců. Molekulární mechanizmus tohoto snížení nebyl do dneška plně popsán. Existují dva typy talasemiových syndromů : Alfa-talasemie Jsou charakterizovány snížením syntézy alfa řetězců, čímž je následně postižena tvorba všech normálních hemoglobinů. Nadměrná syntéza beta a gama řetězců v poměru k řetězcům alfa vede ke tvorbě tetramerů : hemoglobin Bart = g4, hemoglobin H = ß4. Beta-talasemie Jsou charakterizovány poklesem syntézy beta řetězců. Procenta hemoglobinu F a hemoglobinu A 2 jsou zvýšena s ohledem na hemoglobin A. 3. Migrační typy Normální migrace hemoglobinů A (A 0 + A 1 ) A (A 0 + A 1 ) F S - D A 2 A 2 - C - E karboanhydráza karboanhydráza aplikační bod Migrace hlavních abnormálních hemoglobinů A 0 : neglykovaná frakce normálního hemoglobinu A dospělých. A 1 : glykovaná frakce normálního hemoglobinu A dospělých. Pozn. : U typů dělení viz výše je katoda dole a anoda nahoře. Interference a omezení Nepoužívejte hemolyzované vzorky. Pokud je detekován abnormální hemoglobin, jenž se chová odlišně od hlavních variant hemoglobinu, je nutno použít další prostředky určené k identifikaci (izoelektrická fokusace, elektroforéza globinových řetězců) nebo odeslat vzorky krve do specializované laboratoře. Denzitometrické stanovení Hb F nebo podobného hemoglobinu, jenž tvoří jen malé procentuální zastoupení lze považovat jen za semikvantitativní, protože hodnoty pod 2-3 % celkového hemoglobinu jsou nepřesné. Někteří homozygoti "S" přijímají při léčení přípravek "Hydrea " (hydroxyurea), který může indukovat syntézu fetálního hemoglobinu. Mobilita indukovaného Hb F na HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E) gelech byla v některých případech odlišná od fyziologického Hb F. U vzorků skladovaných déle než 7 dní se může stín umístěný za Hb A frakcí zobrazit jako frakce. Pozor, aby nebyla tato frakce interpretována jako hemoglobinový variant, např. H nebo Bart. Problémy Pokud testy nevycházejí při dodržení veškerých instrukcí pro přípravu, skladování a provedení testu uvedených v příbalovém letáku, volejte Technicko- Servisní středisko vašeho dodavatele. Bezpečnostní datové listy soupravy činidel a informace o čištění a likvidaci odpadů, označování a bezpečnostní pravidla používaná společností SEBIA, obaly pro přepravu biologických vzorků a informace o čistění přístroje jsou k dispozici na webových stránkách SEBIA : www.sebia.com. HODNOTY Všechny výsledky jsou založeny na studiích za použití HYDRAGELů a zařízení fy SEBIA a srovnatelných, komerčně dostupných agarózových gelových systémů. Pro porovnávací studie byla navíc analyzovány typy jednotlivých hemoglobinů a jejich hodnoty byly stanoveny jinou validní metodou. Níže jsou uvedeny příklady výsledků reprezentativních vzorků z hlediska jednotlivých hodnot. Všechny elektroforeogramy byly interpretovány vizuálně. Denzitometr HYRYS fy SEBIA byl použit pro denzitometrická hodnocení. Reprodukovatelnost na gelu Každý ze tří krevních vzorků byl podroben analýze na HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 gelech stejné šarže. Každý vzorek byl testován na všech 7-mi drahách gelu. Tabulka ukazuje průměry, SD a CV pro každý jednotlivý hemoglobin všech tří vzorků, který byl vypočítán z denzitometricky stanovených procentuálních hodnot pro každou dráhu. Navíc žádné z opakování neukázalo falešně pozitivní nebo falešně negativní hodnoty. - 111 -
FRAKCE PRŮMĚR (%) SD CV (%) Normální krev Hb A 97.4 0.1 0.1 Hb A 2 2.6 0.1 5.3 Zvýšené Hb A 2 Hb A 95.2 0.2 0.2 Hb A 2 4.8 0.2 4.4 Zvýšené Hb C Hb A 56.7 0.4 0.8 Hb C 43.3 0.4 1.0 Reprodukovatelnost mezi gely Krevní vzorky byly podrobeno testům na gelech HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 stejné šarže. Analyzované vzorky zahrnovaly 7 vzorků s abnormálním hemoglobinem (Hb S, Hb F nebo Hb C), 2 vzorky se zvýšeným Hb A 2 a zbylé vzorky byly normální krve. Průměr, SD a CV byly kalkulovány pro každý vzorek a každou frakci. Rozsah průměrů, SD a CV a průměr CV reprezentující směs jednotlivých komponent je uveden v tabulkách níže. Navíc žádné z opakování neukázalo falešně pozitivní nebo falešně negativní hodnoty. FRAKCE PRŮMĚR (%) SD CV (%) PRŮMĚR CV (%) Hb A 18.0-97.8 0.1-1.0 0.1-4.0 0.8 Hb F 13.3-76.3 0.5-0.6 0.7-3.4 1.8 Hb C 21.5-43.5 0.2-0.3 0.6-1.1 0.8 Hb S/D 9.7-84.1 0.1-0.6 0.4-2.6 1.1 Hb A 2 2.2-5.7 0.1-0.2 2.3-7.6 4.0 Přesnost - Stanovení Hemoglobinových Abnormalit Šedesát tři (63) různých krevních vzorků bylo analyzováno pomocí HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 soupravy a jiného, komerčně dostupného agarózového gelového systému. Krevní vzorky a příslušné dg. byly poskytnuty nemocnicemi. Elektroforetické analýzy byly provedeny na rutinních alkalických a kyselých gelech a / nebo pomocí HPLC. Všechny abnormální hemoglobiny nebo abnormální hodnoty normálních hemoglobinů detekované metodou HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 byly srovnatelné s porovnávacím gelovým systémem, nemocničními výsledky a klinickou dg. Nebyly pozorovány případy falešně pozitivní jako např. detekce abnormální frakce nebo abnormální hodnoty normální frakce. Přesnost - Kvantitativní Stanovení Hb A 2 Hodnoty Hb A 2 byly stanoveny v 51 krevních vzorcích s normální a zvýšenou Hb A 2 denzitometrií elektroforetických stanovení na HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 gelech. Hodnoty naměřené oběmi procedurami byly analyzované statistickou procedurou lineární regrese. Následující tabulka ukazuje výsledky lineární regresne (y = HYDRAGEL). Korelační koef. Y-úsek Sklon Rozsah % Hodnot (na SEBIA systému) 0.973-0.344 0.963 1.5-5.7-112 -
BIBLIOGRAPHIE / BIBLIOGRAPHY 1. Fairbanks V.F., ed. (1980) Hemoglobinopathies and thalassemia: Laboratory methods and case studies. Brian C. Decker, New York. 2. Galacteros F. (1986) Thalassémie, drépanocytose et autres hémoglobinopathies. Techniques et Biologie, 3, 174-178. 3. Huisman T.H.J. and. Jonxis J.H.P (1977) The hemoglobinopathies: techniques of identification. Marcel Dekker, New York. 4. Krauss J.S., Drew P.A., Jonah M.H., Trinh M., Shell S., Black L. and Baisden C.R. (1986) Densitometry and microchromatography compared for determination of the hemoglobin C and A 2 proportions in hemoglobin C and hemoglobin SC disease and in hemoglobin C trait. Clin. Chem. 32, 5, 860-863. 5. Livingstone C. (1986) The hemoglobinopathies. Edit. London. 6. Maier-Redelsberger M., Girot R. (1989) Diagnostic biologique des maladies de l hémoglobine. Feuillets de biologie, 170. 7. Schneider R.G. (1978) Methods for detection of hemoglobin variants and hemoglobinopathies in the routine clinical laboratory. CRC Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 9, 243-271. 8. Vovan L., Lara-Russo D., Orsini A. (1985) Diagnostic biologique des hémoglobinoses. Ann. Pédiat. 32, 9, 780-789. 9. Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : Justification et validité d un test de diagnostic ou de dépistage-sensibilité-spécificité. Impact-Internat, 1986 ; Sept : 93-97. - 150 -
SCHÉMAS / FIGURES Figure 1 Figure 2 1 2 3 4 5 6 7 Figure 3 Figure 4 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7-151 -
Benelux SCS / Comm. V Jan Olieslagerslaan 41 1800 Vilvoorde Belgique / België Tél. : 32 (0)2 702 64 64 Fax : 32 (0)2 702 64 60 e-mail : sebia.benelux@sebia.be Brasil Edifício Baker Office Tower Rua Barão do Triunfo, 73, conjunto 51 CEP 04602-000 Bairro Brooklin Paulista, São Paulo - SP Brasil Tel. : 55 11 3849 0148 Fax : 55 11 3841 9816 e-mail : sebia@sebia.com.br GmbH Münsterfeldallee, 6 36041 Fulda Deutschland Tel. : 49 (0)661 3 30 81 Fax : 49 (0)661 3 18 81 e-mail : sebia@sebia.de Hispania S.A. C/Sicilia, n 394 08025 Barcelona España Tel. : 34 93 208 15 52 Fax : 34 93 458 55 86 e-mail : sebia@sebia.es Inc. 400-1705 Corporate Drive Norcross, GA 30093 U.S.A. Tel. : 1 770 446-3707 Fax : 1 770 446-8511 e-mail : info@sebia-usa.com Italia S.r.l. Via Antonio Meucci, 15/a 50012 Bagno a Ripoli (FI) Italia Tel. : 39 055 24851 Fax : 39 055 0982083 e-mail : info@sebia.it UK Ltd River Court, Meadows Business Park Station Approach, Blackwater Camberley, Surrey, GU17 9AB United Kingdom Tel. : 44 (0)1276 600636 Fax : 44 (0)1276 38827 e-mail : info@sebia.co.uk Parc Technologique Léonard de Vinci CP 8010 Lisses - 91008 EVRY Cedex - France Tél. : 33 (0)1 69 89 80 80 - e-mail : sebia@sebia.com Shanghai Representative Office Cross Tower, Room 2306-07 318 Fuzhou Road Shanghai 200001 China Tel. : 00 86 (21) 6350 1655 Fax : 00 86 (21) 6361 2011 e-mail : sebia@sebia.cn