1 Bílkoviny - představují cca. ½ suché hmotnosti buňky - molekuly bílkovin se podílí na všech základních životních procesech - součástmi buněčných struktur (stavební f-ce) Funkce bílkovin: strukturní (součástmi buněčných struktur) metabolická (realizují b. metabolizmus) informační (jako signály či receptory signálů) vedle toho základní komponentou všech tří hlavních principů funkční organizace buňky (paměťového, membránového, cytoskeletárního) a) Primární struktura bílkovinné molekuly Stavební jednotkou (monomerem) bílkoviny (proteinu): - aminokyseliny (AK, AA) zastoupení jednotlivých druhů AK v molekule a jejich sled ozn. jako primární strukturu bílkovin
2 Příklad: -158-Cys-Glu-Val-Phe-Val-Met-Pro-Arg-Ala-169- (CEVFVMPRA) AMINOKYSELINY - odvozeny od organických kyselin, na α-uhlík je navázána aminová skupina (NH 2 ) α-uhlík (2. uhlík) AK skládající bílkoviny převážně - a- aminokyseliny a vždy z L- řady (jen ve stěnových peptidech někt. bakterií nalezeny i D-aminokyseliny)
3 STRUKTURA PEPTIDOVÉHO ŘETĚZCE AK v molekule bílkovin navzájem pospojovány peptidovou vazbou (spojuje se aminoskupina 2. uhlíku jedné AK s karboxylovou skupinou sousední AK a odštěpuje se molekula vody tj. polykondenzace) Pospojováním více AK (řetězením) vzniká peptidový řetězec
4 AMINOKYSELINOVÉ SLOŽENÍ BÍLKOVIN Zastoupení různých AK v molekule bílkoviny lze snadno zjistit po hydrolýze bílkoviny určením jejich počtu (obvykle %). Složení je charakteristické pro každý druh bílkoviny. O vlastnostech bílkoviny rozhoduje charakter postranních řetězců AK (z fyzikálně-chemického hlediska: kyselé, bazické, polární a nepolární). kyselé bílkoviny s hojným zastoupením dikarboxylových kyselin, např. Asp. Glu (-COOH skupina na postranních řetězcích) zásadité (bazické) bílkoviny - s četnými diaminokyselinami, např. Arg, Lys, His (-NH 2 skupina na postranních řetězcích)
Některé AK zakončené na postranních řetězcích hydrofobními skupinami, např. -CH3, jsou-li v převaze, určují hydrofobní charakter bílkovinné molekuly X Přítomnost AK s hydrofilními skupinami, např. COOH, -OH určují při převaze hydrofilní (polární) bílkovinné molekuly 5 Souhrn (ke složení): zastoupení různých AK určuje fyzikální vlastnosti bílkovinné molekuly, které jsou jedním z důležitých faktorů pro funkci bílkoviny v buňce.
6 SEKVENCE AMINOKYSELIN Vlastnosti určité bílkoviny nejsou určeny pouze AK složením, ale i jejich pořadím, sekvencí, v peptidovém řetězci. Určování skutečných sekvencí AK v bílkovinách, tzv. sekvenování bylo dříve velmi obtížné (F. Sanger, 1953 struktura molekuly inzulínu). Dnes se primární struktura bílkovin odvozuje nepřímo podle sekvence nukleotidů DNA, které je kódují (sekvenování DNA je metodicky jednodušší). Známa úplná AK sekvence několik tisíc bílkovin databáze Souhrn (k prim. struktuře): Primární struktura bílkoviny určuje vlastnosti celé molekuly, tedy i její biologickou funkci. Primární struktura proto musí být velmi přesně určena (informace pro ni je v genetické paměti buňky). Ze srovnání sekvencí bílkovin je možno vyvozovat závěry i o evoluční příbuznosti různých bílkovin b) Sekundární a terciární struktura bílkovinné molekuly krátké polypetidové řetězce (několik desítek AK) peptidy nebo oligopeptidy (podle počtu AK: tri-, okta-, dekapeptidy..) Oligopeptidy mají důležité biologické funkce, zejména regulační (např. některé hormony) nebo součástí složitějších makromolekul (např. mureinu peptidoglykan, jež je součástí b. stěny bakterií
7 Bílkoviny (proteiny) sem řazeny látky s polypeptidovým řetězcem až z většího počtu AK (několika set). M.h. 10 4-5.10 4 (10-50 kilodaltonů - kd) (pro srovnání: průměrná m.h. 1 zbytku AK je asi 110 Daltonů ) polypeptidový řetězec je značně dlouhý až 3 µm Bílkoviny s ±nataženým polypeptidovým řetězcem, vytváří jakési vlákno - Fibrilární bílkoviny Většina buněčných bílkovin však vytváří molekuly, jejíchž tvar se blíží sférickým útvarům - Globulární bílkoviny Mnoho vazeb v dlouhém polypeptidovém řetězci umožňuje volnou rotaci atomů velká flexibilita tvaru. Tvar, který řetězec v prostoru zaujímá konformace proteinu
8 Konformace proteinu - není náhodná, je určována silami, které působí uvnitř molekul. Na druhé straně rozložení interakcí vyplývá ze sekvence AK, tj. primární struktura bílkovin určuje i konformaci molekuly. Jestliže tuto konformaci nějakými silami změníme (molekulu denaturujeme), po působení sil se vrátí do původního stavu V konformaci různých proteinů byly nalezeny určité strukturní pravidelnosti, které se označují jako α-helix a β-struktura a-helix řetězec vytváří šroubovicové uspořádání Stabilizováno vodíkovými můstky mezi nad sebou ležícími peptidovými vazbami. U globulárních proteinů zaujímají α- helikální uspořádání některé úseky polypeptidového řetězce. Některé fibrilární proteiny (např. keratin) jen tuto konformaci.
9 b-struktura (β-skládaný list) probíhají úseky řetězce paralelně vedle sebe. Struktura stabilizována H můstky mezi sousedícími ( přiloženými ) úseky. Pouze některé proteiny mají tuto strukturu (např. fibroin z přírodního hedvábí). X Běžná u globulárních bílkovin (většinou se však kombinuje s úseky s α-helikální strukturou Tato uspořádání polypeptidového řetězce ozn. jako sekundární struktura
10 Konečnou strukturu molekuly bílkoviny, tj. prostorové uspořádání celého řetězce, ozn. jako terciární strukturu. Evolučně příbuzné proteiny (tzv. rodiny proteinů) velkou podobnost v terciární struktuře. Např. serinové proteázy (proteolytické enzymy jako chymotrypsin, trypsin a elastáza) až ze 40 %. Srovnávací biochemie proteinů tak naznačuje jejich evoluční vývoj, a tím i jejich biologickou účelnost.
11 Nevratná změna - ozn. nevratná denaturace X reverzibilní denaturace (vratná), která je důležitým mechanizmem regulace biologické funkce proteinu. Většina funkcí bílkovin vyplývá přímo z jejich terciární konformace. c) Podjednotkové bílkoviny Některé bílkoviny složeny z většího počtu menších molekul (více polypeptidových řetězců podjednotek, protomer) navzájem vázány nekovalentními vazbami. Tyto proteiny ozn. podjednotkové (oligomerní) podle počtu podjednotek dimerní (2), tetramerní (4) Podjednotky buď zcela identické, nebo různé (např. homodimery, heterodimery). Vzájemné prostorové uspořádání podjednotek kvarterní struktura bílkovin Př. Transportní bílkoviny membrán - 2 subj., myoglobin - 4 subj., imunoglobuliny - 4 subj. a jejich násobky, některé dehydrogenázy tvořeny až 16 subjednotkami, kapsidy virů (desítky až stovky identických subjednotek) Shrnutí: Biologická aktivita polymerních bílkovin je determinována jejich kvarterní konformací. Regulovaná změna kvarterní struktury je tedy cestou k regulaci jejich aktivity.
12 d) Funkce bílkovin v buňce Bílkoviny se podílí na všech základních životních procesech (funkce: strukturní, metabolické, informační). Mnohé bílkoviny bifunkční či polyfunkční Př. Některé proteiny jsou strukturálními komponentami biomembrány a současně mají enzymovou f-ci (membránové ATPázy) nebo f-ci transportní (transportní proteiny). Membránové imunoglobuliny imunocytů jsou stavební součástí membrány a současně plní f-ci signální - rozpoznávají své antigeny. Specifická f-ce bílkoviny vždy dána terciární (či kvarterní) strukturou. Každá interakce bílkoviny s jinou molekulou (procesy morfogenní, enzymové, informační) předpoklad na povrchu molekuly bílkoviny existuje specificky uspořádané vazebné či rekogniční místo, na něž se váže liganda (molekula vážící se na vazebné místo) vazebné místo fl liganda Specifita rozpoznávacího místa vůči ligandě - zpravidla dána prostorovou konformací několika či několika desítek AK (postranních řetězců). Specifická funkce bílkovin spočívá ve schopnosti rozeznat s jakou molekulou mají reagovat (primární struktura neomezené možnosti rozpoznání)
13 STAVEBNÍ BÍLKOVINY Součástí buněčných struktur (stavebními kameny) - prakticky všech b. struktur (př. komponenty cytoskeletu, bičíky tvořeny výlučně bílkovinami). Jinde spojeny s jinými biopolymery či jinými látkami: (např. v eukaryotických chromozomech a ribosomech agregace s NK, v biomembránach s fosfolipidy, v buněčných stěnách či extracelulární matrix s molekulami polysacharidů Vznik složitějších struktur z jednotlivých strukturních proteinů: pomocí vazebných míst 2 stejné molekuly (každá 1vazebné místo) dimer více molekul (každá 2 vazebná místa) řetězce
14 Nadmolekulární struktura vzniká samovolně! (nepotřebuje informaci a zpravidla ani energii) Tyto morfogenní procesy - autoorganizační (autoagregační) Informace pro specifické uspořádání podjednotek (strukturních monomerů) je obsažena již ve struktuře molekuly (vazebného místa)
15 Jiný příklad autoagregace bakteriálních bičíků (globulární bílkovina flagelin) Totéž i při tvorbě nadmolekulárních komplexů s jinými molekulami (reagregace ribosomů)
16
17 ENZYMOVÉ BÍLKOVINY Jednou z nejdůležitější funkcí proteinů je enzymová katalýza (téměř všechny reakce v buňce jsou enzymové!) Význam enzymové katalýzy: 1. enzymy urychlují průběh chemických reakcí (o několik řádů) 2. umožňují průběh i těch reakcí, které by za daných podmínek vůbec probíhat nemohly (př. v rozmezí biokinetických teplot) 3. specifita katalýzy určuje, které z možných chemických reakcí skutečně probíhat budou 4. reakce lze velmi přesně regulovat zásahem do katalytické aktivity enzymů (zpravidla reverzibilní změnou konformace molekuly enzymu) 5. díky tomu, že všechny enzymy jsou bílkoviny, umožněno řízení enzymového vybavení vnitřní pamětí buňky (genetickou informací) cestou transkripce a translace
18 K syntéze/rozkladu určité molekuly obvykle nestačí jedna enzymová reakce. Postupnou přeměnu substrátu v konečný produkt ozn. jako metabolickou dráhu V ní jsou za sebou spojeny různé enzymy, které katalyzují jednotlivé chemické reakce v přesném sledu (produkt první reakce se okamžitě stává substrátem pro druhý enzym, jeho produkt pro třetí enzym atd.). Z enzymové kinetiky celé této soustavy je velmi výhodné, jestliže všechny enzymy vytváří tzv. enzymový komplex. V něm jsou navzájem spojeny (např. zakotveny v daném sledu na pevnou strukturu nejčastěji biomembrány, např. enzymy dýchacího řetězce v mitochondriích). Pro energetické přenosy v buňce mají mimořádný význam enzymy, které štěpí makroergické fosfátové vazby (kovalentní s vysokým obsahem energie, ~ P) Makroergní fosfátové vazby ~ P Rozštěpením jedné makroergní vazby se uvolní energie kolem 30kJ. Nejčastějšími organickými fosfáty s makroerg. vazbou - nukleozidtrifosfáty. Z nich nejdůležitější je adenozintrifosfát (ATP).
19 ATP nukleotid složený z: adeninu ribózy tří zbytků kyseliny fosforečné adenin- ribóza-p~p~p Makroergní vazby jsou mezi 1. a 2. a mezi 2. a 3. zbytkem kyseliny fosforečné Analogicky: guanozintrifosfát (GTP) uridintrifosfát (UTP) Pro energetické přenosy v buňce je nejdůležitější hydrolýza trifosfátů na difosfáty nebo naopak vazba posledního zbytku kyseliny fosforečné ATP + H 2 O «ADP + H 3 PO 4 Štěpení ATP na ADP katalyzováno enzymem adenozintrifosfatázou (ATPázou). Bílkovin s ATPázovou aktivitou je v buňce velké množství (ATPázy, obdobně GTPázy).
20 Významnou roli v regulaci aktivity proteinů (nejenom enzymových) hraje kovalentní připojení fosfátové skupiny na některý z postranních řetězců molekuly fosforylace způsobí výraznou konformační změnu. Defosforylací se obnovuje původní stav. Fosforylaci uskutečňují proteinkinázy (PK), defosforylaci pak proteinfosfatázy. Shrnutí: Aktivita PK a proteinfosfatáz představuje klíčové nástroje vnitrobuněčné signalizace, jejichž důležitým článkem jsou i GTPázy
21 INFORMAČNÍ BÍLKOVINY Bílkoviny se účastní regulace buněčných procesů a mezibuněčných vztahů V těchto informačních procesech mají dvojí roli: 1. jako signály, které přenášejí informaci 2. jako receptory, které mohou signál přijímat (rozpoznat) a případně transformovat v jiný(é) signál(y) Molekula bílkoviny splňuje všechny předpoklady pro signální funkci: Informace může být snadno zakódována do primární struktury (sekvence AK), ta udává finální konformaci uplatňující se jako signál Stavebnicový princip skladby bílkovin umožňuje vznik neomezeného množství různých a velmi specifických signálů Omezená mobilita bílkovin (omezený průchod membránami či vazba na membrány) šíření může být vymezeno na určité kanály Bílkoviny lze snadno štěpit tj. lze snadno zrušit jejich signální funkci Mezi nejdůležitější bílkoviny s vysloveně signální f-cí patří: Bílkovinné hormony Imunoglobuliny Regulátory genové aktivity
22 Bílkoviny nesoucí morfogenní informaci (templáty) Bílkovinné hormony - např. hormony hypofýzy, příštítných tělísek, pankreatu atd. Lze k nim přiřadit i některé oligonukleotidy s funkcí v hormonálních regulacích Imunoglobuliny (Ig) - vysokomolekulární bílkoviny, specificky rozpoznávající strukturu antigenů. Základem všech typů Ig je tetrametr polypeptidových řetězců, které jsou navzájem vázány disulfidovými můstky Regulátory genové aktivity - proteiny s malou m.h., které se podílejí především na regulaci transkripce Receptory- struktury buňky se schopností přijímat (číst, rozpoznávat) signály přicházející z okolí buňky. Pro příjem informace nesené chemickými signály slouží většinou molekuly bílkovin. Většina receptorů, které čtou signály jak z okolí buňky, tak vnitrobuněčné signály vázána na biomembrány.