Spektrofotometr NANODROP ND-2000/2000c

Spektrofotometr NANODROP ND-2000/2000c Návod na obsluhu v 1.0 Obsah 1. Přehled... 2 2. Úvodní nastavení... 2 3. Provoz... 3 4. Společné funkce... 4 5. Nukleové kyseliny... 5 6. Čipy... 6 7. UV-VIS... 6 8. Protein A280... 6 9. Proteiny a Značky... 7 10. Stanovení bílkovin metodou BCA... 7 11. Stanovení bílkovin metodou podle Lowryho... 8 12. Stanovení bílkovin metodou podle Bradforda... 9 13. Stanovení bílkovin metodou Pierce 660nm... 10 14. Denzitometrie Stanovení růstu buněčných kultur... 10 15. Kinetika..12 16. Archivace a práce s daty... 12 17. Problémy... 12 18. Údržba a záruka... 13

1. Přehled Přístroj Nanodrop ND-2000/2000c představuje širokospektrální spektrofotometr (190-840 nm měřící vzorky o objemu 0,5-2 ul s vysokou přesností a reprodukovatelností. Rovněž je k dispozici tradiční kyveta pro kinetická měření. V provozu se pipetuje vzorek na konec spodního optického vlákna. Potom, co se do kontaktu s tímto spodním vláknem dostane konec vlákna horního, dojde působením kapilarity ke vzniku sloupce tekutiny. Následně dojde k proměření absorbance prostřednictvím CCD pole a softwarovému zpracování hodnot. Tímto způsobem je možné měřit až 200krát vyšší koncentrace než pomocí tradiční kyvety. Přístroj Nanodrop ND-2000/2000c je ideální pro měření: + koncentrace a čistoty nukleových kyselin + fluorescenčního značení DNA a RNA čipů + koncentrace bílkovin + fluorescenčně značených bílkovin, konjugátů a metaloproteinů + bílkovin pomocí BCA, Lowryho, Bradforda nebo metodou Pierce 660 + denzitometrická stanovení + UV_VIS spekter 2. Úvodní nastavení Software NANODROP funguje pouze na IBM PC kompatibilních počítačích s těmito minimálními vlastnostmi: MS Windows XP, Vista, Win7 a Win8 1,5 GHz CD ROM 1GB RAM (2GB pokud pod Vistou) 40 MB na pevném disku USB port Instalace Software je nutné nainstalovat před připojením přístroje. Při jeho instalaci se řiďte pokyny na obrazovce počítače, které Vás instalací vedou. Potom připojte zdroj energie a propojte USB kabel. Opět proběhne instalace ovladačů, při které se řiďte pokyny na obrazovce. Síťový zdroj zůstává zapojen trvale, spotřeba představuje asi 5W. Registrace Prosím registrujte se na www.nanodrop.com. Rádi Vás budeme informovat o novinkách v souvislosti s Vaším přístrojem. Stránka 2 z 13

3. Provoz Na straně 1-1 až 1-3 originálního manuálu je graficky zobrazeno fungování přístroje, které je popsáno výše. Po ukončení každého měření běžně postačuje otřít obě ramena buničinou. Po proměření většího množství vzorků ovšem doporučujeme otřít i povrch přístroje kolem ramen. Po posledním měření rovněž doporučujeme otřít povrchy neionizovanou vodou. Pokud je nutná dekontaminace povrchů je možné ji provést například 0,5% roztokem chlornanu sodného nebo jinými přípravky (viz dále). U bílkovin a roztoků obsahujících surfaktanty může dojít k tomu, že u maloobjemových vzorků 1ul se objeví problémy s vytvářením sloupce mezi rameny. Řešením je otřít povrch obou ramen 30-40x pomoci buničiny. Vlastnosti povrchů se opět upraví a sloupec se bude vytvářet bez problémů. Pokud ve výjimečných případech problém přetrvává i dále, řešením je použití nekonstitučního přípravku PR-1. Problematické může být měření u nehomogenních roztoků nukleových kyselin. Příkladem jsou genomická DNA, fágová DNA a viskózní roztoky dalších nukleových kyselin. Řešením je zahřátí vzorků na 55 C a intenzivní protřepání (vortexing). Běžně nedochází v průběhu měření k takové míře odpařování, která by měření ovlivnila. U vysoce těkavých rozpouštědel, jako je hexan, může v průběhu měření dojít k odpaření vzorku. Úspěšně lze používat méně těkavá rozpouštědla, jako např. DMSO. V případě potřeby lze vzorek opět odsát z povrchu ramen pomocí pipety. Aplikační moduly Software Nanodrop umožňuje řadu režimů, které byly připraveny pro potřeby laboratorních pracovníků. Budou probrány postupně. V úvodním menu najdete volbu Home, která umožňuje nastavení metod dostupných pro každého uživatele. Základní nastavení je Classic Modul My Data umožňuje ukládání dat a archivaci Diagnostics Diagnostické menu Options - individualizace správy a ukládání dat Po otevření konkrétní aplikace se objevi volby: Stránka 3 z 13

Reports Report, Configuration a Print, volby, které zobrazují naměřená data, umožňují určení jejich formátu a následný tisk. U metod zaměřených na nukleové kyseliny je zde rovněž volba Oligo Calc umožňující různé výpočty. Volba Dye/Chromophore Editor Je možné vkládat optické vlastnosti fluorescenčních barev. 4. Společné funkce Na začátku každé série měření pomocí Add to Report určíte, kam se budou ukládat data: Před vlastním měřením MEASURE je nutné provést stanovení nulové hodnoty BLANK 1. Vložte vzorek vody (nebo jiného nosného roztoku) 2. Stiskněte BLANK 3. Otřete ramena 4. Proměřte alikvot nulového roztoku, jako by se jednalo o vzorek. Výsledná čára by se měla pohybovat přibližně okolo nulové hodnoty s menší odchylkou než 0,04A. Volba REBLANK určí novou nulovou hodnotu, která je potom použita v dalších výpočtech. Doporučujeme cca po každých 30 minutách měření provést nové stanovení nulové hodnoty. Na levé straně obrazovky se dále objeví roleta File s volbami: New Workbook, Close Workbook and go Home, Print Report, Use Current Settings as Default E-mail current workbook Na obrazovce se rovněž vlevo objeví možnosti: Add to Report - určí, zda naměřená data mají být uložena do aktuální tabulky. Přestože veškerá data jsou archivována, je často vhodná tato volba, která zrychlí práci s daty. Overlay Spectra Small sample volume- (pouze u nukleových kyselin a aplikace Protein A280)- umožňuje použití pouze 0,5ul tehdy, když vzorky mají 10mm absorbanci vyšší nez 3,0 (tj. více než 150ng/ul dsdna) Stránka 4 z 13

U modelu 2000c volba Use Cuvette Pathlength Stir speed rychlost míchání Heat to 37C ohřátí na tuto teplotu může trvat až 10 minut Vpravo je potom možnost voleb: Group drop-down box nastaveno klasické menu Nanodrop Predefined Application Buttons User-Defined List Dále popíšeme stručně měření jednotlivých typů biomolekul: 5. Nukleové kyseliny V modulu Nucleic Acids lze bez problémů měřit koncentraci a kvalitu nukleových kyselin. Zkušenosti ukazují, že pro měření postačuje 1ul vzorku u vodných vzorků. Pokud si ovšem nejste jisti přesností pipety nebo charakterem vzorku je vhodnější použít objem 1,5 2ul. U koncentrovaných vzorků je možné použít i objem 0,5ul (viz dříve) Přístroj bude přesně měřit dsdna až do koncentrace 15000 ng/ul, Typy vzorků Roleta rozlišuje mezi DNA-50 pro dsdna, RNA-40 pro RNA a ssdna-33 pro ssdna a oligo DNA pripadne oligo RNA. Volba Custom umožňuje volbou konstanty mezi 15 a 150 a tím definici vlastního typu molekuly. 260/280 poměr absorbancí vzorku při těchto vlnových délkách. Určuje čistotu vzorku, poměr cca 1,8 je považován za čistou DNA, poměr 2,0 za čistou RNA. Nižší hodnota v obou případech indikuje znečištění vzorku. 260/230 podobný význam jako výše uvedený poměr. Čisté nukleové kyseliny mají tento poměr mezi 1,8 a 2,2. Stránka 5 z 13

ng/ul koncentrace vzorku vypočtená na bázi absorbance při 260nm a zvolené analytické konstantě. Baseline correction Nulová hodnota je automaticky nastavena na hodnotu absorbance vzorku při 340nm. Overlay spectra Zde je možné nastavit postupné zobrazování jednotlivých křivek na jedné obrazovce. 6. Čipy Spektrofotometr ND-2000 měří absorbanci fluorescenční barvy v genové sondě až do koncentrace barvy na úrovni 0,1pikomol na mikrolitr. Do systému jsou vloženy vlastnosti nejčastěji používaných fluoroforů. Další je možné doplnit pomoci Dye/Chromophore Editor. 7. UV-VIS V tomto režimu Funguje Nanodrop ND-2000/2000c jako běžný spektrofotometr. Na obrazovce se objeví absorbance vzorku od 190nm do 840nm a kurzory dovolují proměření individuálních hodnot. Lze určit až 40 vlnových délek pro sledování absorbance a vložení do sestavy Baseline correction Add wavelength Clear wavelength Clear all. Ostatní parametry podobné jako u předchozích režimů. 8. Protein A280 Proteiny, na rozdíl od nukleových kyselin mají odlišné vlastnosti. Tato metoda je vhodná pro purifikované bílkoviny obsahující tryptofan, tyrosin nebo disulfidicke Cys-Cys můstky, které vykazují absorbanci při 280nm. U měření bílkovin doporučujeme použit velikost vzorku 2 ul. Přístroj bude exaktně měřit koncentraci bílkovin (BSA) až do 400mg/ml (BSA) bez ředění. Spodní detekční limit je u BSA 0,10mg/ml. Stránka 6 z 13

Typ vzorku (Sample Type) V systému je předdefinováno několik typů vzorků - Obecný, kde absorbance při 280nm je pro roztok 1 mg/ml roven 1,0 - Bovinní sérový albumin - IgG - Lysozym - Uživatel může vložit svoje hodnoty 1/Mcm a MW 9. Proteiny a Značky Tento modul lze použít pro stanovení koncentrace bílkovin i fluorescenčních barev (konjugáty pro proteinové čipy), případně pro měření čistoty metaloproteinů (např. hemoglobinu). Jednotlivé volby jsou totožné s údaji v části 5. Čipy a 6. Bílkoviny. Navíc jsou zde volby určující uživatelem definovanou vlnovou délku lambda 3. 10. Stanovení bílkovin metodou BCA Tato metoda je často používána pro stanovení bílkovin ve zředěných roztocích a za přítomnosti sloučenin, které rovněž absorbují při 280nm. Nutností je vytvoření kalibrační křivky pro každou sadu stanovení. Výsledný chelát Cu-BCA vytvořený za přítomnosti bílkoviny je měřen při svém absorpčním maximu 562nm a normalizován na absorbanci při 750nm. Kity pro toto stanovení jsou k dispozici od řady dodavatelů, dodržujte při provádění jejich návod k použití. Pro měření bílkovin doporučujeme objem vzorku 2ul. Na tomto přístroji lze pomocí standardní BCA reakce měřit koncentrace v rozsahu 0,20 mg/ml do 8,0 mg/ml. Stanovení Mini BCA pokrývá rozsah od 0,01-0,20mg/ml. Zde doporučujeme minimální velikost vzorku 4 ul. Volby na obrazovce Standard Curve Tab kdykoliv zobrazí kalibrační křivku, signalizuje rovněž, že počet proměřených bodů je validní Data Tab Samples Radio Button Standards Radio Button - v obou případech vkládání popisů a koncentrací Stránka 7 z 13

Měření Doporučujeme provádět pro každou sadu měření vždy novou kalibraci. Vlastní měření se skládá ze 3 kroků: 1. Stanovení nuly /Reference reagens BCA/ 2. Kalibrace je třeba měřit minimálně 1 standardní hodnotu a nulu nebo 2 standardní hodnoty. Každou hodnotu lze měřit až pětkrát. 3. Jakmile existuje kalibrační křivka, červený ukazatel se změní na zelený a lze začít měřit vzorky Měřené hodnoty se musí nacházet uvnitř rozsahu daného kalibrační křivkou. 11. Stanovení bílkovin metodou podle Lowryho Tato metoda je rovněž často používána pro stanovení bílkovin. I zde je nutností vytvoření kalibrační křivky pro každou sadu stanovení. Výsledný chelát vytvořený za přítomnosti bílkoviny je měřen při svém absorpčním maximu 650nm a normalizován na absorbanci při 405nm. Kity pro toto stanovení jsou k dispozici od řady dodavatelů, dodržujte při provádění jejich návod k použití. Pro měření bílkovin doporučujeme objem vzorku 2ul. Na tomto přístroji lze pomocí Modifikované Lowryho reakce měřit koncentrace v rozsahu 0,20mg/ml až 8,0mg/ml. Volby na obrazovce Standard Curve Tab kdykoliv zobrazí kalibrační křivku, signalizuje rovněž, že počet proměřených bodů je validní Data Tab Samples Radio Button Standards Radio Button - v obou případech vkládání popisů a koncentrací Měření Doporučujeme provádět pro každou sadu měření vždy novou kalibraci. Vlastní měření se skládá ze 3 kroků 1. Stanovení nuly /Reference Lowryho reagens/ 2. Kalibrace je třeba měřit minimálně 1 standardní hodnotu a nuly nebo 2 standardní hodnoty. Každou hodnotu lze měřit až pětkrát. Stránka 8 z 13

3. Jakmile existuje kalibrační křivka, červený ukazatel se změní na zelený a lze začít měřit vzorky. Měřené hodnoty se musí nacházet uvnitř rozsahu daného kalibrační křivkou. 12. Stanovení bílkovin metodou podle Bradforda Tato metoda je často používána pro stanovení bílkovin ve velmi zředěných roztocích a za přítomnosti sloučenin, které rovněž absorbují při 280nm. Nutností je vytvoření kalibrační křivky pro každou sadu stanovení. Metoda využívá změnu absorbance barviva Coomassie Blue za přítomnosti bílkoviny. Kity pro toto stanovení jsou k dispozici od řady dodavatelů, dodržujte při provádění jejich návod k použití. Pro měření bílkovin doporučujeme objem vzorku 2ul. Na tomto přístroji lze pomocí standardní metody měřit koncentrace od 100ug/ml do několika tisíc ug/ml, nejlepší linearita je v rozsahu 100-1000ug/ml. Mini stanovení podle Bradforda funguje v rozsahu přibližně 15-125ug/ml. Vzhledem k omezeným signálům získávaným v těchto stanoveních doporučujeme provádění všech stanovení v triplikátu. Volby na obrazovce Standard Curve Tab kdykoliv zobrazí kalibrační křivku, signalizuje rovněž, že počet promeřených bodů je validní Data Tab Samples Radio Button Standards Radio Button - v obou případech vkládání popisů a koncentrací Měření Doporučujeme provádět pro každou sadu měření vždy novou kalibraci. Vlastní měření se skládá ze 3 kroků 1. Stanovení nuly /Reference Bradfordovo reagens/ 2. Kalibrace je třeba měřit minimálně 1 standardní hodnotu a nuly nebo 2 standardní hodnoty. Každou hodnotu lze měřit až pětkrát. 3. Jakmile existuje kalibrační křivka, červený ukazatel se změní na zelený a lze začít měřit vzorky Měřené hodnoty se musí nacházet uvnitř rozsahu daného kalibrační křivkou. Stránka 9 z 13

13. Stanovení bílkovin metodou Pierce 660nm Tato metoda je často používána pro stanovení bílkovin ve velmi zředěných roztocích obsahujících redukční činidla a/nebo detergenty Pro měření bílkovin doporučujeme objem vzorku 4ul. Volby na obrazovce Standard Curve Tab kdykoliv zobrazí kalibrační křivku, signalizuje rovněž, že počet promeřených bodů je validní Data Tab Samples Radio Button Standards Radio Button - v obou případech vkládání popisů a koncentrací Měření Doporučujeme provádět pro každou sadu měření vždy novou kalibraci. Vlastní měření se skládá ze 3 kroků 4. Stanovení nuly /Reference Pierce Reagens 5. Kalibrace je třeba měřit minimálně 1 standardní hodnotu a nuly nebo 2 standardní hodnoty. Každou hodnotu lze měřit až pětkrát. 6. Jakmile existuje kalibrační křivka, červený ukazatel se změní na zelený a lze začít měřit vzorky Měřené hodnoty se musí nacházet uvnitř rozsahu daného kalibrační křivkou. 14. Denzitometrie Stanovení růstu buněčných kultur Denzitometrická stanovení patří ke standardním metodikám prováděným na spektrofotometrech. Při použití přístroje Nanodrop ND-2000/2000c k tomuto účelu je nutné vzít do úvahy podstatně kratší optickou dráhu než u standardních spektrofotometrů. Opět platí, že velikost vzorku 1ul je ve většině případů postačující, doporučujeme ovšem objem 2ul. Vzhledem ke svému charakteru může Nanodrop ND-2000/2000c měřit až 10x hustší suspenze než klasické přístroje. U velmi zředěných vzorků lze měřit (podle zobrazeného spektra) při jiném maximu než 600nm. Prvky na obrazovce 600 nm Absorbance Stránka 10 z 13

User cursor (nm) určuje uživatel posouváním kurzoru Absorbance correction- posouváním kurzoru lze určit základnu, vůči které budou hodnoty normalizovány User Cursor (Abs) používá se pro změnu rozsahu na ose y. Je nutné zajistit homogenitu vzorku, zvláště u vzorků hodně koncentrovaných. Pokud je nutná dekontaminace ramen, potom je to možné provést například ředěným roztokem chlornanu sodného (SAVO). 15. Kinetika Přístroj Nanodrop 2000c lze použít pro kinetická měření v čase. Pro vytváření vhodných protokolů použijte aplikaci Kinetics Editor. Vytvořené metody je možné ukládat. Kinetická měření lze provádět pouze v měřící kyvetě. Na levé straně obrazovky se objeví volby New vytvoří nový protokol Save Measure- Delete- Dále se zde nacházejí dvě rolety Group list A Method list otevře skupinu protokolů otevře zvolený protokol Vlastní protokol je potom definován pomocí voleb na pravé straně obrazovky Measure Stage definuje jednotlivé intervaly měření Wavelengths to Monitor vlnové délky Instrument setting určení rozsahu vlnových délek, při kterých bude stroj pracovat Na obrazovce kinetického režimu se objeví dva grafy - hodnoty absorbance při všech zvolených vlnových délkách - spektrální hodnoty každého provedeného měření Je možné provést i výpočet kinetických vektorů rychlosti pro každý zvolený bod měření. Stránka 11 z 13

16. Archivace a práce s daty Každé měření je archivováno v souboru, který je značen podle prováděné metodiky a data, např. Nucleic Acid 2005 11 07.twbk. Data lze reformátovat, editovat, ukládat pod jiným označením. Z údajů lze opětovně vytvořit spektrální křivku. Data jsou ukládána na adrese XP C:\Documents and Settings\All users\shared Documents\Thermo\NanoDrop 2000\Autosave\ nebo Vista C:\Users\Public\Public Documents\Thermo\ Autosave Data and Account Management Jedná se o užitečný program, který umožňuje uživateli upravovat formáty výstupů, importovat uložená data a přepočítávat data získaná z přístroje Nanodrop. S daty se dá pracovat i bez připojeného přístroje ND-2000. Tento blok se věnuje Sestavám a Správě uživatelských účtů. Všechny mají společné tyto charakteristiky: Configuration určení konfigurace stránky Report která data se mají dostat do výstupní sestavy Print - tisk Save Window uložení jako.jpg Import zabývá se importem dat, Export Report,Excel XML Spreadsheet Report,Tab Separated Values Spectrum, Excel XML Spreadsheet Spectrum, Tab Separated Values Spectra, New Workbook ND legacy Accounts Allow Access To Určuje pravomoci jednotlivým uživatelům 17. Problémy V této části je popsáno řešení možných problémů. Jedná se o řešení poměrně triviálních problémů v USB komunikaci, kde hlavní je zajistit mechanické spojení PC a přístroje, jinak je třeba použít utilit podle v manuálu popsaného postupu. U ostatních potenciálních závad doporučujeme obrátit se na Vašeho distributora nebo přímo na společnost Nanodrop. Stránka 12 z 13

18. Údržba a záruka Čištění Základním požadavkem je udržení čistoty ramen přístroje. Po dokončení každého měření setřete vzorek z horního i dolního ramene. Rovněž doporučujeme, abyste po dokončení každého bloku měření otřeli obě ramena neionizovanou vodou. Postupujte přitom následovně: + Aplikujte 5 ul vody na spodní rameno + Mechanicky vytvořte pomocí horního ramene sloupec, nechte ho cca 2-3 minuty působit + Otřete vodu z obou ramen čistou buničinou Poznámka dh20 běžně stačí na čištění, v případech například zaschlých bílkovin doporučujeme použít 0,5M HCl s následným použitím 5ul H20 na odstranění případné reziduální HCl. Nepoužívejte pro aplikaci vody nebo roztoku Sava střičku. Kalibrace Obecně není nutná jakákoliv kalibrace uživatelem, přesnost se podle zkušeností nemění ani po několika letech provozu. Přesto doporučujeme každých 6 měsíců provést kontrolu kalibrace. Postup této kalibrace lze stáhnout z www.nanodrop.com. Náhradní díly Obecně platí, že jediný díl, který by mohl vyžadovat výměnu je xenonová výbojka. Vydrží cca 30 000 stanovení, potom je nutná výměna. Záruka Společnost Nanodrop poskytuje záruku na díly i práci po dobu jednoho roku od data zakoupení. Kompatibilita s rozpouštědly Spektrofotometr je kompatibilní s většinou rozpouštědel používaných v biomedicínské laboratoři. Tyto zahrnují metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, acetone, eter, chloroform, CCl4, DMSO, DMF, Acetonitril, THF, toluen, hexan, benzen, NaOH, chlornan sodný, ředěnou HCl, ředěnou HNO3, ředěnou kyselina octová Přístroj není kompatibilní s veškerými formami kyseliny fluorovodíkové (HF). Stránka 13 z 13