Vysokoúčinná kapalinová chromatografie Petr Kozlík Katedra analytické chemie e-mail: kozlik@natur.cuni.cz http://web.natur.cuni.cz/~kozlik/ 1
Vysokoúčinná kapalinová chromatografie Teorie HPLC Praktické aspekty, vývoj metody Validace chromatografické metody Aplikace HPLC 2
Sylabus přednášky: Základní chromatografické charakteristiky: distribuční konstanta retenční čas retenční objem průtok mobilní fáze kapacitní faktor separační faktor rozlišení symetrie píku Teorie chromatografického patra: účinnost separačního procesu Van Deemterova rovnice ovlivnění rozlišení 3
Distribuční konstanta HPLC je založena na separaci analytů na základě jejich distribuce mezi stacionární a mobilní fázi. Během separace dochází k mnoha typům interakcí. Uplatňují se interakce analytů s mobilní fází, interakce mobilní fáze se stacionární fází a sorpce analytů na stacionární fázi. Distribuční konstanta K D je poměr rovnovážné koncentrace analytu ve stacionární fázi a mobilní fázi KD A s Am As Am je rovnovážná koncentrace analytu ve stacionární fázi je rovnovážná koncentrace analytu v mobilní fázi 4
Retenční charakteristiky t R i tm t, ' R, i tm t R, i V R i VM V, ' R, i Retenční čas t R je doba, která uplyne od nástřiku vzorku do dosažení maxima eluční křivky Mrtvý čas t M je retenční čas analytu, který není v koloně zadržován. Redukovaný retenční čas t R je čas, který stráví analyt ve stacionární fázi. Retenční objem V R je objem mobilní fáze, který musí projít kolonou, aby se příslušný analyt dostal od počatku ke konci separační kolony. Mrtvý objem V M je objem mobilní fáze, který musí projít kolonou, aby se nezadržovaný analyt dostal od počátku ke konci kolony. 5
Retenční charakteristiky Lineární rychlost mobilní fáze u [cm/min] u L tm Objemová průtoková rychlost mobilní fáze F m [ml/min] Kapacitní faktor k t M Fm ni V t tr i t n M, i s k KD, I * Výhoda nezávislý na délce kolony a průtoku mobilní fáze m M M V V s m k = 0 analyt nestráví ve SF žádný čas a proto není zadržován k = 1 analyt stráví stejný čas v MF a v SF a proto eluuje ve 2x mrtvého času kolony k = 4 analyt stráví 4x času ve SF oproti MF a proto eluuje v 5x mrtvého času kolony 6
Retenční charakteristiky Separační faktor - selektivita k 2 k 1 K K D, 2 D,1 α = 1 α = 1,2 α = 1,6 7
Retenční charakteristiky Rozlišení píků R 1,2 ( tr,2 1 *( w 2 t B,2 R,1 ) w B,1 ) tr,1 tr,2 Dva píky jsou rozděleny na základní linii, pokud R>1.5 8
Symetrie píku Faktor asymetrie píku Tailing faktor píku Nesymetrické ( fronting nebo tailing ) píkí mohou způsobit nepřesnou kvantifikaci zhoršení rozlišení zakrytí minoritních píků nereprodukovatelnost retenčních časů Snažíme se o co možná nejsymetričtější píky! 9
Teorie chromatografického patra Účinnost chromatografického procesu nám říká, jak hodně (málo) je zóna eluující látky rozšiřována při průchodu HPLC systémem a kolonou. Gaussova křivka tr střední hodnota δ směrodatná odchylka 10
Teorie chromatografického patra Počet teoretických pater N t w 2 R, i R, i 16* 5.545* b Výškový ekvivalent teoretického patra H N L Typický počet teoretických pater za optimálních separačních podmínek t w 0.5 2 11
Van Deemterova teorie H H p H d H m Hp Hd Hm vířivá (turbulentní) difúze v mobilní fázi molekulární (axiální) difúze v mobilní fázi odpor proti převodu hmoty v mobilní fázi a stacionární fázi 12
Hp vířivá (turbulentní) difúze v mobilní fázi Díky nehomogenitě stacionární fáze proudí mobilní fáze různými kanálky stacionární fáze a tím urazí různou dráhu (analyty se proto navzájem opožďují nebo předbíhají) H p 2* * d p A geometrický faktor velikost částic Jak minimalizovat vířivou difuzi: používat dobře naplněné kolony používat malé částice používat kolony s malou distribucí velikosti částic 13
Hd molekulární (axiální) difúze v mobilní fázi Molekuly analytu difundují z místa s vyšší koncentrací do místa s nižší koncentrací. difúzní koeficient H d 2* * D u m B u lineární rychlost mobilní fáze korekční faktor charakterizující tvar kanálků v náplni kolony Jak minimalizovat vířivou difuzi: používat vyšší průtoky mobilní fáze používat krátké spojovací kapiláry s vhodným vnitřním průměrem Příspěvek molekulární difúze v LC je při běžných průtocích mobilní fáze zanedbatelný 14
Hm odpor proti převodu hmoty v mobilní fázi a stacionární fázi * d H Dm průměr částic náplně kolony 2 p * d Dp 2 p * u C * u intračásticový difúzní koeficient difúzní koeficient analytu v mobilní fázi koeficient závislý na distribuci velikosti částic a distribuci pórů Jak minimalizovat odpor proti převodu hmoty: používat nižší průtoky mobilní fáze používat menší rozměry částic používat vyšší teplotu na koloně 15
Van Deemterova rovnice H (µm) minimální H lineární průtoková rychlost (cm) optimální průtoková rychlost 16
Mimokolonové příspěvky k rozšiřování zón zavisí na objemu a geometrii detekční cely 2 celkem 2 kolona 2 injektor 2 spoje 2 det ektor objem vzorku má být co nejmenší spojovací kapiláry mají být co nejkratší s malým vnitřním průměrem 17
18
19
Jak ovlivnit rozlišení? Skutečná rovnice rozlišení R 1,2 ( tr,2 1 *( w 2 t B,2 R,1 ) w B,1 ) R 1,2 N 4 1 k * * 1 k účinnost selektivita retence kinetický aspekt termodynamický aspekt kapacitní aspekt rozlišení je přímo úměrné druhé odmocnině z počtu teoretických pater kolony rozlišení je přímo úměrné selektivitě a blíží se k nule pokud se selektivita blíží k jedné rozlišení je přímo úměrné retenci a blíží se k nule pokud se retence blíží k nule 20
Jak ovlivnit rozlišení? R 1,2 N 4 1 k * * 1 k největší efekt změny k pro k < 2 pro k > 10 nemá smysl dále zvyšovat k 21
Jak ovlivnit rozlišení? R 1,2 N 4 1 k * * 1 k selektivita je nejúčinější nástroj jak ovlivnit rozlišení Parametr Použití organická složka mobilní fáze ph mobilní fáze síla mobilní fáze + aditiva mobilní fáze stacionární fáze teplota změna organické složky (acetonitril X metanol X tetrahydrofuran) změna stupně ionizace analytů (změna hydrofobicity) změna poměru organické a vodné složky mobilní fáze největší vliv na selektivitu nejmenší vliv na selektivitu, často používán v chirálních separacích 22
Jak ovlivnit rozlišení? R 1,2 N 4 1 k * * 1 k 23
Jak ovlivnit rozlišení? R 1,2 N 4 1 k * * 1 k Faktory ovlivňující účinnost průtok mobilní fáze délka kolony velikost částic 24
Jak ovlivnit rozlišení? R 1,2 N 4 1 k * * 1 k 25
Gradientová eluce V průběhu gradientové eluce dochází ke změně složení mobilní fáze. k e 1 2,3* b g strmost gradientu b g mrtvý čas kolony t S 0* tg doba trvání gradientu eluční síla organického modifikátoru změna složení mobilní fáze během gradientu Píková kapacita P 1 1 n t n * 1 g w b 26
Gradientová eluce gradientový průběh je charakterizován gradientovými křivkami 27
Gradientová eluce píky 8 a 9 jsou velmi široké a eluují ve vysokých retenčních časech vyřešen problém s píky 8 a 9. Došlo ke zhoršení rozlišení píku 1 a 2, které koeluují Problémy isokratické eluce řeší gradientová eluce, kdy všechny píky jsou rozděleny na základní linii s krátkou dobou celkové analýzy 28
Gradientová eluce Příklad celkové doby gradientu na selektivity některých píku 29
Použité zdroje a zároveň doporučená literatura Monografie: Snyder R. L., Kirkland J. J.: Practical HPLC method development Snyder R. L., Kirkland J. J.: Introduction to modern chromatography Nováková L., Douša M.: Moderní HPLC separace v teorii a praxi (první a druhý díl) Snyder R. L., Dolan J. W.: High performance gradient elution Meyer V. R.: Practical high performance liquid chromatography Dong M. W.: Modern HPLC for practicing scientists Kromidas S.: More practical problem solving in HPLC Internetové zdroje: www.hpst.cz www.waters.com www.chromacademy.com www.hplc.cz http://web.natur.cuni.cz/~pcoufal/ www.shimadzu.com Časopisy: Journal of Chromatography A, B Journal of Separation Science Analytical Chemistry Chromatographia Journal of Liquid Chromatography LCGC 30