Název: Školitel: Specifická izolace microrna pomocí magnetizovatelných mikročástic Veronika Vlahová Datum: 21. 3. 214 Reg.č.projektu: CZ.1.7/2.3./2.148 Název projektu: Mezinárodní spolupráce v oblasti "in vivo" zobrazovacích technik
MicroRNA Délka přibližně 22 nt Vznikají přepisem DNA v jádře Regulátory genové exprese na post-transkripční úrovni Uplatňují se v mnoha biologických procesech Mají význam v procesech nádorové transformace Deregulace v mnoha typech karcinomů Potenciální biomarker
Vznik a funkce mirna
mir-124 Vyskytují se tři typy genů pro mir-124 Délka 21 nt Vysoká konzervovanost v rámci druhů Nejvyšší exprese v mozkové tkáni Ovlivňuje diferenciaci nervových buněk Deregulace exprese v karcinomech prostaty, kolorektálním karcinomu, glioblastomu a meduloblastomu
Cíle práce Cílem této práce bylo vyvinout specifickou metodu pro izolaci mirna bez použití značení Optimalizace izolace pomocí magnetizovatelných částic Detekce mir-124 pomocí elektrochemie Aplikace optimalizované metody na reálné vzorky
Princip metody SWV Sekvence mir-124 5-UAA GGC ACG CGG UGA AUG-3 CCA Sekvence anti-mir-124 5-Biotin-TGG CAT TCA CCG CGT GCC TTA-3 MPs modifikovaná streptavidinem Biotinylovaná anti-mir-124 mir-124 Externí magnetické pole RNA Voltamogram
Velikost píku (na) Velikost píku (na) Velikost píku (na) Velikost píku (na) Kalibrace elektrochemického stanovení mir-124 a antimir-124 4 35 3 25 2 15 1 A 3 2 1 y = 26,578x - 42,84 R² =,9989 5 5 1 Koncentrace mir-124 (nm) 1 2 3 4 Koncentrace mir-124 (nm) 2 18 16 14 12 1 8 6 4 2 B 14 12 1 8 6 4 2 y = 11,17x + 37,418 R² =,9973 5 1 15 Koncentrace anti-mir-124 (nm) 1 2 3 4 5 Koncentrace anti-mir-124 (nm) A1 B1 elektrolyt 1.5 nm 3. nm 6. nm 12.5 nm -1.25 25. nm 5. nm 1. nm 2. nm 4. nm -1.3-1.35-1.4 Potenciál (V) 1 µa LOD = 1. 2 nm LOQ = 4. 2 nm -1.45-1.5 elektrolyt.4 nm.8 nm 1.5 nm 3. nm 6. nm 12.5 nm 25. nm 5. nm -1.35-1.4 Potenciál (V) (A) Kalibrační křivka mir-124 s voltamogramem (A1): velikost píku je závislá na koncentraci mir-124 (B) Kalibrační křivka anti-mir-124 s voltamogramem (B1): velikost píku je závislá na koncentraci anti-mir-124-1.25-1.3.5 µa -1.45 LOD =. 1 nm LOQ =. 4 nm -1.5 SWV parametry: doba akumulace 12 s, počáteční potenciál V, koncový potenciál -1.8 V, potenciálový krok 5mV, frekvence 28H, amplituda 25.5 mv
Velikost píku (na) Nenavázaná anti-mir-124 (%) Velikost píku (na) Optimalizace metody 12 1 8 A 8 7 6 5 B Eluovaná eluted mir-124 mir-124 blank Blank 6 4 4 2 12 1 8 6 4 2 3 4 5 6 7 Koncentrace anti-mir-124 (μm) aplikovaná na 5 μl MPs C (1) DNA ODN: ATGGCAGACA (2) DNA ODN: GCGATTGATGGTGATACGGTT (3) DNA ODN: GGGGACAAGTTTGTACAAAA AAGCAGGCTGTGGCTAATACGAAAAAAACAACATT (4) mir-15: UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG (5) mir-124: UAAGGCACGCGGUGAAUGCCA. 3 2 1 5 6 7 8 9 Teplota eluce ( C) (A) Optimalizace navázání anti-mir-124 na MPs: byla měřeno zbytkové množství nenavázané anti-mir-124 v roztoku, který byl odebrán od separovaných MPs (B) Optimalizace eluční teploty: byl posuzován rozdíl mezi signálem izolované mir-124 a signálem roztoku bez mir-124 (C) Ověření specifity vazby: byly vyzkoušeny různé typy sekvencí pro potvrzení specifické vazby mir-124 na anti-mir-124 1 2 3 4 5 Typ nukleové kyseliny
Velikost píku (na) Kalibrace optimalizovaného izolačního postupu 7 6 A B 5 4 y = 1,112x + 45,79 R² =,9811 3 2 1 5 1 15 2 25 3 35 4 Koncentrace aplikované mir-124 (nm) elektrolyt 6. nm 12.5 nm 25. nm 5. nm -1.3 1. nm 2. nm 4. nm -1.35-1.4 Potenciál (V) -1.45.1 µa -1.5 (A) Kalibrace optimalizovaného izolačního postupu s voltamogramem (B): velikost píku je závislá na koncentraci aplikované mir-124 Průměrná výtěžnost izolačního postupu je 27, 3 % LOD = 4,6 nm LOQ = 13,54 nm
Koncentrace mir-124 (nm) Relativní exprese Aplikace metody na reálné vzorky SWV qrt-pcr 6 A 1,2 B 5 4 Elektrolyt Bez plazmidu pentr-mir124 psvmir-124.2 µa 1,15 1,1 3-1.25-1.3-1.35-1.4-1.45 1,5 Potential (V) 2 1, 1,95 Bez plazmidu pentr-mir124 psv-mir124,9 Bez plazmidu pentr-mir124 psvmir-124 (A) Koncentrace izolované mir-124 z reálných vzorků: množství mir-124 izolovaná optimalizovanou metodou z třech typů HEK buněk: neobsahující plazmid, s plazmidem pentr-mir-124, s plazmidem psvmir-124. Vnořený graf zobrazuje voltamogram izolovaných mir-124 (B) Relativní exprese mir-124 v HEK buňkách: pomocí qrt-pcr byla provedena detekce relativní exprese mir-124 ve třech typech HEK buněk: neobsahující plazmid, s plazmidem pentr-mir-124, s plazmidem psvmir-124
Závěr Byla vyvinuta nová metoda izolace mirna pomocí magnetizovatelných částic, která je např. v porovnání qrt-pcr méně časově náročná, vyžaduje menší množství vzorku a je metodicky jednodušší Byla provedena její optimalizace Izolovaná mir-124 byla detekována pomocí elektrochemie Pomocí této metody byla izolována mir-124 z reálného vzorku modifikovaných HEK buněk
Poděkování Ing. Kristýně Šmerkové Mgr. Markétě Vaculovičové, Ph.D. Dr. Vladimíru Pekaříkovi, Ph.D. RNDr. Michalovi Masaříkovi, Ph.D. Prof. Ing. Renému Kizekovi, Ph.D. A celému kolektivu Laboratoře Metalomiky a Nanotechnologií
Děkuji za pozornost Reg.č.projektu: CZ.1.7/2.3./2.148 Název projektu: Mezinárodní spolupráce v oblasti "in vivo" zobrazovacích technik