MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE PRŮMYSLOVÉ VYUŽITÍ MLÉČNÝCH BAKTERIÍ Bakalářská práce Věra Kotrsová Vedoucí práce: doc. RNDr. Miroslav Němec, CSc. Brno 2016

Bibliografický záznam Autor: Název práce: Studijní program: Studijní obor: Vedoucí práce: Věra Kotrsová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie Průmyslové využití mléčných bakterií Experimentální biologie Speciální biologie, zaměření Mikrobiologie a molekulární biotechnologie doc. RNDr. Miroslav Němec, CSc. Akademický rok: 2015/2016 Počet stran: 59 Klíčová slova: bakterie mléčného kvašení; fermentace; kyselina mléčná

Bibliographic Entry Author Title of Thesis: Degree programme: Field of Study: Supervisor: Věra Kotrsová Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental biology Lactic acid bacteria in industry Experimental biology Special biology, specialization Microbiology and molecular biotechnology doc. RNDr. Miroslav Němec, CSc. Academic Year: 2015/2016 Number of Pages: 59 Keywords: Lactic acid bacteria; fermentation; lactic acid

Abstrakt Bakterie mléčného kvašení se vyskytují téměř všude. Již v dávné historii byly využívány pro výrobu fermentovaných potravin. Lidé věděli, že fermentované potraviny mají delší trvanlivost a jsou méně náchylné ke kažení. V dnešní době jsou fermentační, fyziologické a biochemické procesy způsobené bakteriemi hluboce prostudovány. Mléčné bakterie již nejsou předmětem pouze potravinářství. Ve velké míře jsou uplatňovány i v chemickém, farmaceutickém a zemědělském průmyslu nebo v lékařství. V mnoha odvětvích ale nejsou jen přínosem. Bakterie mléčného kvašení mohou způsobovat nežádoucí účinky a kontaminace produktu. Mezi nejvýznamnější rody mléčných bakterií patří Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Enterococcus, Streptococcus, Pediococcus a Weissella. Abstract Lactic acid bacteria are present almost everywhere. In the distant past they were used for production of the fermented food. People knew that fermented foods have a longer shelf life and are less prone to spoilage. Nowadays fermentation, physiological and biochemical processes caused by bacteria are deeply studied. Lactic acid bacteria are not important only in food industry. They are extensively applied in chemical, pharmaceutical and agricultural industries or in medicine. However, they have not only beneficial effects. Lactic acid bacteria can cause adverse effects and contamination of the product. The most important genera of lactic acid bacteria include Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Enterococcus, Streptococcus, Pediococcus and Weissella.

Poděkování Na tomto místě bych chtěla poděkovat především vedoucímu mé bakalářské práce doc. RNDr. Miroslavu Němcovi, CSc. za odbornou pomoc, trpělivost, cenné rady a za motivaci, díky které se tomuto tématu věnuji. Velké díky patří i mé rodině a přátelům, kteří mě po celou dobu studia podporovali a byli mi oporou. Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. Brno 10. května 2016 Věra Kotrsová

Obsah 1 Úvod... 10 2 Kvašení... 11 2.1 Mléčné kvašení... 11 2.2 Druhy substrátu... 16 2.2.1 Polyoly... 16 2.2.2 Organické kyseliny... 16 2.2.3 Aminokyseliny... 17 3 Taxonomie a charakteristika bakterií mléčného kvašení... 18 3.1 Lactococcus... 18 3.2 Streptococcus... 19 3.3 Enterococcus... 19 3.4 Lactobacillus... 20 3.5 Leuconostoc... 21 3.6 Pediococcus... 21 3.7 Weissella... 22 4 Bakteriociny... 22 4.1 Klasifikace bakteriocinů mléčných bakterií... 23 4.1.1 Kategorie I. Lantibiotika... 23 4.1.2 Kategorie II non-lantibiotika... 24 4.1.3 Kategorie III termolabilní bakteriociny... 24 4.2 Aplikace bakteriocinů... 24 5 Kyselina mléčná... 25 5.1 Historie... 25 5.2 Charakteristika... 26 5.3 Výskyt a výroba... 26 5.4 Aplikace... 27 8

6 Probiotika... 29 6.1 Probiotické preparáty... 29 6.2 Mikroorganizmy v probiotických preparátech... 29 6.3 Produkty probiotických bakterií prospěšné pro organizmus... 31 6.3.1 Vitamíny... 31 6.3.2 Exopolysacharidy... 31 6.4 Využití probiotik... 32 6.5 Prebiotika... 33 7 Bakterie mléčného kvašení v potravinářství... 34 7.1 Fermentované mléčné výrobky... 34 7.1.1 Jogurt... 34 7.1.2 Saké... 37 7.2 Fermentovaná zelenina... 38 7.2.1 Kysané zelí... 38 7.3 Bakterie mléčného kvašení v pivovarnictví... 40 7.3.1 Negativní účinky bakterií na pivo... 41 7.3.2 Pozitivní účinky bakterií na pivo... 42 7.4 Bakterie mléčného kvašení při výrobě vína... 44 7.4.1 Negativní účinky... 44 7.4.2 Pozitivní účinky... 45 8 Bakterie mléčného kvašení v procesu silážování... 47 8.1 Kontaminace siláže... 49 9 Závěr... 51 10 Seznam použité literatury... 53 9

1 Úvod Fermentační proces probíhá v přírodě spontánně. Převedení substrátu na výsledné produkty je zprostředkováno enzymatickou aktivitou. Bakterie mléčného kvašení jsou využívány zejména pro produkci kyseliny mléčné a dalších látek, které podporují, či inhibují růst jiných mikroorganizmů. Největší uplatnění mají mléčné bakterie v potravinářském průmyslu, kde slouží zejména ke konzervaci potravin a díky produkci specifických látek přispívají k jedinečné chuti výrobků. Využití v potravinářství je všeobecně známé. V posledních letech se však ukazuje, že je možné využít bakterie mléčného kvašení i v jiných oblastech. Nacházejí se stále nové možnosti pro jejich bezpodmínečnou přítomnost, ale také naopak, kdy je jejich přítomnost zcela nežádoucí. V posledních letech jsou laktobakterie velice intenzivně studovány zejména pro jejich schopnost produkovat vedle kyseliny mléčné i celou řadu dalších látek, včetně těch látek, které jsou schopny regulovat i celá mikrobiální společenstva pokud se týče diverzity i četnosti jednotlivých populací v různých prostředích. Značný význam je na ně kladen i jako na probiotika a jejich význam pro člověka i ostatní živočichy. 10

2 Kvašení Kvašení je metabolický proces, ve kterém se v podmínkách bez přístupu kyslíku rozkládá glukóza za účelem vytvoření ATP. Meziproduktem je pyruvát, jež je důležitou sloučeninou, která určuje konečné produkty kvašení (Gobbetti a kol. 2005; Klaban 2005). Fermentace je taky někdy označována jako anaerobně dehydrogenační proces, při kterém mají organické látky jak roli akceptorů, tak i donorů vodíku. Výsledkem těchto oxidačně redukčních procesů je tvorba jak oxidovaných, tak redukovaných metabolických produktů. Fermentace není pro organizmus příliš výhodný proces. Metabolity, které vzniknou kvasnými procesy, mají stále ještě vysokou energetickou hodnotu (Hoďák 1979). Po vzniku pyruvátu může metabolická dráha pokračovat dvěma směry. V aerobním prostředí dochází k respiračním procesům, při nichž je konečným akceptorem protonů a elektronů molekulový kyslík. Výtěžek ATP se pohybuje okolo 38 molekul na jeden mol spotřebovaného substrátu. V anaerobním prostředí dochází ke kvašení a energetický výtěžek je roven dvěma molekulám ATP na jeden mol spotřebovaného substrátu (Hoďák 1979; Kosař a Procházka 2000). Při fermentaci organických látek dochází obvykle k tvorbě směsi produktů, jako jsou například etanol, kyselina propionová, kyselina octová, kyselina mléčná, organická rozpouštědla aj. Podle toho, jaké metabolity převažují, dostává kvašení svůj název. Vzniká-li etanol, nazýváme jej etanolové kvašení. Pokud vzniká kyselina mléčná, je používán název mléčné kvašení, atd. (Němec 2015). 2.1 Mléčné kvašení Mléčné kvašení je proces, kdy za anaerobních podmínek vzniká v průběhu glykolýzy pyruvát, který je posléze redukován laktátdehydrogenázou s NADH na laktát. Tato dráha je charakteristická pro fyziologickou skupinu bakterií mléčného kvašení. Stejným mechanizmem, jako u těchto bakterií, probíhá mléčné kvašení ve svalové tkáni lidí a zvířat (Zaunmüller a kol. 2006). 11

Obr. 1. Schéma mléčného kvašení (Převzato a upraveno z: http://www.shmoop.com/cell-respiration/fermentationanaerobic-respiration.html, 1.2.2016). Bakterie mléčného kvašení jsou využívány především v potravinářství, a to právě díky tvorbě kyseliny mléčné, senzoricky aktivních látek, a také pro produkci některých látek s antimikrobním účinkem. Mléčné bakterie lze dělit do dvou kategorií, a to dle toho, jaký produkt vznikne fermentací sacharidů (Kalhotka 2014). Do první kategorie se řadí homofermentativní bakterie. V tomto procesu vznikají z 1 molu sacharidu (hexózy) 2 moly ATP a 2 moly pyruvátu. Pomocí laktátdehydrogenázy je pyruvát redukován na laktát, který je konečným produktem (Klaban 2005). Druhá kategorie zahrnuje mléčné bakterie heterofermentativní. Při fermentaci nevzniká jen jeden produkt, ale několik. Primárně se jedná o kyselinu mléčnou, etanol, kyselinu octovou a oxid uhličitý. Výtěžek ATP ze sacharidu je 1 mol (Kalhotka 2014; Klaban 2005). Homofermentativní a heterofermentativní bakterie nejsou rozlišeny pouze podle vzniklých produktů, ale také dle mechanizmu fermentace. Zatímco při homofermentativním procesu probíhá přeměna glukózy pomocí glykolýzy, 12

u heterofermentativního procesu tato přeměna probíhá přes 6-fosfoglukanovou kyselinu a vznikající pentózy (Hoďák 1979). Obr. 2. Homofermentativní mléčné kvašení (Převzato a upraveno z: https://commons.wikimedia.org/wiki/file:homofermentative- Milchsäuregärung.pn, 1.2.2016). 13

Obr. 3. Heterofermentativní mléčné kvašení (Kaprálek 2000). 14

Tabulka 1. Rozdělení mléčných bakterií dle způsobu fermentace Rod Druh Fermentace Lactobacillus Lactobacillus Pediococcus Enterococcus Lactococcus Streptococcus Leuconostoc Weissella acidophilus casei plantarum salivarius helveticus delbrueckii brevis buchneri fermentum sake acidilactici pentosaceus damnosus fecalis faecium durans lactis cremoris bovis salivarius thermophilus mesenteroides carnosum lactis cibaria viridescenc Homofermentativní Heterofermentativní Homofermentativní Homofermentativní Homofermentativní Homofermentativní Heterofermentativní Heterofermentativní (Bolsen a kol. 1996; Schlegel a kol. 1993, upraveno). 15

2.2 Druhy substrátu Primárním substrátem pro fermentaci bakterií mléčného kvašení jsou cukry (pentózy, hexózy). Nejsou ale jedinými možnými zdroji. Mezi další látky vhodné pro využití jako substrátu jsou řazeny polyoly, organické kyseliny a aminokyseliny. 2.2.1 Polyoly Do skupiny polyolů je řazen například mannitol. Polyoly nejsou běžně mléčnými bakteriemi fermentovány, mannitol tvoří výjimku. Tento zdroj energie a uhlíku je využíván zejména druhy Lactobacillus plantarum a Lactobacillus casei přítomné při fermentaci potravin a nápojů. Fermentační dráha probíhá dle schématu: mannitol mannitol-1-p 2 laktát fruktóza-6-p 2 pyruvát Mannitol není jediný polyol, který je fermentován mléčnými bakteriemi. Substrátem může být taky sorbitol. Tato fermentační dráha ale nebyla doposud zcela objasněna (Liu 2003). 2.2.2 Organické kyseliny Mnoho zástupců bakterií mléčného kvašení je schopno přeměňovat soli organických kyselin na výsledný produkt, laktát. Příkladem takové soli je malát (sůl kyseliny jablečné), jehož konverze je znázorněna na schématu. Tento proces je znám jako malolaktická fermentace. malát laktát CO 2 16

Výjimku tvoří druhy Enterococus ke konverzi malátu odlišnou cestou: faecalis a Lactobacillus casei, u nichž dochází malát pyruvát CO 2 Pyruvát může být dále přeměněn na laktát pomocí laktátdehydrogenázy, nebo na jiné látky, jako je například acetát, etanol, acetaldehyd aj., a to za účasti dalších enzymů. Z dalších solí organických kyselin lze zmínit citrát, tartrát nebo fumarát, které jsou taky užívány bakteriemi mléčného kvašení ke konverzi na pyruvát, či laktát (Liu 2003; Zaunmüller a kol. 2006). 2.2.3 Aminokyseliny Aminokyseliny mohou být rovněž využity jako substrát pro fermentaci mléčnými bakteriemi. Transformace aminokyselin tímto směrem probíhá však pouze výjimečně. U druhu Lactococcus lactis byla prostudována konverze serinu na pyruvát, který je následně přeměněn na laktát. Aminokyseliny jsou přeměňovány na výsledné produkty pomocí procesu deaminace nebo transaminace, které jsou katalyzovány pomocí enzymů - aminotranferáz. Vznik pyruvátu transaminací může být přímý, nebo nepřímý. Oba typy jsou znázorněny ve schématu na příkladu transaminace alaninu a aspartátu (Liu 2003). Přímý (A) a nepřímý (B) vznik pyruvátu transaminací. Akceptorem aminoskupiny je α-ketoglutarát (Liu 2003). A alanin Akceptor aminoskupiny pyruvát Nová aminokys. (glutamát) 17

B aspartát Akceptor aminoskupiny pyruvát Nová aminokys. (glutamát) oxalacetát 3 Taxonomie a charakteristika bakterií mléčného kvašení 3.1 Lactococcus Doména Bacteria, kmen Firmicutes, třída Bacilli, řád Lactobacillales, čeleď Streptococcaceae. Jedná se o grampozitivní buňky sférického (až ovoidního) tvaru. Vyskytují se po dvou, někdy je lze pozorovat také v krátkých řetízcích. Zástupci rodu Lactococcus netvoří spory, nepohybují se a nemají pouzdra. Z hlediska využívání kyslíku jsou řazeny mezi fakultativně anaerobní organizmy s fermentatorním metabolizmem. Rostou v relativně širokém teplotním rozmezí 10-37 o C. Vyskytují se převážně v potravinách, mléčných výrobcích, rostlinných materiálech, byly ale také izolovány z klinického materiálu. L.lactis subsp. lactis přítomny v mléce. Díky silné produkci kyseliny mléčné dochází ke snížení ph a následnému srážení mléka. Proto se užívají při výrobě sýrů jako startovací kultury. Označují se taky jako bakteriální sýřidlo. Mohou produkovat bakteriocin nisin. L.lactis subsp. cremoris taktéž přítomny v mléce, výroba sýrů, sýřidlo. L.garvieae vyskytuje se v prostředí, způsobuje bovinní mastitidy. Pro člověka je patogenní jen výjimečně (Klein a kol. 1998; Sedláček 2007). 18

3.2 Streptococcus Doména Bacteria, kmen Firmicutes, třída Bacilli, řád Lactobacillales, čeleď Streptococcaceae. Zástupci tohoto rodu jsou grampozitivní koky mající sférický či ovoidní tvar. Tvar buněk je odlišný u jednotlivých kmenů, a taktéž je ovlivněn typem média, které je použito pro kultivaci. Vyskytují se ve dvojicích nebo v řetízcích. Jsou nepohybliví, spory netvoří, u některých druhů je možné pozorovat pouzdra. Mají fermentatorní metabolizmus, produktem je laktát bez tvorby plynu. Vzhledem ke kyslíku jsou fakultativně anaerobní, někteří kapnofilní (růst je podpořen přítomností CO2). Růstová teplota se pohybuje v rozmezí 25 45 o C. U rodu Streptococcus je možno na krevním agaru pozorovat hemolýzu, a to buď projasněním média (β-hemolýza), nebo jeho nazelenalým zbarvením (α-hemolýza). Většina druhů nemá větší význam v potravinářství. Vyskytují se spíše jako parazité či komenzálové obratlovců (ústa, respirační trakt), v prostředí (saprofyté) nebo jako patogeny člověka a zvířat (Němec 2015; Sedláček 2007). S.bovis vyskytuje se v trávicím traktu přežvýkavců. S.salivarius komenzál v dutině ústní u lidí. S.thermophilus bývá využíván jako startovací kultura pro výrobu jogurtů. 3.3 Enterococcus Doména Bacteria, kmen Firmicutes, třída Bacilli, řád Lactobacillales, čeleď Enterococcaceae. Grampozitivní buňky sférického, ovoidního tvaru. Lze pozorovat výskyt ve dvojicích, krátkých řetízcích nebo malých shlucích. Nevyskytují se u nich ani pouzdra, ani endospory, zato je u některých jedinců možno pozorovat nevýrazné bičíky, díky kterým se mohou pohybovat. Pro svůj růst vyžadují nutričně bohatá média a anaerobní podmínky. Metabolizmus je fermentatorní, hlavním produktem je kyselina mléčná. Optimální teplota pro růst se pohybuje od 10 do 45 o C (Sedláček 2007). Enterokoky je možno nalézt jak v prostředí, půdě, tak i v klinickém materiálu a potravinách. 19

E. faecalis objevují se ve stolici člověka i zvířat, v rostlinách, potravinách, u lidí mohou způsobovat infekce močových cest a také endokarditidy. E. durans je používán především pro výrobu mléčných fermentovaných výrobků (jogurt). Lze se s ním ale setkat také v prostředí. E. malodoratus využíván při výrobě sýrů. Izolován byl ze sýru Gouda (Klein a kol. 1998; Sedláček 2007). 3.4 Lactobacillus Doména Bacteria, kmen Firmicutes, třída Bacilli, řád Lactobacillales, čeleď Lactobacillaceae. Tyto mikroorganizmy lze pozorovat ve tvaru pravidelných, delších tyček uspořádaných v palisádách. Dle Grama se barví pozitivně, nesporulují, zřídkakdy jsou pohyblivé. Jsou fakultativně anaerobní, někdy mikroaerofilní. Je dokázáno, že za přítomnosti 5% CO2 je růst laktobacilů podpořen. Metabolizmus je fermentatorní. Ideální teplota pro růst se pohybuje v rozmezí 30 40 o C. Laktobacily se nachází v prostředí, v trávicím traktu živočichů, ústní dutině, v potravinách, ve fermentovaných produktech (kysané zelí, siláže). Lze je rozdělit do tří skupin, a to podle konečného produktu v procesu fermentace. 1. Obligátně homofermentativní produktem fermentace hexóz je pouze kyselina mléčná, pentózy fermentovány nejsou. L.delbrueckii subsp. delbrueckii, L.delbrueckii subsp. lactis, L.delbrueckii subsp. bulgaricus, L.helveticus 2. Fakultativně heterofermentativní kromě kyseliny mléčné vzniká fermentací hexóz kyselina octová, mravenčí a etanol. Z pentóz vznikají kyseliny mléčná a octová. L.sake, L.casei. 3. Obligátně heterofermentativní z hexóz tvoří kyselinu mléčnou a octovou. Směs kyselin mléčné a octové pak vzniká taktéž fermentací pentóz. L.kefir, L.fermentum, L.buchneri (Klein a kol. 1998; Sedláček 2007). 20

3.5 Leuconostoc Doména Bacteria, kmen Firmicutes, třída Bacilli, řád Lactobacillales, čeleď Leuconostocaceae. Velice pomalu rostoucí, grampozitivní kokotyčky, někdy ve tvaru čočky. Vyskytují se ve dvojicích nebo v řetízcích. Spory nevytváří, pohyb u nich nedetekujeme. Na pevném médiu rostou v malých koloniích, které mohou produkovat sliz (v případě, že médium obsahuje sacharózu). Jsou řazeny mezi fakultativně anaerobní organizmy s růstem v teplotním rozmezí 10 30 o C. U leukonostoků se vyskytuje přirozená rezistence k vankomycinu. Vyskytují se v potravinách, zejména v mléčných výrobcích. Lze je ale také nalézt na rostlinách, dokonce byly některé druhy izolovány i z humánního materiálu (Sedláček 2007; Stiles a Holzapfel 1997). L.carnosum je velice tolerantní k nízkým teplotám, dokáže produkovat bakteriociny, často se vyskytuje v chlazeném baleném mase. L.mesenteroides výskyt především v mléčných fermentovaných výrobcích a rostlinných materiálech. Pokud je kultivován na médiu obsahující glukózu, produkuje polysacharid dextran (Němec 2015). 3.6 Pediococcus Doména Bacteria, kmen Firmicutes, třída Bacilli, řád Lactobacillales, čeleď Lactobacillaceae. Grampozitivní buňky sférického tvaru uspořádané v tetrádách. Nepohybují se, netvoří spory. Jsou fakultativně anaerobní, růst některých kmenů je přítomností kyslíku inhibován. Mají fermentatorní metabolizmus. Přirozeně jsou rezistentní k vankomycinu. Ideální růst je sledován při 25-40 o C (Sedláček 2007; Stiles a Holzapfel 1997). Hojný je jejich výskyt především ve spojitosti s rostlinami, potravinami a nápoji. Některé kmeny se vyskytují jako kontaminanty při výrobě vína a piva. Jiné se naopak aplikují při výrobě piva záměrně. Pediokoky jsou také využívány jako probiotika. P.acidilactici fermentované potraviny (maso, mléčné výrobky, zelenina), siláže. 21

P.damnosus vyskytuje se jako kontaminující organizmus zejména ve výrobnách piva, vína, moštů (Němec 2015). 3.7 Weissella Doména Bacteria, kmen Firmicutes, třída Bacilli, řád Lactobacillales, čeleď Leuconostocaceae. Grampozitivní kokotyčky, nebo tyčky, u kterých lze pozorovat zúžené nebo zakulacené konce. Seskupují se do dvojic, krátkých řetízků nebo se vyskytují samostatně. Stejně jako u předešlých rodů, ani zde se nevyskytují spory a není pozorován pohyb. Kyselé prostředí jim nevadí, jsou acidurické. Jsou řazeny mezi heterofermentativní bakterie (Sedláček 2007). Zástupce rodu Weissella lze najít na kůži, v mléce, fermentovaných potravinách, ve stolici, vagíně, lidských slinách, v rostlinných produktech nebo zvířecích výkalech. Hovoří se také o probiotických účincích (Fusco a kol. 2015). W.cibaria vnímáno jako potenciální probiotikum. Je zkoumána schopnost degradovat biofilm (zejména v dutině ústní). Vyskytuje se také jako oportunní patogen lidí. W.viridescens původně řazeno do rodu Lactobacillus. Způsobuje kažení uzeného masa (nazelenalé zbarvení) a dalších masných výrobků (Sedláček 2007). 4 Bakteriociny Velké množství grampozitivních i gramnegativních bakterií produkují během svého růstu látky proteinové struktury, které vykazují antimikrobiální účinky. Tyto látky se nazývají bakteriociny. Buňka je imunní vůči bakteriocinu, který sama produkuje. Většina bakteriocinů produkovaných mléčnými bakteriemi jsou malé (<10 kda), kationtové, termostabilní a membránu permeabilizující peptidy. Bakteriociny mohou být snadno degradovány enzymy, zejména proteázami v savčím gastrointestinálním traktu. Díky tomu nejsou pro člověka nebezpečné. 22

Vzhledem k produkci bakteriocinů je dnes v rámci grampozitivních bakterií věnována pozornost zejména bakteriím mléčného kvašení (Zacharof a Lovitt 2012). 4.1 Klasifikace bakteriocinů mléčných bakterií Ačkoli mohou být bakteriociny kategorizovány jako antibiotika, není tomu tak. Jeden z největších rozdílů mezi antibiotiky a bakteriociny je následující. Bakteriociny působí specifičtěji pouze na určité druhy bakterií, kdežto antibiotika mají mnohem širší spektrum účinnosti. Bakteriociny jsou syntetizovány na ribozomech, a jsou produkovány během primární fáze růstu buňky. Antibiotika jsou sekundárními metabolity (Zacharof a Lovitt 2012). Doposud nebyly popsány žádné případy rezistence k bakteriocinům. Lze to vysvětlit tím, že bakteriociny působí velice rychle i při malých koncentracích, tj. rychle tvoří póry v membráně cílové bakterie. Dalším faktorem je fakt, že jsou snadno degradovány, tudíž v organizmu nebo v prostředí nepřežívají tak dlouho, což minimalizuje možnost interakce cílových kmenů s těmito degradovanými antibiotickými (bakteriocidními) fragmenty. Právě toto bývá prvotním krokem k získání rezistence k antibiotikům. Bakteriociny jsou bezbarvé, bez chuti a zápachu, a jsou aktivní ve velkém rozmezí ph. Všechny tyto atributy zvyšují jejich užití v praxi (Perez a kol. 2014). Klasifikace bakteriocinů byla v posledních letech často revidována, a to zejména díky neustálému výzkumu a objevování nových poznatků. Nyní by se daly rozdělit do tří kategorií (Zacharof a Lovitt 2012). 4.1.1 Kategorie I. Lantibiotika Lantibiotika jsou látky obsahující aminokyseliny jako lantionin a metyllantionin. Tento typ bakteriocinu je účinný zejména proti grampozitivním bakteriím. Účinek na gramnegativní bakterie není běžný. Jedná se o malé proteiny (<5kDa). Nejznámější zástupci této skupiny jsou nisin a lacticin. (Zacharof a Lovitt 2012; Lee a Kim 2011). Nejrozšířenějším a nejvíce využívaným bakteriocinem je nisin. Je produkován druhem Lactococcus lactis. Jedná se o jediný bakteriocin, který je oficiálně celosvětově využíván v potravinářském průmyslu, a to jako aditivum proti kažení potravin. Jeho účinek je pozorován již při nanomolární koncentraci. Je efektivní proti grampozitivním 23

patogenním mikroorganizmům nacházejícím se v potravinách, jako jsou například Staphylococcus aureus a Listeria monocytogenes. Podle evropské klasifikace pro potravinová aditiva bylo nisinu přiřazeno označení E234 (Zacharof a Lovitt 2012). 4.1.2 Kategorie II non-lantibiotika Malé proteiny (<10kDa), termostabilní, neobsahující lanthionin. Tato kategorie je rozdělena do dvou skupin. První bývá nazývána jako pediocin-like (Zacharof a Lovitt 2012). Mezi zástupce pediocin-like skupiny patří například pediocin PA-1, který je produkován bakteriálním druhem Pediococcus acidilactici. Druhým zástupcem této skupiny je například sakacin A, jež je produkován Lactobacillus sake. Oba tyto bakteriociny jsou účinné proti Listeria monocytogenes (Rodríguez a kol. 2002). Druhá skupina zahrnuje dvoukomponentní bakteriociny (dva peptidické řetězce). Aby bylo dosaženo antimikrobiálních účinků, je nezbytné, aby obě tyto komponenty fungovaly synergicky. Mezi zástupce patří lactacin F, který je produkován druhem Lactobacillus johnsonii a je účinný proti druhu Enterococcus faecalis a některým druhům laktobacilů. Dalším zástupcem je například lactococcin G (Allison a kol. 1995). 4.1.3 Kategorie III termolabilní bakteriociny Tato kategorie zahrnuje termolabilní proteiny o větší velikosti (>30kDa). Zástupci jsou helveticin J, který je produkován druhem Lactobacillus helveticus a působí proti některým druhům stejného rodu. Patří sem také enterolysin, jehož producentem je Enterococcus faecium a působí proti enterokokům, pediokokům, laktokokům a laktobacilům (Zacharof 2012). 4.2 Aplikace bakteriocinů Bakteriociny produkované bakteriemi mohou být použity v potravinářském průmyslu jako přírodní konzervační látky (De Vuyst a Leroy 2007). 24

V praxi se využívá mnoho metod pro konzervaci potravin. Mezi ně patří například tepelná úprava (pasterizace, tepelná sterilizace), okyselování, dehydratace nebo přidávání různých organických aditiv (antibiotika, laktát, propionát, acetát aj.). Tyto metody jsou velice účinné, ale v posledních letech roste poptávka po přirozených produktech (tj. bez aditiv) s vysokým obsahem zdraví prospěšných látek (Zacharof a Lovitt 2012). Bakteriociny se mohou vyrábět v laboratorních podmínkách a následně aplikovat do potravin, nebo mohou být produkovány přímo v potravinách. Bylo dokázáno, že bakterie mléčného kvašení mohou produkovat své bakteriociny v potravinové matrici, a tím inhibovat přítomné bakterie, které způsobují kažení dané potraviny. Tento jev byl pozorován především u fermentovaných potravin, jako jsou klobásy, zelenina, olivy a mléčné výrobky (De Vuyst a Leroy 2007). Na druhou stranu je známé, že použití pouze samotného bakteriocinu jako biokonzervantu nezaručí stoprocentní ochranu před zkažením potravin (zejména v případě působení proti gramnegativním bakteriím). Proto je vhodné aplikovat bakteriociny v kombinaci s jinými technologiemi, které dokáží narušit buněčnou stěnu a umožní tak bakteriocinům efektivněji působit na cílovou buňku. Nabízí se například pulzní elektrické pole (PEF). Patogenní mikroorganizmus je usmrcen, ale vlastnosti potraviny jsou nezměněny (Zacharof a Lovitt 2012). 5 Kyselina mléčná 5.1 Historie Poprvé byla kyselina mléčná popsána švýcarským farmaceutickým chemikem Carl Wilhelm Scheele v roce 1780. Tato sloučenina byla izolována z kyselého mléka, a byla tehdy považována za mléčnou složku. Až v roce 1857 bylo zjištěno, že se nejedná o mléčnou složku, nýbrž o produkt určitých mikroorganizmů přítomných v mléce. Za tímto objevem stál Louis Pasteur (Wee a kol. 2006). 25

5.2 Charakteristika Kyselina mléčná se vyskytuje ve dvou optických izomerech. Jedná se o L(+) a D(-) formu. Je světově uznána jako bezpečná pro aplikaci v potravinách a je vhodná ke konzumaci. Nicméně, využívá se však pouze její L(-) forma. U D(+) formy byly zjištěny negativní účinky na organizmus. Po jejím nadměrném požití může dojít k acidóze a odvápnění (Wee a kol. 2006). Jedná se o netěkavou látku, bez zápachu, s jen mírně kyselou chutí (Datta a kol. 1995). Obr. 4. Izomery kyseliny mléčné (Převzato a upraveno z: http://nptel.ac.in/courses/116102006/module6/ chapter%206.1.html, 19.3.2016). 5.3 Výskyt a výroba Kyselina mléčná je produkována zejména bakteriemi mléčného kvašení. Nejsou to ale jediné mikroorganizmy, které ji produkují. Známí jsou zástupci rodu Bacillus (B.coagulans), některé druhy plísní (Rhizopus microsporus, Rhizopus oryzae) a geneticky modifikované kmeny Escherichia coli a Saccharomyces cerevisiae, které kyselinu mléčnou produkují. Výběr mikroorganizmů pro produkci kyseliny mléčné závisí na několika aspektech, mezi které patří například typ sacharidu přítomného v substrátu, teplota růstu, nutriční požadavky nebo převažující optický izomer vyprodukované kyseliny (Tortorello a Batt 2014). L-kyselina mléčná je produkována rody Aerococcus, Enterococcus, Lactococcus, Streptococcus, Carnobacterium, Tetragenococcus a Vagococcus. D-kyselina mléčná 26

je metabolitem rodů Leuconostoc a Oenococcus. Rody Lactobacillus, Pediococcus a Weissella produkují D-, L- i DL-formu kyseliny mléčné. Tvorba konkrétního izomeru je závislá na druhu organizmu. Izomery kyseliny mléčné se liší optickou aktivitou. Při průchodu polarizovaného světla L- formou dochází k otáčení světelné roviny doprava, kdežto D- forma otáčí rovinu světla doleva. Směs obou izomerů v poměru 1:1 se nazývá racemická směs a je označována DL (Wee a kol. 2006). Identifikace bakterií mléčného kvašení na základě tvorby daného izomeru kyseliny mléčné může být komplikovaná. Důvodem je přítomnost enzymu racemázy u některých mléčných bakterií. Tento enzym má schopnost konvertovat jednu formu izomeru na druhou. Ačkoli přítomnost enzymu racemáza je potvrzena pouze u tří druhů (Lactobacillus sakei, L. curvatus, L. casei subsp. pseudoplantarum) u ostatních druhů není vyloučena (Liu 2003). 5.4 Aplikace Kyselina mléčná dnes patří mezi nejužitečnější chemické látky využívané v potravinářském průmyslu jako konzervační, okyselující a chuť dodávající látka. Velké uplatnění má také v textilním, farmaceutickém a chemickém průmyslu (Wee a kol. 2006). Nejvíce je kyselina mléčná využívána právě v potravinářském průmyslu. Je výborným konzervační látkou pro zelí, olivy, nakládanou zeleninu, cukrovinky, pekařské a mléčné výrobky, pivo, marmelády a mnoho dalších produktů (Datta a kol. 1995). Kyselina mléčná disponuje schopností inhibovat růst mnoha patogenních organizmů zahrnující i gramnegativní druhy z čeledi Enterobacteriaceae a Pseudomonodaceae. Je uznávána jako přírodní konzervační látka v přirozeně zkvašených produktech a často je aplikována při dekontaminaci čerstvého masa. Má schopnost v nedisociované formě pronikat skrze cytoplazmatickou membránu, a tím ovlivnit intracelulární ph. Jako malá molekula rozpustná ve vodě se také jednoduše dostane do periplazmatického prostoru gramnegativních bakterií (skrze poriny přítomné ve vnější membráně). Následkem je změna propustnosti vnější membrány. Tento proces samotný není považován jako baktericidní, ale díky změně 27

propustnosti vnější membrány je umožněno proniknutí jiných sloučenin, jako jsou například bakteriociny, antibiotika nebo lysozymy dovnitř buňky (Alakomi a kol. 2000). Obr. 5. Schéma buněčné stěny gramnegativních bakterií (Převzato a upraveno z: http://www.clearcoli.com/technology/lps-background/, 16.3.2016). Také ve farmaceutickém průmyslu je kyselina mléčná často využívána a to například při výrobě tablet či dialyzačních roztoků. Nabízí se rovněž jako přírodní složka pro kosmetické účely. Disponuje hydratačními účinky, možností regulace ph a antimikrobiálními účinky. Díky její schopnosti potlačit tvorbu tyrozinázy dochází po její aplikaci k zesvětlení pokožky. Účinky kyseliny mléčné lze pozorovat i v boji proti vráskám a akné (Wee a kol. 2006). Ve velké míře se využívá kyselina mléčná, respektive její polymer (kyselina polymléčná PLA), k výrobě biologicky lehce rozložitelných plastů - obalů na tekutiny nebo potraviny, sáčků do odpadkových košů atd. Uplatnění lze nalézt i v medicíně především u chirurgických nití, které se velice rychle vstřebávají a jsou vhodné zejména pro vnitřní šití a některé implantáty (Tortorello a Batt 2014). V chemickém průmyslu je kyselina mléčná často využívána pro schopnost konverze na jiné látky, jako je kyselina propionová, akrylová (používaná pro výrobu plexiskla a plexigumy), acetaldehyd a propylenoxid. V koželužství má nezastupitelnou úlohu při dekalcinaci kůží nebo v barvířství jako mořidlo. Mezi další vlastnosti patří schopnost 28

odstraňovat vodní kámen, regulovat ph a možnost použití jako neutralizační, rozpouštěcí, čistící, antimikrobiální a zvlhčovací činidlo (Wee a kol. 2006). 6 Probiotika Jako první, kdo se začal zabývat probiotiky, a zdůraznil jejich vliv na organizmus, byl ruský vědec Ilja Iljič Mechnikov. V roce 1908 byl oceněn společně s Paulem Ehrlichem Nobelovou cenou za medicínu, za jejich objevy v oblasti imunity (Rayes a kol. 2009). Termín probiotika byl ale poprvé použit až v roce 1965. Jedná se o doplňky stravy, které obsahují živé mikroorganizmy a zlepšují rovnováhu mikroorganizmů ve střevě. Toho se využívá mimo jiné pro obnovení střevní mikroflóry po různých lékařských zákrocích, jako je léčba pomocí antibiotik, imunosupresiv nebo ozařování (Gupta a Garg 2009). 6.1 Probiotické preparáty Probiotické preparáty jsou běžně dostupné v mnoha formách. Již od pradávna jsou využívány produkty obsahující probiotické kultury. Příkladem takových přirozených produktů je například jogurt, kefír a kysané zelí. Dnes jsou probiotika dostupná nejen ve fermentovaných výrobcích, ale taky ve formě tablet, prášku nebo nápojů (Gibson a Rastall 2006). Zdrojem probiotických kultur je i velice populární jemně perlivý nápoj kombucha, který vzniká fermentací čaje, či jemu podobný nápoj vodní kefír. V obou případech jsou v nápoji přítomny laktobacily a kvasinky. Často je konzumován i kokosový kefír, který je vyráběn z čerstvého kokosového mléka a startovací kefírové kultury (Chatterjee a kol. 2011). 6.2 Mikroorganizmy v probiotických preparátech Z kategorie bakterií mléčného kvašení jsou jako probiotika využíváni zástupci rodů Lactobacillus, Streptococcus, Enterococus a Bifidobacteium, ale také zástupci rodu 29

Bacillus, nebo kvasinek Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii (Gupta a Garg 2009). Tabulka 2. Účinek probiotických kultur na lidský organizmus Probiotické bakterie/kvasinky Bifidobakterium bifidum Enterococcus faecium Lactobacillus acidophilus Lactobacillus plantarum Lactobacillus delbrueckii Lactobacillus helveticus Streptococcus thermophilus Saccharomyces boulardii Účinek na organizmus Proti průjmům, rotavirovým infekcím, novorozeneckým nekrotizujícím enterokolitidám; ke snížení cholesterolu. Snížení cholesterolu, podpora léčby gastroenteritid, zvýšení sekrece mucinu, zlepšení slizniční imunitní funkce. Pozitivní vliv na organizmus při léčbě hepatické encefalopatie a rakoviny střeva; snížení cholesterolu. Podpora při léčbě gastroenteritid, zácpy, nadýmání, plynatosti; pozitivní vliv na imunitu u HIV pozitivních pacientů. Pozitivní vliv na organizmus při léčbě hepatické encefalopatie a při léčbě rakoviny; lepší stravitelnost laktózy. Snížení krevního tlaku; pozitivní vliv při léčbě rakoviny. Pozitivní vliv při léčbě dětských průjmů, hepatické encefalopatie; snížení cholesterolu; lepší stravitelnost laktózy. Pozitivní vliv při léčbě průjmů způsobených Clostridium difficile a při antibiotické léčbě; eliminace relapsů u pacientů s Crohnovou chorobou. (Parvez a kol. 2006, upraveno). 30

6.3 Produkty probiotických bakterií prospěšné pro organizmus 6.3.1 Vitamíny Vitamíny hrají důležitou roli ve zdraví lidí. Lidský organizmus nedokáže všechny tyto důležité látky produkovat, tudíž je nutno je přijímat v potravinách nebo výživových doplňcích. Některé střevní bakterie ale dokáží některé vitamíny syntetizovat. U bakterií mléčného kvašení a bifidobakterií je prokázána produkce vitamínů, jako jsou kyselina listová (folát), B12 (kobalamin), K2 (menaquonin), B2 (riboflavin) a B1 (thiamin). V rámci syntézy vitamínů je užití probiotických kultur výhodné z hlediska zvýšení nutričních hodnot fermentovaných potravin (Tamime 2005). 6.3.2 Exopolysacharidy Exopolysacharidy jsou látky, které jsou produkovány sekrecí z buňky bakterií mléčného kvašení, bifidobakterií a propionových bakterií. Tyto látky mohou, ale nemusí být, po exkreci připojeny k buněčné stěně. Exopolysacharidy jsou vhodné pro organizmus zejména pro jejich protinádorové a cholesterol snižující účinky. Přispívají ke zlepšení stability a struktury fermentovaných výrobků, k ochraně buňky před napadením bakteriofágy, vysoušením a osmotickým stresem (Tamime 2005). Exopolysacharidy produkované Streptococcus salivarius a S. mutans se podílí také na tvorbě zubního plaku. Bylo rovněž zjištěno, že exopolysacharidy kmene Lactococcus lactis subsp. cremoris NZ4010 poskytují buňce ochranu před antimikrobiálními faktory, jako jsou bakteriofágy, kovové ionty, lysozymy nebo bakteriocin nisin. Při výrobě jogurtů mají exopolysacharidy produkované startovacími kulturami Streptococcus thermophilus a Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus vliv na strukturu výsledného produktu. Exopolysacharidy kmene Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus OLL 1073R-1 disponují protinádorovými účinky na hostitelský organizmus (Madiedo a kol. 2001). 31

Tabulka 3. Exopolysacharidy produkované mléčnými bakteriemi Exopolysacharidy Dextrany Mutany Alternany β-d-glukany Levany Polygalaktany Druh Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum Streptococcus mutans Streptococcus sobrinus Leuconostoc mesenteroides Pediococcus spp. Streptococcus spp. Streptococcus salivarius Lactococcus lactis subsp. lactis (Madiedo a kol. 2001, upraveno). 6.4 Využití probiotik Mezi příznivé účinky bakterií mléčného kvašení (probiotik) na lidský organizmus patří například zlepšení kondice střevního traktu, posílení imunitního systému, zlepšení dostupnosti živin, zmírnění příznaků laktózové intolerance, snížení výskytů alergií a rizika vzniku některých druhů rakoviny (Parvez a kol. 2006). Z komerčního hlediska se tvrdí, že probiotika mají široké spektrum účinnosti. Že byla prokázána účinnost v boji proti dětským průjmům, nekrotizujícím enterokolitidám, průjmům způsobených užíváním antibiotik. Ale seriózně byl deklarován účinek proti kolitidám vyvolaným patogenní bakterií Clostridium difficle, nebo infekcím způsobených Helicobacter pylori (Gupta a Garg 2009). Popsány jsou případy, kdy aplikace probiotik, konkrétně Lactobacillus sporogenes, vykazovala preventivní účinek proti rotavirovým infekcím působícím v žaludku (Tannock 1997). Probiotika mohou napomáhat k udržování epiteliální celistvosti díky produkci omega-3-mastných kyselin, inhibicí změn epiteliální propustnosti vyvolané patogeny a regulací genové exprese enterocytů. Některé kmeny dokáží ovlivňovat imunitní systém, a to například modulací fenotypu dendritických buněk, redukcí prozánětlivých 32

cytokinů a indukcí protizánětlivých cytokinů. Taktéž aktivují makrofágy, čímž je stimulována nespecifická imunita (Rayes a kol. 2009). Mechanizmus, jakým probiotika působí, není zcela znám. Pravděpodobně ale zahrnuje úpravu ph ve střevním traktu, inhibici růstu patogenních mikroorganizmů díky produkci antimikrobiálních látek (bakteriocinů), soutěž s patogeny o vazebné místo živiny, produkci laktázy a stimulaci imunomodulačních buněk (Parvez a kol. 2006). Probiotika jsou živé organizmy, a proto existuje jistá šance, že po jejich konzumaci dojde k infekci hostitele. Ačkoli se obecně považuje probiotická terapie jako bezpečná, jsou popsány případy infekcí a sepsí, například po aplikaci bifidobakterií a enterokoků. Proto by měla být zvážena rizika případného negativního působení probiotických bakterií s rizikem působení patogenních organizmů, proti kterým má být tato probiotická léčba nasazena. Případy sepsí spojených s probiotickou léčbou jsou zaznamenány zejména u novorozenců a pacientů s oslabenou imunitou (Gupta a Garg 2009). 6.5 Prebiotika Prebiotika jsou nejčastěji definována jako látky, které jsou součástí nestravitelné potravy, a které mají příznivý vliv na růst a činnost určitých bakterií vyskytující se v tlustém střevě, a tím se zlepšuje zdravotní kondici hostitele (Slavin 2013). Využívány jsou především oligosacharidy. Jsou složené z 2 20 monosacharidových jednotek, které odolávají trávicím enzymům a jsou využívány v tlustém střevě probiotickými bakteriemi (Tamime 2005). Aby mohla být látka hodnocena jako prebiotikum, a mohla být za tímto účelem použita, musí být splněna určitá kritéria. Je nutné, aby tato látka byla odolná vůči žaludečním šťávám, hydrolýze savčími enzymy a absorpci v gastrointestinálním traktu. Dále musí být snadno fermentována střevní mikroflórou a musí podporovat růst a aktivitu střevní mikroflóry zejména probiotických bakterií (Roberfroid 2007). Dnes jsou běžně na trhu dostupné látky, které splňují podmínky (popsány výše) k tomu, aby mohly nést název prebiotika, a mohly být k těmto účelům využívány. Jedná se například o inulin, oligosacharidy a fruktooligosacharidy. 33

Mnoho takových látek lze ale nalézt i v přírodě. Mezi nejčastěji konzumované přírodní probiotika patří sojové boby, oves, pšenice, ječmen, topinambur (jeruzalémské artyčoky), kořen čekanky, cibule, česnek pór a chřest (Chatterjee a kol. 2011). 7 Bakterie mléčného kvašení v potravinářství Mnoho bakterií mléčného kvašení se podílí na fermentaci potravin a nápojů. Jsou to například mléčné produkty, maso, zelenina, pekařský kvásek, pivo, víno a jiné alkoholické nápoje. 7.1 Fermentované mléčné výrobky 7.1.1 Jogurt Jogurt je produkt mléčného kvašení, které je způsobeno termofilními homofermentativními bakteriemi mléčného kvašení Streptococcus thermophilus a Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus (Kristo a kol. 2003). Výše zmíněné bakterie existují v procesu výroby jogurtu v symbiotickém vztahu. Lactobacillus bulgaricus díky produkci exoproteináz a peptidáz degraduje mléčné proteiny až na aminokyseliny a peptidy, které jsou využívány S.thermophilus. Laktobacilus je tolerantní k nižším hodnotám ph a jeho růst je stimulován kyselinou mléčnou, mravenčí a oxidem uhličitým, jež jsou produkovány S.thermophilus. Po přibližně 3 hodinové fermentaci je počet obou organizmů vyrovnaný. Při delší fermentaci dochází k postupné inhibici růstu S.thermophilus, zatímco L.bulgaricus nadále produkuje kyselinu mléčnou. Výsledné ph jogurtů se pohybuje v rozmezí 3,7 4,3 (Ray 2000; Hattingh a Vilijoen 2001). 34

Obr. 6. Lactobacillus bulgaricus (Převzato z: https://betterknowamicrobe.tumblr.com/post/66384146274/lactobacillusdelbrueckii-subsp-bulgaricus, 24.4.2016). Obr. 7. Streptococcus thermophilus (Převzato z: http://zenkefir.blogspot.cz/2011/03/so-what-is-milk-kefir-part-2.html, 24.4.2016). 35

Primární úlohou mléčných bakterií však je převést laktózu, jakožto substrát, na kyselinu mléčnou. Laktóza je degradována enzymem β-galaktozidázou na glukózu a galaktózu. Glukóza a galaktóza jsou následně metabolizovány (Hattingh a Vilijoen 2001). Díky kyselině mléčné dochází ke srážení kaseinu a následné tvorbě gelovité struktury. Snížení ph zajišťuje delší trvanlivost výrobku, a to na 2-3 týdny. V České republice podmínky upravuje norma 77/2003 Sb., dle které musí jogurt obsahovat živé kultury v koncentraci minimálně 10 7 buněk v 1 gramu, a to po celou dobu použitelnosti. Fermentované mléčné výrobky tedy nemohou být konzervovány pomocí tepelných úprav, protože by došlo k zahubení organizmů (Dostálová a Kadlec 2014). Hlavní složky, které dodávají jogurtu specifickou chuť, jsou acetaldehyd, diacetyl a acetát. Acetaldehyd je produkován oběma přítomnými druhy bakterií. Streptokoky je produkován z glukózy skrze pyruvát, laktobacily jej produkují z threoninu, který je díky proteolytickým procesům přítomen v mléce (Ray 2000). CO2 Glukóza (Str.) Pyruvát Acetaldehyd Threonin (Lac.) Glycin Hlavní surovinou pro výrobu jogurtu je mléko, které je před inokulací upraveno. Nejprve je mechanicky přečištěno, následně je upraveno množství tuku a provedena deaerace a homogenizace. Teplota je upravena na 42 45 o C, což je ideální pro jogurtovou kulturu. Po inokulaci jogurtovými kulturami nastává inkubace, která probíhá 4-5 hodin. Po uplynutí této doby je směs ochlazena na 15-22 o C, čímž je zastaven růst bakterií. Poté je jogurt připraven k balení a exportu. Pokud se požaduje ochucený jogurt, přísady jsou přidány do jogurtu po fázi zchlazení (URL1). 36

7.1.2 Saké Saké, neboli rýžové víno, je tradiční alkoholický nápoj pocházející z Japonska. Je vyráběn z rýže pomocí fermentace. Hlavními organizmy při výrobě saké jsou Aspergillus oryzae, mléčné bakterie a Saccharomyces cerevisiae (Moriwaki a kol. 2010). Obr. 8 Aspergillus oryzae izolovaný z Koji (Převzato z: http://park.itc.u-tokyo.ac.jp/lab_microbiology/englishfile/libraryefile/ RIB40-E.html, 24.4.2016). S.cerevisiae jsou schopny využívat pouze jednoduché cukry, jako je glukóza. Rýže obsahuje škrob, což je složitý cukr, který kvasinky nedokáží zpracovat. Je proto důležité tyto složité cukry převést na jednoduché. To je zprostředkováno pomocí Aspergillus oryzae. Díky enzymům glukoamyláza a α-amyláza, jež jsou produkovány A.oryzae, dochází k uvolnění glukózy a k tvorbě oligosacharidů ze škrobu. Dušená rýže inokulována a fermentována A.oryzae s přítomnými enzymy se nazývá Koji. Následně dochází v tomto rýžovém rmutu díky přítomnost mléčných bakterií Leuconostoc mesenteroides a Lactobacillus sakei ke snížení ph, což vede k inhibici růstu nežádoucích mikroorganizmů. Kvasinky mají vyšší odolnost k nízkému ph a zůstávají aktivní. Produkovaná kyselina mléčná udává saké charakteristickou chuť. 37

Tato směs Koji a kvasinek, která má v Japonsku název Moto, je přesunuta do velkých tanků, kde probíhá hlavní fermentace, jež je nazývána Moromi (Kitagaki a Kitamoto 2013; Kodama a kol. 2002). Ranná fáze fermentace probíhá při teplotě 7-8 o C, což snižuje pravděpodobnost rozvoje nežádoucích mikroorganizmů. Následně je teplota zvýšena na 14-16 o C, čímž je usnadněna fermentace. Enzymatickou aktivitou aspergila je škrob převeden na glukózu, která je kvasinkami následně převedena na alkohol. Po 20-30 dnech fermentace je provedena filtrace, pasterizace při 65 o C po dobu 10 minut a zředění vodou na obsah alkoholu 15%. Produkt upravený těmito kroky je připraven ke konzumaci (Kitagaki a Kitamoto 2013). 7.2 Fermentovaná zelenina Produkce fermentované zeleniny a jiných potravin je založena na spontánním kvašení, nebo použití bakterií mléčného kvašení jako startéru, což vede k rychlému okyselení prostředí. Velkým přínosem je mikrobiologická stabilita a bezpečnost potraviny, zlepšení senzorických vlastností nebo pozitivní vliv na organizmus spotřebitele (Leroy a DeVuyst 2004). Bakterie mléčného kvašení jsou zodpovědné za fermentaci mnoha druhů zeleniny. Výběr startovacích kultur závisí na konkurenceschopnosti bakterií a přirozené mikroflóry a také na požadovaných senzorických vlastnostech výsledného produktu (Gardner a kol. 2001). Startovací kultura může být definována jako mikrobiální přípravek obsahující velké množství buněk alespoň jednoho druhu mikroorganizmu, který je přidáván k surovině za účelem urychlení procesu a kontroly nad fermentací při výrobě potraviny. Bakterie mléčného kvašení jsou používány nejčastěji, zejména pro jejich bezpečné a dlouholeté využívání při výrobě potravin (Leroy a DeVuyst 2004). 7.2.1 Kysané zelí Výroba kysaného zelí spočívá v postupném fermentačním procesu způsobeném homofermentativními a heterofermentativními mléčnými bakteriemi, především ze skupiny laktobacilů a pediokoků (Gardner a kol. 2001). 38

Proces fermentace zelí lze rozdělit do 4 fází dle aktivity dominujících mikroorganizmů. První fáze trvá přibližně tři dny, počínaje nasekáním, nasolením a uložením zelí do kvasné nádoby. Díky respirační aktivitě rostlinných buněk dochází k produkci CO2 a tepla. V důsledku osmotických změn a přítomnosti NaCl je z buněk uvolňována tekutina, která slouží jako prvotní médium pro mikroorganizmy. Vzhledem k přítomnosti kyslíku jsou v této fázi aktivní zejména aerobní mikroorganizmy (Halász a kol. 1999). Ve druhé fázi dochází snižováním obsahu kyslíku k rozvoji mikroaerofilních mikroorganizmů. Hlavním bakteriálním zástupcem je Leuconostoc mesenteroides. Glukóza a fruktóza je přeměněna na kyselinu mléčnou, octovou, etanol, manitol a CO2. Dochází k rychlému poklesu ph. Toto období trvá 3-6 dní. Během třetí fermentační fáze převažují homofermentativní mléčné bakterie. Dominantním mikroorganizmem však je fakultativně heterofermentativní Lactobacillus plantarum (Obr. 9). V průběhu fermentace koncentrace mléčné kyseliny stoupá až na 1,5-2 %. Tato koncentrace již inhibuje růst L.plantarum. Kvašení probíhá 4 až 6 dní (Gardner a kol. 2001). Ve čtvrté fázi stoupá koncentrace kyseliny mléčné až na hodnotu 2,5 % a ph se pohybuje v rozmezí 3,6-3,8. Převažují opět heterofermentativní rody mléčných bakterií jako je Lactobacillus brevis (Obr. 9), Pediococcus a Enterococcus. Koncentrace soli kysaného zelí se pohybuje v rozmezí 0,7 3,0 % (Halász a kol. 1999). 39

Obr. 9. Vývoj populací bakterií v kysaném zelí (Převzato a upraveno z: http://zkvaseno.blogspot.cz/2013/10/zeli.html, 26.4.2916). Charakteristická chuť kysaného zelí je dána vhodným poměrem kyseliny mléčné, octové, etanolu, oxidu uhličitého a diacetylu. Nežádoucí příchuť, měkká struktura nebo ztráta barvy zelí je způsobena plísněmi a kvasinkami při vystavení směsi vzduchu. Tvorba slizu v kysaném zelí je znakem přemnožení bakterií rodu Leuconostoc (Ray 2000). 7.3 Bakterie mléčného kvašení v pivovarnictví Pivo je alkoholický nápoj, který je připravován z obilních sladů, chmele a vody. Při jeho výrobě se využívá mikroorganizmů z rodu Saccharomyces. Uplatnění ve výrobě piva získaly díky schopnosti přeměnit zkvasitelné cukry na alkohol a oxid uhličitý za účasti enzymů (Kosař a Procházka 2000). Už po celá staletí je pivo považováno za nápoj s vysokou mikrobiologickou stabilitou, který je bezpečný pro konzumaci. Nepříznivé prostředí pro růst mikroorganizmů je způsobeno nízkým ph (3,8 4,7), nízkým obsahem kyslíku, přítomností etanolu, hořkých chmelových látek a oxidu uhličitého a pouze stopovým množstvím substrátu jako je glukóza a maltóza, které slouží jako zdroj uhlíku pro pivovarské kvasinky a jsou jimi spotřebovány při fermentaci (Sakamoto a Konings 2003). 40

Mikrobiální stabilita piva je zajištěna zejména přítomností izo-α-kyselin a jejich derivátů, které jsou obsaženy ve chmelu. Ty působí na cytoplazmatickou membránu grampozitivních bakterií a některých hub. Po vniknutí kyseliny do buňky dochází k její disociaci na protony a anionty. Přítomností protonů dochází ke snížení intracelulárního ph a následnému narušení procesu transmembránových přenosů. To v mnoha případech vede ke sníženému příjmu živin pro buňku (Matoulková a kol. 2012). 7.3.1 Negativní účinky bakterií na pivo Existuje řada mikroorganizmů, které způsobují kažení piva. Patří sem jak zástupci grampozitivních a gramnegativních bakterií, tak zástupci divokých kvasinek. Z řad grampozitivních bakterií se jedná zejména o rody Lactobacillus a Pediococcus, které patří do skupiny bakterií mléčného kvašení. V 70 % případů stojí za mikrobiálním kažením piva právě zástupci těchto rodů. Látky přítomné ve chmelu, které jsou účinné jako přirozený konzervant, působí pouze proti grampozitivním bakteriím. Pectinatus a Megasphaera jsou nejčastějšími zástupci gramnegativních bakterií, které jsou řazeny mezi závažné kontaminanty v pivovarnictví. Jedná se o anaerobní bakterie, které se v pivovarnickém průmyslu rozšířily díky moderním technologiím pro úpravu konečných produktů (ochranná atmosféra, nepřítomnost kyslíku) (Sakamoto a Konings 2003). 7.3.1.1 Mechanizmy rezistence I přes přítomnost izo-α-kyselin v pivě, dokáží některé kmeny mléčných bakterií těmto látkám odolávat. Tato rezistence je způsobena přítomností genů hora a horc, které se vyskytují pouze u mléčných bakterií schopných kazit pivo. Tyto geny kódují transmembránové proteiny (mají roli přenašečů), které vylučují izo-kyseliny ven z buňky a tím eliminují jejich antimikrobiální působení (Suzuki 2011, Hayashi a kol. 2001). Suzuki (2011) ve své práci také uvádí, že v přítomnosti baktericidních látek přítomných v pivě dochází ke zmenšení velikosti buňky bakterií, tedy i plochy, která je těmto antimikrobiálním látkám vystavena. Navíc dochází k efektivnějšímu nasazení obranných mechanizmů vázaných na membránu (transmembránové přenašeče), 41

a to díky úspoře energie vzhledem ke zmenšení velikosti buňky. Vzhledem k těmto okolnostem je pro buňku výhodné zmenšit velikost, pokud se nachází v prostředí s nepříznivými růstovými podmínkami. Obr. 10. Lactobacillus brevis AABBC45 (A) v prostředí piva, (B) v přirozeném prostředí (Suzuki 2011, upraveno). 7.3.2 Pozitivní účinky bakterií na pivo Bakterie mléčného kvašení nejsou z hlediska výroby piva pouze negativním faktorem. Mohou být využívány jako startovací kultury, jako bakterie produkující látky s inhibičními účinky na jiné mikroorganizmy, nebo dokonce jako přísada, která dodává pivu specifickou chuť. 7.3.2.1 Přirozená konzervace V obilovinách jsou často přítomny mykotoxiny, což jsou sekundární metabolity mikromycet. Některé mykotoxiny jsou spojovány s onemocněním zvířat i lidí. Během procesu výroby piva nedochází k jejich inaktivaci, a tudíž se mohou vyskytovat i ve finálních produktech. Bylo prokázáno, že bakterie mléčného kvašení omezují růst nejvýznamnějších toxigenních hub, čímž nepřímo snižují produkci mykotoxinů. Nejčastějšími kontaminanty piva z řad hub jsou zástupci rodu Fusarium (Lowe a Arendt 2004). 42

Bakterie mléčného kvašení jsou používány jako startovací kultury v procesu sladování. Díky produkci antimikrobiálních látek jako jsou bakteriociny, kyselina mléčná, peroxid vodíku aj., nedochází k růstu kontaminujících mikroorganizmů v průběhu výroby sladu. V důsledku toho dochází ke snížení viskozity a následně k rychlejší filtraci mladiny (Lowe a Arendt 2004). 7.3.2.2 Pivo Lambik Lambik se řadí ke speciálním pivům vyráběným spontánní fermentací. Výroba tohoto piva se provádí pouze v chladných měsících v okolí řeky Senne v Belgii. Fermentační proces není zahájen inokulací kvasinkami nebo startovací kulturou, ale dochází k ní spontánně při chlazení mladiny v otevřené nádobě (Obr. 11). Mladina je inokulována specifickými mikroorganizmy vyskytujícími se právě v okolí řeky Senne. Výsledným produktem je kyselé nesycené pivo, které dává základ pro Gueuze nebo ovocným pivům Lambik. Kyselý charakter piva je dosažen díky metabolické aktivitě bakterií mléčného kvašení, bakteriím octového kvašení a různým druhům kvasinek. Z řad bakterií mléčného kvašení byly z piva Lambik izolovány rody Pediococcus spp. a Lactobacillus spp (Spitaels a kol. 2014). Obr. 11. Mladina v otevřené kádi. Otevřenými okny prostupují mikroorganizmy, které zahajují spontánní fermentační proces. (Převzato z: http://www.homebrewtalk.com/showthread.php?t=147797, 21.4.2016). 43

7.4 Bakterie mléčného kvašení při výrobě vína Bakterie mléčného kvašení a kvasinky se přirozeně nachází na povrchu hroznů a v moštu během fermentačního procesu. Tyto bakterie mohou mít jak negativní, tak i pozitivní vliv na výsledný produkt (Batt a Tortorello 2014). V přirozené mikroflóře vyskytující se na hroznech je z řad kvasinek nejčastěji zastoupen druh Saccharomyces cerevisiae, Hanseniaspora uvarum, Kloeckera apiculata, Candida pulcherrima a z bakterií mléčného kvašení jsou to rody Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus a Oeonococcus. Častý je také výskyt rodů Acetobacter a Gluconobacter, které jsou řazeny do fyziologické skupiny bakterií octového kvašení (Bartowsky 2008). 7.4.1 Negativní účinky Bakterie mléčného kvašení mohou za určitých podmínek výrazně zlepšit kvalitu a stabilitu vína. Mohou ale způsobovat i kažení a znehodnocení vína. K znehodnocení může dojít během výroby nebo průběhu zrání vína v sudech, či lahvích. Ke kontaminaci nežádoucí mikroflórou dochází především na konci alkoholové fermentace, kdy jsou zejména heterofermentativní bakterie mléčného kvašení, které se podílí na malolaktické fermentaci, aktivovány příliš brzy, tedy během stále probíhající alkoholové fermentace. Po kontaminaci dochází k nežádoucí fermentaci uhlovodíků, především hexóz, které nebyly spotřebovány kvasinkami. Kromě etanolu a oxidu uhličitého, které vznikají jako produkty alkoholového kvašení kvasinek, vzniká kyselina octová a kyselina mléčná. Pokud koncentrace těchto kyselin překročí 1 g/l, je víno neprodejné (Funel 1999). Bylo také prokázáno, že heterofermentativní druhy Lactobacillus spp., Oenococcus oeni a Leuconostoc mesenteroides produkují látky, které udávají vínu chuť a zápach připomínající myší moč a víno se zakalí dohněda. Jde především o dusíkaté heterocyklické látky 2-ethyltetrahydropyridin, 2-acetyltetrahydropyridin a 2-acetyl-1-pyrolin (Costello a kol. 2001). Mezi časté kontaminanty vína patří i zástupci rodů Acetobacter a Gluconobacter. Produkují acetaldehyd, etylacetát a kyselinu octovou, což jsou látky, které mohou vínu dodávat nežádoucí aroma a chuť. Kyselina octová a acetaldehyd vznikají díky oxidativní metabolické dráze etanolu (Bartowsky 2008). 44

7.4.2 Pozitivní účinky Vinný mošt obsahuje vysokou koncentraci cukru a nízké ph. Toto prostředí je ideální pro růst a metabolickou aktivitu kvasinek, které využívají cukry jako substrát pro etanolové kvašení. S postupným vyčerpáváním cukerného substrátu a zvyšováním koncentrace alkoholu dochází ke snížení životaschopnosti kvasinek a k rozvoji růstu bakterií mléčného kvašení. Po skončení alkoholové fermentace dochází k malolaktické fermentaci (Funel 1999). Malolaktická fermentace je důležitou součástí výroby zejména červených vín. Během této fermentace dochází k přeměně části kyseliny jablečné na kyselinu mléčnou a oxid uhličitý. Tento proces vede k celkovému snížení kyselosti vína. Mezi bakterie mléčného kvašení provádějící tuto fermentaci jsou řazeny zástupci rodů Oenococcus, Leuconostoc, Lactobacillus a Pediococcus. Díky malolaktické fermentaci dostávají vína plnou a kulatou chuť (López a kol. 2007). Nejčastěji se vyskytujícím zástupcem bakterií mléčného kvašení v procesu malolaktické fermentace je druh Oenococcus oeni, a to díky jeho toleranci k vysoké koncentraci alkoholu a nízkému ph. Po fermentaci vinného moštu kvasinkami jsou vytvořené právě podmínky, které brání růstu jiných organizmů, pro které není toto prostředí vhodné. Obr. 12. Oenococcus oeni (Převzato z: http://www.digitaljournal.com/image/176609, 19.4.2016). 45