Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakologie a toxikologie DIPLOMOVÁ PRÁCE

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakologie a toxikologie DIPLOMOVÁ PRÁCE Studium interakce platinových cytostatik s BCRP lékovým transportérem pomocí MTT cytotoxicitního testu Hradec Králové, 2008 Markéta Horká

Poděkování Na tomto místě bych ráda poděkovala Mgr. Zuzaně Vackové a PharmDr. Martině Čečkové, Ph.D. za jejich pomoc a trpělivost při vypracování této diplomové práce. Prohlášení Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem, které jsem vypracovala samostatně. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. 2

Obsah 1. SEZNAM ZKRATEK... 4 2. TEORETICKÁ ČÁST... 5 2.1. Protinádorová terapie... 5 2.1.1. Chemoterapie... 5 2.1.2. Radioterapie... 8 2.1.3. Chemoradioterapie... 9 2.1.4. Onkochirurgie... 9 2.2. Platinová cytostatika... 10 2.3. Léková rezistence... 13 2.4. Transportní proteiny rodiny ABC... 14 2.4.1. P-glykoprotein... 15 2.4.2. MRP... 16 2.4.3. BCRP... 17 2.5. Rezistence na platinová cytostatika... 18 3. CÍL PRÁCE... 19 4. METODIKA... 20 5. VÝSLEDKY... 24 6. DISKUZE... 29 7. ZÁVĚR... 31 8. LITERATURA... 32 3

1. SEZNAM ZKRATEK ATP BCRP BSA DMEM DMSO EDTA EGFP FCS GSH L-BSO MDCK MDR MRP MTT MXR PBS P-gp SDS adenosintrifosfát breast cancer resistance protein Bovine Serum Albumin, bovinní sérový albumin Dulbecco s Modified Eagle Media, růstové medium savčích buněčných linií dimethylsulfoxid sodná sůl ethylendiamintetraoctové kyseliny Enhanced Green Fluorescent Protein Fetal Calf Serum, fetální telecí sérum glutathion L-buthioninsulfoximin Madin-Darby Canine Kidney, kokršpanělí ledvinná epiteliální (distální tubulus a sběrný kanálek) buněčná linie multidrug resistance, mnohočetná léková rezistence multidrug resistance associated protein 3-(4,5-dimethyllthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid mitoxantrone resistance protein fosfátový izotonický pufr P-glykoprotein sodium dodecyl sulfate, dodecylsulfát sodný 4

2. TEORETICKÁ ČÁST 2.1. Protinádorová terapie Zhoubná nádorová onemocnění zaujímají čelní místa v úmrtnosti lidí ve vyspělém světě, proto je věnováno enormní úsilí jejich zkoumání, prevenci a léčbě. I přes velké pokroky zůstává mnoho otazníků kolem mechanismu vzniku zhoubných novotvarů. Přesto zaznamenává výzkum a protinádorová léčba slibné výsledky, které snad pomohou v budoucnu plně kontrolovat a účinně léčit rakovinné bujení. V současnosti má léčba nádorových onemocnění několik přístupů. Nutno podotknout, že tyto přístupy se často navzájem kombinují pro zvýšení efektivity léčby. Mezi základní kameny současné léčby onkologických onemocnění patří chemoterapie, radioterapie, chemoradioterapie a onkochirurgie. Díky novým poznatkům se objevují i jiné, alternativní přístupy jako například chemoembolizace, kryoterapie, laserová terapie, hypertermie, fotodynamická terapie aj. Zřejmě nejucelenější informace o protinádorové terapii v České republice poskytuje v současnosti Česká onkologická společnost (ČLS JEP). 2.1.1. Chemoterapie Chemoterapeutika, léky připravené chemickou syntézou, se používají jak k léčbě onkologických, tak i jiných (bakteriálních, plísňových, virových a parazitárních) onemocnění. V onkologii se pod pojmem chemoterapie rozumí podávání léků s cytotoxickým účinkem, bez ohledu na to, zda jsou původu syntetického, či jde o deriváty látek získaných z rostlin nebo plísní. Cílem je zajistit optimální farmakoterapeutický účinek, tzn. dlouhodobou kompletní remisi při minimální toxicitě a za současné prevence vývoje rezistence. Dosažení tohoto cíle je realizováno prostřednictvím zvyšování dávek léčiv, kombinací různých cytostatik, využitím podpůrné terapie nebo léčby antagonisty, kombinací cytostatické léčby s jinou terapií (chirurgickou, radioterapií, viz dále), biochemickou modulací účinku, vhodnou aplikační cestou a využitím cirkadiálních rytmů pro farmakologii cytostatik. Protinádorová chemoterapie používá cytotoxické nebo cytostatické látky. Obě skupiny působí různými mechanismy na struktury, které jsou obecně přítomny ve všech buňkách a jsou nutné pro jejich přežití. Ovlivňují funkčnost DNA nebo jiných struktur nutných k dělení 5

buněk výsledkem je zastavení růstu nebo smrt zasažených buněk. Antitumorózní účinek závisí na selektivitě, s jakou cytostatikum ovlivňuje buněčný cyklus. Cytostatika působí zejména na množící se buňky v proliferativní fázi (na rozdíl od G 0, tj. klidové fáze). Mají buď fázově nespecifický nebo fázově specifický účinek. Fázově nespecifický účinek postihuje buněčný cyklus ve všech jeho fázích a vede ke smrti zasažených buněk exponenciálně se zvyšující se dávkou. Účinek fázově specifický postihuje určité fáze cyklu. Čím rychlejší je dělení buněk, tím je účinek intenzivnější. Se stoupající dávkou se rychlost zabíjení buněk zvyšuje nejprve exponenciálně, ve vyšších dávkách dosahuje určitého maxima. Většina chemoterapeutik působí převážně na buňky, které rostou a dělí se, což nejsou pouze buňky nádoru, ale i zdravých tkání. Chemoterapie má tedy řadu nežádoucích účinků (změny v krevním obrazu, změny na sliznicích zažívacího traktu, alopecie, průjem atd.). Léčba proto probíhá v cyklech, přestávky umožňují, aby se zasažené zdravé tkáně vzpamatovaly (mají lepší schopnost regenerace než tkáň nádorová). V nádoru se ale vyskytují i buňky které se nedělí a nejsou tedy na léčbu citlivé. Pokud jsou v jednom léčebném cyklu zničeny buňky, které se dělí, začnou se dělit i buňky, které se dosud nedělily mohou pak být léčbou zasaženy až v dalším cyklu léčby. Dělení protinádorových chemoterapeutik (Lincová, 2002): Alkylační cytostatika Chemicky reaktivní látky, které alkylují DNA. Ta se následně štěpí, případně může dojít k pevnému spojení dvou řetězců nebo samostatných molekul DNA. Takové změny vedou k nesprávné funkci buňky a znemožňují tak její dělení. Do této skupiny patří busulfan, chlorambucil, cyklofosfamid, dakarbazin, estramustin, fotemustin, ifosfamid, karmustin, lomustin, melfalan, temozolomid aj. Antimetabolity Jsou to látky, které různými mechanismy blokují syntézu stavebních kamenů DNA - buňka se tedy nemůže dělit. Tímto mechanismem ovlivňují dělení všech buněk v organismu. Patří sem 5-fluorouracil, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, cytarabin, cytosinarabinosid, fludarabin, gemcitabin, hydroxyurea, kapecitabin, kladribin; metotrexát; pemetrexed, raltitrexed, tegafurum, ftorafurum a jiné. 6

Platinová cytostatika Jsou to jednoduché chemické látky obsahující platinu. Mechanismus jejich účinku je obdobný jako u alkylačních látek. Ničí buňky ve všech stadiích buněčného cyklu. Mezi platinové komplexy patří cisplatina, karboplatina, oxaliplatina aj. Hormony Steroidní hormony se váží na receptorové proteiny v nádorových buňkách a míra odpovědi buňky na hormonální léčbu záleží na obsahu receptorů v buňce. V určitých nádorových buňkách byly nalezeny receptory specifické pro estrogeny, gestageny, androgeny a kortikoidy. Podobně jako v jádru zdravých buněk, i v nádorové buňce tvoří hormon s receptorovým proteinem pohyblivý komplex, který se váže na jaderný protein aktivující transkripci příslušných genů. Do skupiny hormonálních cytostatik patří látky steroidního charakteru, ale i sloučeniny, které nemají hormonální charakter a účinkují jinými mechanismy - inhibicí vychytávání hormonů, blokování geneze hormonů, atd. Řadí se sem například tamoxifen, anastrozol, aminoglutethimid, flutamid, goserelin, leuprolid acetát, glukokortikoidy a další. Protinádorová antibiotika Antibiotika ze skupiny antracyklinů, aktinomycinů a dalších působí interkalací - pevně se spojují s oběma řetězci DNA. Dochází k vmezeření antibiotik mezi řetězce. Toto pevné spojení brání replikaci DNA i transkripci genetické informace. Některá antibiotika rovněž způsobují poškození buněčné membrány. Mezi zástupce patří bleomycin, doxorubicin, epirubicin, idarubicin, mitomycin C, mitoxantron a další. Rostlinné alkaloidy Do této skupiny patří několik přírodních alkaloidů, které účinkují rozdílnými mechanismy. Vinca-alkaloidy - (alkaloidy z rostliny barvínku) a alkaloid kolchicin (nachází se v ocúnu): jsou mitotické jedy - znemožňují správné vytváření mikrotubulů z tubulinu, blokují dělení buněk a poškozují další funkce závislé na správné funkci mikrotubulů. Taxany: jsou deriváty látek nalezených v tisu. Patří mezi nejsilnější cytostatika. Mají odlišný účinek na mikrotubuly než vinca-alkaloidy a kolchicin vedou k polymerizaci tubulinu na stabilní mikrotubuly, které ale ztrácejí původní funkci. To rovněž vede k zablokování buněčného dělení a k dalším buněčným poruchám. 7

Inhibitory topoizomeráz: dvojšroubovice DNA se účinkem topoizomeráz rozplétá a rozkládá na jednotlivé segmenty, které se po replikaci opět skládají a splétají dohromady. Při inhibici topoizomerázy I a topoizomerázy II jsou tyto mechanismy blokovány replikace je znemožněna a DNA se rozpadá. Patří sem docetaxel, etopozid, VP-16, irinotekan, paklitaxel, topotekan, vinblastin, vinkristin, vinorelbin a jiné. Antidota, protektiva Skupina léčiv, které chrání organismus před některými nežádoucími účinky chemoterapie nebo ozařování. Patří sem amifostin, dexrazoxan, leukovorin, mesna a další. 2.1.2. Radioterapie Radioterapie využívá k léčbě nádorů (i některých nenádorových onemocnění) ionizující záření. Asi 50% onkologických pacientů absolvuje v průběhu léčby ozáření, s cílem kurativním (dosažení vyléčení nádoru) nebo paliativním (zmírnění obtíží nádorem způsobených). Podle způsobu aplikace dělíme ozařování na zevní (teleterapie) a vnitřní (brachyterapie). Při zevním ozařování je zdroj záření mimo tělo pacienta, ozařuje se zpravidla ze vzdálenosti 1 m. Při brachyterapii se zavádí zářič přímo do oblasti nádoru nebo dutin, které s ním souvisejí. V posledních dvou desetiletích 20. století se vývoj radioterapie velmi urychlil. Její účinnost se dramaticky zlepšila s příchodem lineárních urychlovačů a počítačových plánovacích systémů umožňujících trojrozměrné modelování rozložení dávky záření. To umožnilo využití nových zobrazovacích technik, zejména počítačové tomografie (CT) a magnetické resonance (MR) pro plánování radiační léčby. Velmi pokročilo také poznání biologického účinku záření na úrovni buněčné i molekulární. Nádory se v citlivosti na záření značně liší. Extrémně citlivé jsou nádory lymfatické tkáně, leukemie a nádory ze zárodečných buněk.. Středně citlivé jsou karcinomy, radiorezistentní jsou zejména nádory mozku či pojivové a svalové tkáně. Radiosenzitivita, však neznamená zároveň vyléčitelnost zářením, radiokurabilitu. Lymfomy, které jsou velmi radiosenzitivní, nemusí být vždy radiokurabilní, protože onemocnění se může znovu objevit v neozářených oblastech. Naproti tomu nádory středně radiosenzitivní, jako je např. karcinom děložního čípku, mohou být dobře radiokurabilní. Závisí rovněž na velikosti tumoru. Větší nádory obsahují větší počet nádorových buněk a je tedy obtížnější je vyléčit než nádory malé. 8

Teoreticky jsou všechny nádory lokálně vyléčitelné radioterapií, překážkou je limitovaná tolerance zdravých tkání k ozáření. 2.1.3. Chemoradioterapie V léčbě onkologických pacientů jsou neustále hledány nové terapeutické možnosti. Stále více se prosazuje kombinace jednotlivých typů protinádorové léčby. Nutnost zlepšení lokální a regionální kontroly nádorů postupně zavedla do klinické praxe kombinované použití cytostatik a ionizujícího záření. Tento způsob se považuje za jednu z cest ke zvýšení účinnosti léčby u řady malignit. Biologické mechanismy kombinované terapie jsou však značně složité, proto se je dosud nepodařilo zcela definitivně popsat. Při kombinovaném způsobu léčby může být chemoterapie podávána neoadjuvantně - před zářením či adjuvantně - po ozáření. Při podání cytostatik před i po ozáření mluvíme o tzv. sekvenčním (sendvičovém) způsobu. Chemoterapie může být podávána i současně (konkomitantně) se zářením nebo v jiných schématech. Při konkomitantní chemoradioterapii je zvýšena radiosenzitivita nádorových buněk použitím vhodných cytostatik, která jsou aplikována v určitém časovém intervalu (15 minut až 8-48 hodin před či po ozáření, nebo i kontinuálně) po určitou až celou dobu radioterapie. Tento způsob léčby je vhodný především pro léčbu lokálně pokročilých nádorů. 2.1.4. Onkochirurgie Onkologická chirurgie - onkochirurgie, představuje obor specializovaný na operační léčbu solidních zhoubných nádorů. Role chirurga v léčbě stále roste, v souvislosti s novými technickými prostředky a operačními postupy, častějším záchytem ranných fází nádorového onemocnění v důsledku modernějších vyhledávacích programů (screening). Operační léčba je základní součástí terapie solidních zhoubných nádorů u více než 30000 pacientů v České republice za rok. U časných nádorových stádií je dokonce chirurgický zákrok jediným nutným (kurativní zákrok) a další protinádorové terapie již není třeba. Chirurgie se stále častěji zapojuje také do paliativní péče o onkologicky nemocné s pokročilým nádorovým onemocněním s cílem zlepšení prognózy nemoci nebo zajištění lepší kvality života. 9

2.2. Platinová cytostatika Cl Cl Pt O NH 3 O Pt NH 3 NH 3 O NH 3 O O O O Pt O NH 3 NH 3 cisplatina karboplatina O nedaplatina O O H 2 O N Pt O N H 2 oxaliplatina O Cl NH 3 Pt Cl NH O 2 O satraplatina V současné době patří cisplatina (cis-diammindichloroplatnatý komplex) a její analog karboplatina (cis-diammincyklobutandikarboxylátoplatnatý komplex) k nejčastěji předpisovaným protinádorově účinným léčivům. Jsou užívána k terapii řady typů nádorů. Největších úspěchů je dosahováno v léčbě rakoviny varlat, nemoci s historicky velmi nízkým přežitím do doby, než byla aplikována cisplatina. Její aplikace je ale spojena s řadou omezení. Jde především o úzké spektrum nádorů, které jsou k tomuto cytostatiku citlivé. Nejčastěji se vyskytující nádory - tlustého střeva a prsu - jsou vůči působení cisplatiny citlivé velmi málo. Další omezení souvisí s tzv. získanou rezistencí, kdy nádorové buňky původně citlivé se po opakované léčbě cisplatinou stávají vůči jejímu působení rezistentní. V neposlední řadě patří k nepříznivým faktorům ovlivňujícím léčbu cisplatinou také vedlejší účinky, zejména nefrotoxicita, neurotoxicita, ototoxicita a silná nauzea. Proto vývoj nových komplexů platiny, jejichž protinádorové účinky by byly lepší nebo srovnatelné s účinností cisplatiny, představuje v současné době velmi aktuální téma pro základní i aplikovaný výzkum. Karboplatina je méně toxický platinový analog, který však vykazuje zkříženou rezistenci s cisplatinou. Výhodou je menší nefrotoxicita karboplatiny v důsledku pomalejší konverze v aktivní platinu. Velmi podobnou strukturou je nedaplatina. Klinické testy však neprokázaly téměř žádné výhody oproti karboplatině. Na druhou stranu se dosahuje zajímavých výsledků v kombinaci nedaplatiny s radioterapií nebo s jinými cytostatiky. (Fuwa et al., 2007). Složitějším komplexem platiny je oxaliplatina. Přestože tvoří méně pevnou 10

vazbu s DNA než výše zmíněné analogy, indukuje silnější apoptickou odpověď v buněčných liniích rezistentních na cisplatinu. Příčinou je odlišný mechanismus. Zatímco cisplatina má cytotoxické účinky pouze v přítomnosti intaktních genů odpovědných za reparaci DNA (tzv. mismatch repair ), oxaliplatina působí toxicky i na buňky s defektem těchto genů. Například u kolorektálního karcinomu, kde je cisplatina neúčinná, patří oxaliplatina mezi nejúčinnější protinádorové léky (Melichar, 2005). Mezi novější platinové komplexy patří satraplatina. Používá se na léčbu rakoviny prostaty a v kombinaci s jinými cytostatiky se testuje pro léčbu různých typů rakovinného bujení (www.clinicaltrials.gov). Je to v současnosti jediné klinicky používané platinové cytostatikum v per orální aplikační formě. Hlavním cílovým místem cytostatického působení platinových komplexů je DNA, kde se koordinačně váží k bázím a vytváří různé typy kovalentních můstků (obr. 1). Nejčastěji se vyskytujícím můstkem, který v DNA vytváří cisplatina, je můstek spojující dvě bezprostředně sousedící báze v jednom řetězci DNA, přednostně zbytky guaninu. Tyto můstky ovlivňují strukturní a další fyzikální vlastnosti DNA. Další důležitou vlastností můstků je schopnost zastavovat v místech jejich vzniku replikaci DNA. Na takové výrazné změny samozřejmě Obr. 2 Model kovalentního můstku mezi cisplatinou a DNA (Jamieson, 1999) Obr. 3 Navázání reparačního proteinu na komplex cisplatiny s DNA (Jamieson, 1999) 11

buňka reaguje. Po poškození DNA cisplatinou je okamžitě aktivován proces vedoucí k její opravě. Nejčastěji jde o tzv. excisní nukleotidovou opravu, během které je poškození vystřiženo a nahrazeno novým fragmentem DNA. Rychlá oprava DNA vede ke ztrátě cytostatického efektu. Pro protinádorový efekt je naopak důležité, aby poškození DNA, bránící její replikaci, přetrvalo co nejdelší dobu. Současný stav znalostí o mechanismu protinádorového působení cisplatiny je založen na schopnosti celé řady proteinů specificky rozlišovat a vázat se k DNA modifikované cisplatinou. Jedna z hypotéz (tzv. stínící ) předpokládá, že poškození vyvolaná v DNA cisplatinou jsou stericky odstíněna specificky se vážícími proteiny (obr. 2), což brání v přístupu složek opravného systému k poškozenému místu v DNA a tím jeho opravě. Jiná hypotéza (tzv. titrační ) předpokládá, že proteiny se specifickými funkcemi v buňce se k DNA poškozené cisplatinou váží přednostně a neváží se tedy ke svým přirozeným vazebným místům v DNA, čímž dojde k narušení základních buněčných dějů. Poškození DNA cisplatinou vyvolává programovanou buněčnou smrt (apoptózu). Obecně jsou toxicita a farmakologické vlastnosti platinových sloučenin dány strukturou a charakteristikami jejich reaktivních skupin (v molekule cisplatiny to jsou chloridové skupiny). (Fuertes et al., 2003) Díky výše zmíněným nedostatkům používaných cytostatik se stále hledají nové a kvalitnější platinové komplexy. Některé z nich vykazují v klinických testech velmi slibné výsledky (Kelland, 2007). H 2 N Cl Cl Cl Pt Cl N Pt N Cl Pt N N Cl Cl Cl H 2 NH 3 HO H N N N Pt N Cl Cl tetraplatina dichlorodipyridin platina (II) AMD 473 cis-[pt(bmic)cl 2 ] Obr. 4 Příklady neklasických platinových cytostatik (různé fáze klinických testů) 12

2.3. Léková rezistence Ačkoliv se na přelomu 60. a 70. let stala chemoterapie nádorových onemocnění rovnocennou s chirurgií a radioterapií, zůstává stále klíčovým problémem odhad účinnosti cytostatické léčby v eradikaci nádoru a míry toxicity pro pacienta. Definovat všechny okolnosti ovlivňující účinnost cytostatické léčby a příčiny variabilní odpovědi onkologických pacientů na ni je velmi obtížné. Obecně je můžeme rozdělit do dvou skupin: 1. závislé od pacienta (věk, pohlaví, renální a jaterní funkce, vazebná kapacita plazmatických proteinů, souběžná léčba jinými léky atd), 2. závislé od nádoru (typ, lokalizace, rozsah, agresivita, metastatická aktivita, předchozí léčba, atd). Jednou z nejzávažnějších komplikací protinádorové léčby a nejdůležitější příčinou jejího selhání je schopnost nádorových buněk odolávat účinkům cytotoxických látek. Maligní buněčné populace mohou být vůči chemoterapii rezistentní již při první léčbě. Jedná se o tzv. přirozenou (primární) rezistenci. Získaná (sekundární) rezistence vzniká až v průběhu cytostatické léčby, kdy se původně citlivé buňky stávají rezistentními a účinnost cytostatické léčby se snižuje. Při ztrátě citlivosti k určitému cytostatiku může však být zachována citlivost k jiným léčivům. Pokud při ztrátě citlivosti k jednomu přípravku vzniká současně rezistence na jiné, většinou strukturálně příbuzné cytostatikum, hovoříme o zkřížené rezistenci. Byly však popsány případy zkřížené rezistence mezi protinádorovými léčivy lišícími se jak strukturně, tak mechanismem účinku. Takové případy rezistence pak nazýváme mnohočetná léková rezistence (multidrug resistance, MDR). MDR vysvětluje případy necitlivosti některých nádorů k alternativním léčebným režimům, které využívají nové druhy cytostatik, nepoužité v původní léčbě. Patří sem například P-gp, MRP1 a BCRP. Tyto transportéry společně tvoří základ obranného mechanismu buněk vůči chemickým substancím. P-gp a MRP1 transportují různé typy hydrofobních látek. MRP1 dokáže transportovat také léčiva anionické povahy a konjugáty léčiv. Mechanismy, kterými vzniká rezistence nádorových buněk na protinádorovou léčbu, jsou komplexnější povahy. (Sarkadi et al., 2004) Vznik rezistence je nejčastěji vázán na změny farmakokinetiky: snížená resorpce cytostatika, urychlení biotransformace, rychlejší inaktivace nebo urychlené vylučování. změny cytokinetiky: narůstání nádoru je doprovázeno přechodem větší části nádorových buněk do klidového stavu G 0, v němž je citlivost k chemoterapii omezená. 13

Rovněž s přibývající nádorovou masou vznikají spontánní mutace buněk - zvyšuje se heterogenita buněčné populace, která zakládá vznik klonu s odlišnou citlivostí k léčbě. Léčba tak ničí jen citlivou frakci buněk a dochází k selekci a následnému pomnožení rezistentní populace. strukturální a funkční změny buňky: jde o vůbec nejčastější způsob vzniku rezistence zahrnující sníženou/zvýšenou expresi či aktivitu enzymů, porušení intracelulární distribuce cytostatika (např vazbou na lysozom), ovlivnění transportu cytostatika buněčnou membránou (exprese transportních proteinů), zvýšenou intenzitu oprav DNA. 2.4. Transportní proteiny rodiny ABC Proteiny ABC (ATP binding cassette) představují velkou rodinu transmembránových proteinů, které váží ATP a energii z tohoto zdroje využívají k aktivnímu řízenému transportu chemicky různorodých látek (lipidů, steroidů, hormonů, bilirubinu i xenobiotik) z vnitřního prostředí buňky do extracelulárního prostoru. Lékové ABC transportéry významně ovlivňují biodostupnost léčiv, jejich penetraci do rozličných tkání a v neposlední řadě také hepatobiliární, intestinální a urinární exkreci léčiv, jejich metabolitů i konjugátů. Interakce s ABC transportéry udává do značné míry klinický efekt, vedlejší účinky a toxicitu léčiv. (Schinkel et al., 2003) Aktivita těchto transportních systémů je geneticky modifikována a fenotypová změna genotypu se odráží ve variabilním efluxu látek. Na modifikaci aktivity se podílejí více či méně i jednotlivé substráty transportních proteinů. Efluxní transportéry obsahují šest až dvanáct transmembránových helixů a dva hydrofilní helixy uvnitř buňky, které nesou jedno nebo dvě vazebná místa pro ATP (ATPbinding domains nebo též NBF) a udávají transportnímu proteinu substrátovou specificitu. Mezi nejvýznamnější transportní proteiny patří P-glykoprotein (MDR1, ABCB 1), multidrug resistance associated protein1 (MRP 1, ABCC 1) a breast cancer resistance protein (BCRP, ABCG2,). Tyto transportéry řídí dostupnost léčiv (svých substrátů) v tělesných kompartmentech prostřednictvím vlivu na střevní absorpci, transplacentární přestup a hepatobiliární exkreci. Dále je jim přisuzována také stěžejní role v detoxikaci a ochraně před xenobiotiky. 14

Rodina ABC má v moderní medicíně význam zejména v souvislosti s rezistencí na cytostatika v terapii nádorových onemocnění. Na rezistenci se podílí několik podrodin ABC transportních proteinů ABCB-1, ABCC-1 (daunorubicin, doxorubicin, kolchicin, vinkristin), ABCC-2 (vinblastin), ABCC-3 (methotrexat), ABCC-4 a ABCC-5 (monofosfátové antimetabolity), ABCG-2 (daunorubicin, doxorubicin, mitoxantron, topotekan). U některých transportérů již v současnosti lze inhibovat zvýšenou aktivitu a tím zamezit rozvoji rezistence jsou to transportéry ABCB-1 (verapamil, saquinavir), ABCC-1 (ciklosporin) a ABCG-2 (fumitremorgin C). Nejlépe charakterizovanou podrodinou je ABCB, konkrétně ABCB-1 (P-glykoprotein/MDR-1). 2.4.1. P-glykoprotein Obr. 5 Schéma struktury P-glykoproteinu P-glykoprotein je expresí MDR-1. Je tvořen dvěma velmi podobnými polovinami, z nichž každá obsahuje 6 transmembránových segmentů a intracelulární vazebné místo pro ATP (obr. 5). První extracelulární smyčka P-gp je značně N-glykosylovaná. Z in vitro studií bylo zjištěno, že N-glykosylace pro základní funkce transportérů zásadní není, pravděpodobně zvyšuje stabilitu transportéru v membráně. P-gp dokáže transportovat chemicky velmi rozličné substráty. Jedinou dosud zjištěnou společnou vlastností substrátů P-gp je jejich amfifilní charakter, což souvisí s mechanismem, jímž transportér pracuje. Biologická funkce P-gp se odvíjí od tkáně, ve které se nachází. V membránách buněk hematoencefalické bariéry, v placentě, testes, ovariích, ledvinách, plicích, tenkém střevě, na kanalikulární membráně 15

hepatocytů a ve žlučových cestách zajišťuje exkreci přirozených toxinů z potravy, potenciálních toxických produktů, kancerogenů, steroidů, hormonů či bilirubinu. P-glykoprotein je přítomen i v nádorových buňkách. Nezávisle na jeho lokalizaci platí, že při opakovaném podávání transportovaného léčiva se funkce nosiče mění. Eflux se zvyšuje do té míry, že během léčby může vést až k rezistenci na podávané léčivo. Podobně jako v případě enzymatického systému cytochromu P-450 dochází opakovaným podáváním léčiv k indukci aktivity. Indukce P-glykoproteinu je patrně tkáňově specifická. Bylo prokázáno, že v ledvinách dochází k největší změně aktivity podáváním induktorů (256 %). Změna byla popsána i v jiných orgánech. Minimální indukce byla prokázána v placentě a na úrovni hematoencefalické bariéry. Změna plazmatických koncentrací léčiv však může být i odrazem koncentrace P-glykoproteinu v jednotlivých orgánech (největší je právě v játrech, nejmenší v hematoencefalické bariéře). (Dostalek, 2005) 2.4.2. MRP Označení multidrug resistance associated protein zahrnuje několik podtypů. MRP1 byl poprvé objeven v buněčné linii vysoce rezistentní k doxorubicinu. Je transportérem lipofilních léčiv a dalších látek konjugovaných s glutathionem (GSH) nebo kyselinou glukuronovou. Export neanionických protinádorových léčiv je závislý na buněčném zásobení glutathionem. Důležitou fyziologickou funkcí MRP1 je sekrece mediátoru zánětu leukotrienu C 4 (LTC 4 ). Transportér je lokalizován v basolaterální membráně epiteliálních buněk. Vysoký výskyt je zaznamenán v testikulárních tubulech, orofaryngeální mukose, kostní dřeni, gastrointestinální mukose. MRP2 je transportér jehož funkce byly studovány u pacientů trpících recesivně dědičnou hyperbilirubinemií vzniklou v důsledku absence genu pro MRP2. Fyziologickou funkcí MRP2 transportéru je kromě jiného hepatobiliární exkrece mono- a bis-glukurovaného bilirubinu. Spektrum látek transportovaných MRP1 a MRP2 je podobné, ale nekryje se úplně. Poléková deplece buněčného GSH vzniklá po terapii L-buthioninsulfoximinem (L-BSO) způsobuje v buňkách s vysokou expresí MRP2 pokles transmembránového transportu a lékové rezistence. MRP2 má roli i v ochraně organismu před oxidem arsenitým léčivem užívaným při terapii určitých druhů leukemie. Transpotrér přenáší konjugáty arsenu s GSH přes membránu ven z buněk. MRP2 je lokalizován na apikální membráně buněk v řadě tkání důležitých pro farmakokinetiku léčiv, která jsou substrátem transportéru, např. v hepatocytech, epitelu tenkého střeva, v proximálních tubulech ledvin, placentě, v buňkách 16

endotelu kapilár mozku atd., podílí se tedy na exkreci a může být limitujícím faktorem pro absorpci per orálně podávaných léčiv. Typ MRP3 nebyl ještě tak podrobně zkoumán jako dva výše zmíněné transportéry. Je ukotven v basolaterální membráně buněk tkání jater, střev, pankreatu, ledvin, žlučníku a dalších. Eliminuje řadu toxinů z buněk a způsobuje rezistenci na různé typy protinádorových chemoterapeutik.v nadledvinách hraje roli v eliminaci steroidních konjugátů a podobných látek. Spektrum látek, které jsou jím transportovány se do značné míry kryje se spektry MRP1 a MRP2. Zajímavostí je, že léková rezistence nebyla u tohoto transportního proteinu vlivem terapie L-BSO omezena, což pravděpodobně znamená, že export látek není u MRP3 závislý na přítomnosti GSH v buňkách, narozdíl od MRP1 amrp2. Možné využití transportéru se naskýtá v ovlivnění cirkulace žlučových kyselin, které by mohly být aktivně transportovány prostřednictvím MRP3 do krevního řečiště a být recyklovány v játrech. MRP4 je stejně jako MRP3 a MRP5 zatím nedostatečně charakterizován. Je přítomen v řadě tkání podobně jako výše zmíněné typy MRP. Spektrum transportovaných látek zahrnuje různá antivirotika. Buňky proti nim vykazují i zkříženou rezistenci. MRP5 se pojí s C-koncem Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) v membráně lidských HEK293 buněk. Tyto buňky vykazují rezistenci k řadě protinádorových léčiv. Akumulace různých typů barviv byla v buňkách obsahujících EGFP-MRP5 také znatelně snížena. Nejvyšší výskyt MRP5 byl zaznamenán v mozku, kosterním svalstvu a erytrocytech (Schinkel, 2003). 2.4.3. BCRP Breast cancer resistance protein (BCRP) je členem ABC rodiny efluxních membránových transportérů. Byl pojmenován podle rezistentní buněčné linie, ze které byl jeho gen izolován. Exprese genu pro BCRP ale není, jak by se z názvu mohlo zdát, omezena výhradně na prsní ani na nádorovou tkáň. (Schinkel et al., 2003) Synonyma pro BCRP jsou MXR (mitoxantrone resistance protein) nebo ABCP (placental ABC protein) (Staud et al., 2005). The Human Genome Nomenclature Committee přiřadila transportéru označení ABCG2. BCRP je vysokokapacitní efluxní transportér se širokou substrátovou specifitou rozpoznávající škálu chemických substancí. Nachází se v kmenových buňkách, některých nádorech a v apikální membráně epitelů (kde svým působením významně ovlivňuje dostupnost léčiv). Značný význam má v placentě, játrech a střevech. Zdá se, že důležitou roli 17

hraje v ochraně buněk před hypoxií (Staud et al., 2006).V současné době je považován za jeden ze tří nejvýznamnějších transportérů savčích buněk v souvislosti s lékovou rezistencí. Bylo prokázáno, že zvýšenou expresi BCRP v nádorových buňkách pokročilého stadia neléčeného nádoru plic lze považovat za indikátor špatné klinické odpovědi nádoru na kombinační chemoterapii platinovými cytostatiky (Yoh et al., 2004). Současný výzkum se zaměřuje na inhibitory BCRP, látky, které kromě chemosenzitilizace - potlačení lékové rezistence, také zlepšují farmakokinetický profil a zvyšují intestinální absorpci léčiv, která jsou substráty BCRP. Patří sem například fumitremorgin C a jeho analogy (Rabindran et al., 2000). Avšak vzhledem k rozsáhlé distribuci a rozmanitým funkcím BCRP v těle je vliv inhibitorů tohoto proteinu značně nepředvídatelný. Může se projevit toxické působení inhibitorů dané změnou farmakokinetiky i jiných substrátů BCRP nebo hypersenzitivitou buněk normálně chráněných působením BCRP. Z toho důvodu se výzkum zaměřuje na hledání non-bcrp substrátů, jako bezpečnějšího způsobu terapie. 2.5. Rezistence na platinová cytostatika Dlouhou dobu se předpokládalo, že platinová cytostatika jsou buňkami přijímána pasivně. Pokusy s ouabainem a benzaldehydem, látkami, které vychytávání cytostatik inhibují, prokázaly, že k transportu dochází prostřednictvím membránových transportních proteinů. Hlavním mechanismem vzniku rezistence k cisplatině je snížení efektivní koncentrace léčiva v buňce vlivem zvýšeného efluxu nebo sníženého influxu transmembránovými transportními proteiny (např. MRP, transportéry mědi). Poměrně nedávno byla prokázána silná korelace mezi expresí BCRP v nádorové tkáni a odpovědí na léčbu platinovými cytostatiky (Yoh et al., 2004). Účinnost chemoterapie u pacientů s BCRP-negativními nádory byla 44 % na rozdíl od pacientů s BCRP-pozitivními nádory, kde tato účinnost dosahovala pouze 24 %. Exprese P-gp, MRP-1, MRP-2 a MRP-3 významně neovlivňovala odpověď na chemoterapii a přežití pacientů. V rozvoji rezistence dále hraje roli celá řada mechanismů buněčné adaptace, jako je inaktivace glutathionem a jinými antioxidanty, zvýšená cytoplasmatická detoxifikace, zvýšená reparace DNA, rozvoj tolerance u DNA a mnoho dalších (Stewart, 2007). Převládající mechanismus rezistence je vždy určen charakterem nádorové tkáně (Rabik, 2007). 18

3. CÍL PRÁCE Studium role BCRP transportéru v rezistenci vůči platinovým cytostatikům (karboplatině, cisplatině a oxaliplatině) na buněčných liniích MDCKII a MDCKII-BCRP metodou cytotoxicitní studie. 19

4. METODIKA Materiál a přístroje Přístroje: binokulární mikroskop (Meopta, ČR) destičkový spektrofotometr GENios plus (Tecan-Austria, Rakousko) inkubátor (Sanyo, Japonsko) kahan (IBS Integrabiosciences, Švýcarsko) laminární box (Biocyt, Francie) mrazící a chladící box (Liebherr, Německo) vodní lázeň Pomůcky: 96-jamkové kultivační destičky kultivační lahve latexové rukavice pipetovací špičky (Sarstedt, Eppendorf, Německo) mikropipety (Sarstedt, Eppendorf, Německo) sterilní Pasteurovy pipety (Hirschmann, Německo) sterilní plastové zkumavky s uzávěrem (TPP, Švýcarsko) automatická pipeta multikanálovka Chemikálie: 0,25% Trypsin/EDTA (Sigma, USA) Ethanol 70% DMSO PBS MTT aqua pro injectione fumitremorgin C cisplatina (Lachema, ČR) karboplatina (Lachema, ČR) oxaliplatina (Lachema,ČR) lyzační pufr (10% SDS (Serva, Německo) v 0,01M HCl) 20

Kultivační media DMEM (Sigma, USA) FCS (PAA, Rakousko) Buněčné linie MDCKII (epiteliální buněčná linie odvozená od psích ledvin) MDCKII-BCRP (MDCKII buněčná linie transferovaná pro expresi lidského BCRP transportního proteinu (Pavek, 2005)). Kultivace buněčných linií Buněčné linie MDCKII a MDCKII-BCRP byly kultivovány v mediu (DMEM + FCS 10%) za standardních podmínek ve vlhkostním inkubátoru s 5% CO 2. Trypsinizovány (0,25% Trypsin/EDTA) byly každý třetí den a pasážovány v poměru 1:10. Popis pasážování: 1) prohlédnutí buněk pod mikroskopem 2) odsátí media z buněčné kultury 3) omytí buněk v PBS 4) trypsinizace 5) inkubace asi 3 minuty 6) protřepání 7) přidání media předehřátého na 37 C 8) resuspendace buněk 9) odebraní určitého objemu media s buňkami 10) vstříknutí do nové kultivační lahve s čistým mediem 11) umístění do inkubátoru Metodika cytotoxicitní studie a MTT test: Principem metody je expozice dvou linií buněk MDCKII toxickému působení platinových cytostatik (cisplatiny, karboplatiny a oxaliplatiny ). v různých koncentracích. První linie MDCKII buněk je transfekována genem pro BCRP a druhá (parentní) linie gen pro BCRP neobsahuje. Měření cytotoxicity vybraných platinových cytostatik se provádí pomocí MTT testu, který je založený na buněčném vychytávání žlutého barviva MTT (3-(4,5- dimethyllthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid) a jeho postupné redukci v mitochondriích přeživších buněk na tmavě modrý krystalický formazan (Mosmann, 1983). Intenzita zbarvení je dána mírou přeživších buněk a je vyhodnocena spektrofotometricky. 21

Výsledek je interpretován jako LD 50 tj. koncentrace cytostatika letální pro 50% buněk a znázorněn grafickou závislostí letality (%) na koncentraci cytostatika (c). Pro potvrzení vlivu BCRP na rezistenci BCRP exprimujících buněk se cytotoxický efekt platinových cytostatik testuje za přítomnosti nebo nepřítomnosti fumitremorginu C, což je účinný inhibitor BCRP transportéru (Rabindran et al., 2000). Popis: 1) odsátí media z buněčné kultury 2) omytí buněk v PBS 3) trypsinizace 4) přidání čistého media 5) nasázení buněk na 96-jamkové destičky - zjištění počtu buněk ve 100 μl pomocí Bürkerovy komůrky 6) inkubace 24 hodin 7) příprava koncentrační řady cytostatik 8) odsátí media ze všech jamek destičky 9) přidaní 80 μl čistého media do každé jamky 10) přidání 20 μl určité koncentrace cytostatika vždy na 3 jamky v řadě 11) inkubace 72 hodin v inkubátoru s 5% CO 2 při teplotě 37 C 12) přidání 10 μl MTT 13) inkubace 4 hodiny 14) lýza buněk pomocí lyzačního pufru 15) spektrofotometrické vyhodnocení absorbančních změn MTT barviva po jeho enzymatické redukci metabolicky aktivními (tzn. přeživšími) buňkami na přístroji GENios Plus TM (Tecan, Switzerland) v programu Xfuor při vlnové délce 620 nm, (provádí se 3 měření a výsledkem je jejich průměr) Analýza dat: Viabilita testovaných buněk se určuje ve vztahu ke kontrolní skupině neléčených buněk, které jsou považovány za buňky s maximální, resp. 100 % viabilitou. Kontrolní skupina s minimální, resp. 0 % viabilitou, je skupina buněk usmrcených pomocí DMSO. Výsledky jsou udávány jako LD 50, tj. koncentrace cytostatika letální pro 50 % buněk a znázorněny grafickou závislostí letality (%) na koncentraci cytostatika (c). Hodnoty LD 50 se 22

spočítaly interpolací z experimentálních dat za použití programu GraphPad Prism, verze 4 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Obr. 6 Kultivační destička (ilustrační foto) Ve sloupcích jsou různá cytostatika (3 sloupce na 1 cytostatikum), v řádcích jsou různé koncentrace použitých cytostatik. Pro porovnání obsahují některé jamky buňky se 100 % viabilitou (pouze PBS) a buňky s 0 % viabilitou (DMSO). 23

viabilita (% viabilita (%) 5. VÝSLEDKY Platinová cytostatika (cisplatina, karboplatina a oxaliplatina) byla použita k MTT testu s buněčnou linií MDCKII (parentní linie) a s linií MDCKII-BCRP, což je linie MDCKII transferovaná genem pro expresi lidského BCRP transportního proteinu. A. 180 Cisplatina 160 140 120 100 80 MDCKII MDCKII-BCRP 60 40 20 0 0 50 100 150 200 koncentrace (μm) B. 180 160 Karboplatina 140 120 100 80 60 40 MDCKII MDCKII-BCRP 20 0 0 100 200 300 400 koncentrace (μm) 24

viabilita (%) viabilita (%) C. Oxaliplatina 120 100 80 60 40 20 MDCKII MDCKII-BCRP 0 0 50 100 150 200 250 300 koncentrace (μm) Obr. 7 Substráty cisplatina (A), karboplatina (B) a oxaliplatina (C) byly použity k MTT testu s buněčnou linií MDCKII a transfekovanou linií MDCKII-BCRP. Tato pilotní studie měla prokázat vliv exprese BCRP na cytotoxicitní efekt platinových cytostatik. Dle očekávání, po aplikaci cisplatiny (obr. 5-A) a karboplatiny (obr. 5- B) jevily porovnávané linie výrazné rozdíly ve viabilitě (%), což byl důležitý předpoklad pro další testování s inhibitorem BCRP transportéru. Překvapením však byly výsledky z testování oxaliplatiny (obr. 7-C), protože na její cytotoxický účinek se vliv exprese BCRP neprokázal. Z tohoto důvodu jsem s oxaliplatinou v dalším testování nepokračovala. A. MDCKII / Cisplatina+FumC 120 100 80 60 40 20 MDCKII MDCKII+FumC 0 0 50 100 150 200 koncentrace (μm) 25

viabilita (%) viabilita (%) B. 120 MDCKII / Karboplatina+FumC 100 80 60 MDCKII MDCKII+FumC 40 20 0 0 100 200 300 400 koncentrace (μm) Obr.8 Porovnání cytotoxicity cisplatiny (A) a karboplatiny (B) na linii MDCKII s použitím fumitremorginu C V následujícím testování byl použit inhibitor BCRP fumitremorgin C. Nejprve byl jeho vliv zkoumán na parentní linii MDCKII. Podle předpokladu inhibitor neměl vliv na cytotoxicitu cisplatiny (obr. 6-A) ani karboplatiny (obr. 6-B) u buněk, které nemají exprimovaný gen pro BCRP (parentní linie MDCKII). Toto testování bylo provedeno z důvodu vyloučení případných interakcí a vedlejších vlivů fumitremorginu C na životaschopnost buněk. A. 180 MDCKII-BCRP / Cisplatina+FumC 160 140 120 100 80 MDCKII-BCRP MDCKII-BCRP+FumC 60 40 20 0 0 50 100 150 200 koncentrace (μm) 26

viabilita (%) B. 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 MDCK-BCRP / Karboplatina+FumC 0 100 200 300 400 koncentrace (μm) MDCK-BCRP MDCKII-BCRP+FumC Obr. 9 Porovnání cytotoxicity cisplatiny (A) a karboplatiny (B) na linii MDCKII-BCRP s použitím fumitremorginu C V posledním kroku byl testován vliv cytotoxicitního působení cisplatiny (obr. 7-A) a karboplatiny (obr. 7-B) na linii MDCKII transfekovanou genem pro BCRP za použití fumitremorginu C. Očekávali jsme, že se fumitremorgin C jako inhibitor efluxního transportéru BCRP bude podílet na významném snížení životaschopnosti testovaných buněk, jelikož bude potlačen eflux cytostatik, resp. dojde k jejich kumulaci v buňkách. Ze získaných údajů však vyplývá, že inhibice BCRP nejevila výrazný vliv na životaschopnost buněk. Cytotoxicitní efekt cisplatiny a karboplatiny zůstává i po inhibici BCRP téměř stejný. LD 50 (µm) MDCKII MDCKII-BCRP cytostatikum ------- FTC (5µM) ------- FTC (5µM) CIP 81,66 ± 1,33 79,75 ± 1,72 128,30 ± 6,45 + 130,40 ± 4,89 CAP 152,10 ± 2,55 137,00 ± 2,30 195,60 ± 1,89 + 204,90 ± 2,15 OXP 1,95 ± 0,07 ----------- 1,89 ± 0,09 ----------- Tab. 1 Hodnoty LD 50 (µm) pro cisplatinu (CIP), karboplatinu (CAP) a oxaliplatinu (OXP) jsou vyhodnoceny v přítomnosti nebo absenci fumitremorginu C (FTC) v buněčné linii MDCKII a MDCKII- BCRP + p < 0.001 v porovnání s linií MDCKII 27

Přesné hodnoty a směrodatné odchylky provedených měření jsou shrnuty v tabulce (tab. 1). Hodnoty LD 50 se spočítaly interpolací z experimentálních dat za použití programu GraphPad Prism. Výsledky byly porovnávány metodou Studentova t-testu za použití šablon v programu Excel a byly považovány za statisticky významné v případě p<0,05. Tento statisticky významný rozdíl byl zaznamenán pouze při porovnání hodnot získaných z měření cytotoxicity cisplatiny a karboplatiny na linii MDCKII a MDCKII-BCRP (tab. 1, obr 7-A, 7- B). Rozdíly v ostatních měřeních byly statisticky nevýznamné. 28

6. DISKUZE Efluxní ABC transportéry hrají důležitou roli v regulaci intracelulární koncentrace léčiv a jsou tak zodpovědné za citlivost vůči chemoterapeutikům. Například nadměrná exprese BCRP genu vede k mnohočetné lékové rezistenci vůči širokému spektru cytotoxických látek (Kuo, 2007). Korelace mezi zvýšenou expresí BCRP v nádorových buňkách a slabší odpovědí na léčbu platinovými cytostatiky byla popsána u pacientů s nemalobuněčným plicním karcinomem a vedla k domněnce, že tento transportér je odpovědný za chemorezistenci zmíněného karcinomu (Yoh et al., 2004). Na druhou stranu exprese BCRP genu neovlivňovala účinnost cisplatiny v léčbě rakoviny vaječníků (Nakayama, 2002). Cílem této práce bylo ověření hypotézy, že zvýšené exprese genu pro BCRP významně snižuje cytotoxicitu vybraných platinových cytostatik (cisplatina, karboplatina a oxaliplatina). Studie byla provedena na buněčné kultuře MDCKII (parentní linie) a na kultuře MDCKII-BCRP (linie transfekovaná genem pro BCRP). Z prvních výsledků je patrné, že cytotoxicita použitých platinových cytostatik (cisplatiny a karboplatiny) byla významně nižší u MDCKII-BCRP linie v porovnání s parentní MDCKII linií. Tyto výsledky tedy podpořily hypotézu, že efluxní činnost BCRP způsobuje nižší koncentrace v nádorových buňkách a tedy i nízkou cytotoxicitu testovaných látek V případě oxaliplatiny se však překvapivě žádný signifikantní rozdíl neprojevil. Oxaliplatina tedy nebyla v dalších testech použita, jelikož se nepotvrdil důležitý předpoklad, že linie transfekovaná genem pro BCRP bude signifikantně rezistentnější vůči cytotoxickému působení platinových cytostatik než linie parentní. V dalších testech jsme posuzovali vliv fumitremorginu C (účinný inhibitor BCRP transportéru) na cytotoxicitu cisplatiny a karboplatiny u parentní linie MDCKII. Buňky této linie nemají BCRP transportér, a proto jsme předpokládali, že fumitremorgin C nebude ovlivňovat životaschopnost buněk. Měření jsme provedli i z důvodu vyloučení možnosti interference fumitremorginu C s životními a metabolickými pochody buněk. Dle předpokladu použitý inhibitor životaschopnost buněk parentní linie neovlivňoval. V posledním kroku jsme hodnotili vliv fumitremorginu C na linii MDCKII-BCRP. Předpokládali jsme, že po inhibici efluxního transportéru BCRP se v buňkách budou cytostatika více koncentrovat a v důsledku vzroste i cytotoxicita. Hypotéza se však nepotvrdila, jelikož se hodnoty LD 50 cisplatiny a karboplatiny signifikantně nezměnily. Ze 29

získaných souvislostí tedy vyplývá, že na zvýšení rezistence MDCKII-BCRP linie vůči platinovým léčivům má pravděpodobně vliv jiný faktor než efluxní transportér BCRP. Zmíněným ovlivňujícím faktorem by mohl být EGFP je široce používán v buněčné biologii jako indikátor monitorující genovou expresi v živých buňkách (Alam, 2003). Předpokládá se, že tento indikátor neovlivňuje buněčný systém a neovlivňuje experimentální metody. Ovšem v našem případě, kdy jsme linii MDCKII-BCRP připravovali ko-transfekcí BCRP a EGFP (Pavek, 2005), se domníváme, že exprese EGFP v těchto buňkách může podmiňovat nižší toxicitu platinových cytostatik a neefektivitu fumitremorginu C. Pro potvrzení této hypotézy bude provedena serie testů. 30

7. ZÁVĚR Tato práce je zaměřena na studium interakce platinových cytostatik (cisplatina, karboplatina a oxaliplatina) s buněčným transportérem BCRP, který je považován za velmi důležitý z hlediska vzniku rezistence nádorových buněk vůči cytostatické léčbě. Testování bylo provedeno na buněčné linii MDCKII (parentní linie bez BCRP) a na linii MDCKII- BCRP, která byla transfekovaná genem pro BCRP. Při prvním testování jsme zjistili, že při použití oxaliplatiny není životaschopnost buněk přítomností BCRP výrazněji ovlivněna. Transportér projevil důležitou roli v testech s cisplatinou a oxaliplatinou, protože buňky transfekované genem pro BCRP vykazovaly signifikantně vyšší životaschopnost než buňky bez tohoto transportéru. Inhibice transportéru fumitremorginem C však neměla na životaschopnost buněk MDCKII-BCRP vliv. Proto se domníváme, že zvýšená rezistence transfekovaných buněk je způsobena jiným mechanismem. Předpokládáme, že rezistenci může ovlivňovat EGFP, což je protein indikující trasfekci BCRP. Pro podpoření této hypotézy bude provedena serie testů. 31

8. LITERATURA Alam J., Cook J.L. (2003) Reporter genes for monitoring gene expression in mammalian cells. Gene transfer and epression in mammalian cells, 38, 291-308. Dostalek M. (2005) Transportní proteiny rodiny ABC (ATP binding cassette). Farmakoterapie. 1 (6): 583-586. Fuertes M.A., Castilla J., Alonso C. and Pérez J.M. (2003) Cisplatin biochemical mechanism of action: From cytotoxicity to induction of cell death through interconnections between apoptotic and necrotic pathways. Curr Med Chem 10 (3): 257-266. Fuwa N., Kodaira T., Tachibana H., Nakamura T. and Daimon T. (2007) Dose escalation study of nedaplatin with 5-fluorouracil in combination with alternating radiotherapy in patients with head and neck cancer. Jpn J Clin Oncol 37 (3): 161-167. Jamieson E.R. and Lippard S.J. (1999) Structure, recognition, and processing of cisplatin- DNA adducts. Chem Rev 99: 2467-2498. Kelland L. (2007) Broadening the clinical use of platinum drug-based chemotherapy with new analogues: satraplatin and picoplatin. Expert Opin Investig Drugs 16 (7): 1009-1021. Kuo M.T. (2007) Roles of multidrug resistance genes in breast cancer chemoresistance. Breast Cancer Chemosensitivity, 608, 23-30. Lincová D. and Farghali H. (2002) Základní principy antitumorózní (cytostatické) léčby, Základní a aplikovaná farmakologie, 497-511. Melichar B. (2005) Oxaliplatina. Farmakoterapie. 1 (6): 561-569. Mosmann T. (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 65, 55-63. 32

Nakayama K., Kanzaki A., Ogawa K., Miyazaki K., Neamati N. and Takebayashi Y. (2002) Copper-transporting P-type adenosine triphosphatase (ATP7B) as a cisplatin based chemoresistance marker in ovarian carcinoma: Comparative analysis with expression of MDR1, MRP1, MRP2, LRP and BCRP. Int J Cancer. 101 (5): 488-495. Pavek P., Merino G., Wagenaar E., Bolscher E., Novotna M., Jonker J.W. and Schinkel A.H., (2005). Human breast cancer resistance protein: interactions with steroid drugs, hormones, the dietary carcinogen 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo(4,5-b)pyridine, and transport of cimetidine. J Pharmacol Exp Ther. 312, 144-152. Rabik C.A. and Dolan M.E. (2007) Molecular mechanisms of resistance and toxicity associated with platinating agents. Cancer Treat Rev. 33 (1): 9-23. Rabindran S.K., Ross D.D., Doyle A., Yang W. and Greenberger L.M. (2000) Fumitremorgin C reverses multidrug resistance in cells transfected with the breast cancer resistance protein. Cancer Res 60 (1): 47-50. Sarkadi B., Ozvegy-Laczka C., Nemet K. and Varadi A (2004) ABCG2 a transporter for all seasons. FEBS Lett 567 (1): 116-120. Schinkel A.H. and Jonker J.W. (2003) Mammalian drug efflux transporters of the ATP binding cassette (ABC) family: an overview. Adv Drug Deliv Rev 55 (1): 3-29. Staud F. and Pavek P. (2005) Breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2). Int J Biochem Cell Biol 37 (4): 720-725. Stewart D.J. (2007) Mechanisms of resistance to cisplatin and carboplatin. Crit Rev Oncol Hematol 63, 12-31. Staud F., Vackova Z., Pospechova K., Pavek P., Ceckova M., Libra A., Cygalova L., Nachtigal P. and Fendrich Z. (2006) Expression and transport activity of breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2) in dually perfused rat placenta and HRP-1 cell line. J Pharmacol Exp Ther 319 (1): 53-62. 33

Yoh K., Ishii G., Yokose T., Minegishi Y., Tsuta K., Goto K., Nishiwaki Y., Kodama T., Suga M. and Ochiai A. (2004) Breast cancer resistance protein impacts clinical outcomes in platinum-based chemotherapy for advanced non-small cell lung cancer. Clin. Cancer Res. 10, 1691-1697. 34