USE OF SSR MARKERS TO IMPROVE TECHNOLOGICAL QUALITY IN MALTING BARLEY VYUŽITÍ SSR MARKERŮ PRO ZLEPŠENÍ TECHNOLOGICKÉ JAKOSTI SLADOVNICKÉHO JEČMENE Ježíšková I., Bednář J. Ústav botaniky a fyziologie rostlin, Agronomická fakulta, Mendlova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Zemědělská 1, 613 00 Brno, Česká republika. E-mail: xjezisko@node.mendelu.cz ABSTRACT Fusarium Head Blight (FHB) is a worldwide spread fungal disease of cereals caused by Fusarium species. The infection of plants can lead to reduction in yields and accumulation of toxic secondary metabolites (mycotoxins) of fungi in kernels. The mycotoxins can exhibit strong adverse effects on malting quality and health safety of the grain. The objective of this study was to use microsatellite markers to predict resistance or susceptibility to FHB in seven selected spring barley genotypes. Based on partial results of analyses, the tested genotypes of spring barley were divided into two basic groups. The first group includes the genotypes Chevron (resistant), PEC 210 (resistant) and 6NDRFG-1 (moderately resistant). The second group is divided into two subgroups; the first subgroup contains the genotypes Foster (susceptible) and PI 383933 (susceptible) and the second subgroup comprises the genotypes CI4196 (resistant) and Zao Zhou 3 (moderately resistant). Keywords: Fusarium Head Blight, FHB, microsatellites, deoxynivalenol, spring barley ABSTRAKT Fusariové vadnutí klasů (FHB) je celosvětově rozšířené houbové onemocnění obilovin, které způsobují druhy rodu Fusarium. Infekce rostlin může vést k redukci výnosů a ke kumulaci toxických sekundárních metabolitů hub (mykotoxinů) v obilkách. Mykotoxiny mohou mít silný negativní účinek na technologickou jakost a zdravotní nezávadnost získaného zrna. Cílem práce bylo využít mikrosatelitní markery pro predikci rezistence resp. náchylnosti vůči FHB u 7 vybraných genotypů ječmene jarního. Na základě dílčích výsledků analýz byly testované genotypy ječmene jarního rozděleny do 2 základních skupin. První skupinu tvoří genotypy Chevron (rezistentní), PEC 210 (rezistentní) a 6NDRFG-1 (středně rezistentní). Druhá skupina se rozpadá na dvě podskupiny, přičemž první podskupinu tvoří genotypy
Foster (náchylný) a PI 383933 (náchylný), druhou podskupinu tvoří genotypy CI4196 (rezistentní) a Zao Zhou 3 (středně rezistentní). Klíčová slova: Fusariové vadnutí klasů, FHB, mikrosatelity, deoxynivalenol, jarní ječmen ÚVOD Již na konci 19. století bylo popsáno onemocnění obilovin označované jako fusariové vadnutí klasů Fusarium Head Blight (FHB). FHB je celosvětově rozšířené houbové onemocnění, vyskytující se zejména u pšenice a ječmene, které vyvolávají zástupci rodu Fusarium (v našich podmínkách zejména F. culmorum a F. graminearum). Houby rodu Fusarium mohou být během vegetace příčinou výrazné redukce výnosů. Je-li FHB napadeno osivo, projeví se onemocnění v nevyrovnanosti porostu, nestejnoměrném vzcházení a špatném vývoji klíčních rostlin. Největší škody však vznikají jsou-li FHB napadeny klasy. Patogenní houby totiž brání normálnímu vývoji zrn, čímž se snižuje jejich počet v klase a celkově tedy i výnos. Kromě toho mohou fusaria díky svému metabolismu produkovat sekundární toxické metabolity, tzv. mykotoxiny, které se hromadí v obilkách. Z fusariových mykotoxinů bývá v zrně v nejvyšší koncentraci obsažen mykotoxin deoxynivalenol (DON), který se tak považuje za indikátor možné kontaminace dalšími fusariovými mykotoxiny (Velíšek, 1999). Fusariové mykotoxiny jsou látky velice stabilní, a to jak tepelně, tak i chemicky. Mykotoxin deoxynivalenol může při zpracování sladovnického ječmene přejít až do výsledného produktu výroby, tj. piva. Tam pak může působit jako jeden z faktorů, který stojí za nežádoucím přepěňováním piva tzv. divoké pivo (gushing) (Sýkorová, 2003). Fusariové mykotoxiny mohou u člověka vyvolávat intoxikace. Typickými primárními příznaky intoxikace je postižení trávicího ústrojí záněty, zvracení a průjmy, typické jsou také bolesti hlavy. V pozdějších fázích pak může dojít k poškození imunitního systému (Velíšek, 1999). Karcinogenita, popř. mutagenita těchto látek je v současné době diskutována. Česká legislativa stanovuje podle Z. 298/ 1997 Sb., Vyhl. 294/97 hygienický limit pro obsah deoxynivalenolu v zrně na 2 mg/kg a pro mouku limit 1 mg/ kg. Nově od 20. 5. 2004 platí Vyhl. č. 305/ 2004 Sb., která upravuje limity pro obsah DONu v obilovinách pro přímou spotřebu a zpracované obilí, kromě tvrdé pšenice, na 0,5 mg/kg, chléb a jemné pečivo 0,35 mg/kg a obiloviny pro dětskou výživu 0,1 mg/kg. Mikrosatelity (SSR Simple Sequence Repeats, STS Short Tandem Repeats) jsou sekvence DNA složené z mnohokrát se opakujících motivů 1 6 nukleotidů (např. (GA) n, (AAT) n ). Podle složení lze mikrosatelity rozdělit na a) dokonalé, jež tvoří souvislý motiv, b) nedokonalé, kdy je základní mikrosatelitový motiv přerušen sledem náhodných bazí a c)
složené mikrosatelity, které jsou tvořeny několika dílčími motivy (např. (AG) 16 (AT) 18 ). Celková délka mikrosatelitu obvykle nepřesahuje 100 pb. Nejvíce jsou v rostlinných genomech zastoupeny dinukleotidové mikrosatelity, nejméně často se vyskytují mono a tetranukleotidové motivy. Nejčastěji se vyskytujícím motivem je v rostlinném genomu repetice (AT) n, z trinukleotidových repetic to jsou motivy (AAG/CTT) n a (AAT/ATT) n. Odhaduje se, že mikrosatelit delší než 20 pb se v genomu rostlin vyskytuje na každých 23,3 kb, což je v porovnání s živočichy méně častý výskyt (1 mikrosatelit na každých 6 kb) (Koblížková, 1998). Mikrosatelitové lokusy mají kodominantní charakter (umožňující rozlišení homozygotů od heterozygotů) a vysoký stupeň polymorfizmu, který je dán rozdílem v počtu opakujících se jednotek. Vyhledávání polymorfních mikrosatelitových oblastí a stanovení jejich sekvence je z hlediska optimalizace použitelných metod a protokolů náročné, další praktické využití pak již nebývá obtížné. Dosažené výsledky SSR analýz jsou vysoce reprodukovatelné. Cílem práce bylo otestovat 7 rodičovských genotypů jarního ječmene, jež budou dále využity pro tvorbu DH linií, na citlivost, resp. rezistenci vůči FHB mikrosatelitními markery. METODIKA Materiál: Pro izolaci DNA a následnou analýzu SSR markery bylo vybráno 7 genotypů jarního ječmene (z kolekce genových zdrojů ZVÚ Kroměříž, s. r. o.) s deklarovanou rezistencí, resp. náchylností vůči FHB. Testovanými náchylnými genotypy byly: PI383933 a Foster, testovanými rezistentními genotypy byly: PEC210, 6NDRFG-1, CI4196, Zao Zhou 3 a Chevron. Izolace DNA: DNA byla izolována z mladých rostlin ve fázi 1 pravého listu pomocí izolačního kitu DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, GE). Koncentrace DNA byla ověřena spektrofotometricky. PCR reakce: Reakční směs o celkovém objemu 25 µl obsahuje: 30 ng templátové DNA, 0,5U Taq polymerázy (Promega, USA), 1x odpovídajícího pufru, 7,5 µm každého primeru a 0,1 mm každého dntp. Reakční podmínky: počáteční denaturace 1 min při 98 C, následuje 40 cyklů denaturace 10 sec. při 98 C, annealing 15 sec. při 60 C, elongace 30 sec. při 72 C a závěrečná elongace 5 min. při 72 C. Vizualizace PCR produktů: PCR produkty byly vizualizovány barvením ethidiumbromidem po proběhlé horizontální elektroforéze (při 67 V) na 3% MetaPhor agarosovém gelu (Cambrex, USA) v TAE pufru. Dále bylo pro vizualizaci produktů použito barvení stříbrem (0,2% dusičnan stříbrný) nebo barvivem SYBR Gold (Molecular Probes, USA) po proběhlé
vertikální elektroforéze (při 300 V) na 15% nedenaturačním polyakrylamidovém gelu v TBE pufru. VÝSLEDKY A DISKUSE Do současné doby bylo otestováno 12 z cca 60 zamýšlených mikrosatelitních markerů. Všechny testované mikrosatelity poskytly po proběhlé PCR produkt. Vizualizací testovaných mikrosatelitů na polyakrylamidových a MetaPhor agarosových gelech byl u testovaných mikrosatelitů detekován polymorfní charakter. Počet detekovaných alel se pohyboval v rozmezí 2 až 5, resp. v rozmezí 120-200 pb. Žádný z testovaných mikrosatelitů neměl monomorfní charakter. Na základě dílčích výsledků analýz mikrosatelitních markerů byla sestavena binární matice tvořena souborem 1 (přítomnost produktu) a 0 (nepřítomnost produktu). Matice byla statisticky vyhodnocena softwarem FreeTree ver. 9.1.50 s využitím podobnostního koeficientu Liu and Li/ Dice. Výsledek statistického zpracování byl pomocí software TreeView ver. 1.6.6 převeden do podoby dendrogramu, jež charakterizuje genetickou podobnost analyzovaných genotypů. Výsledky analýz ukazují na rozdělení analyzovaných genotypů do 2 základních skupin. První skupinu tvoří genotypy Chevron (rezistentní), PEC 210 (rezistentní) a 6NDRFG-1 (středně rezistentní). Druhá skupina se rozpadá na dvě podskupiny, přičemž první podskupinu tvoří genotypy Foster (náchylný) a PI 383933 (náchylný), druhou podskupinu tvoří genotypy CI4196 (rezistentní) a Zao Zhou 3 (středně rezistentní) (obr. 1). Z hlediska metodického lze pro vizualizaci mikrosatelitů doporučit zejména použití polyakrylamidových gelů. Ty mají v porovnání s MataPhor agarosovými gely vyšší citlivost a tedy i lepší vyhodnotitelnost. Pro barvení polyakrylamidových gelů je možné doporučit jak barvení stříbrem, tak i barvení komerčním barvivem SYBR Gold. Citlivost obou způsobů barvení je srovnatelná. Barvení stříbrem je pracnější, ale cenově dostupnější. Získané gely lze dlouhodoběji uchovávat, a to skladováním při teplotě 4 C. Barvení SYBR Goldem je pohodlnější, časově méně náročné, ale výrazně dražší a vyžaduje systém umožňující vizualizaci produktů v UV oblasti. Při barvení gelů je také nutné brát ohled na citlivost komerčního barviva vůči světlu. Nevýhodami použití polyakrylamidových gelů je nutnost práce s neurotoxickým akrylamidem. Dalším negativním jevem je tzv. smile efekt, tj. prohnutí výsledného spektra fragmentů. Tento jev lze zpravidla odstranit zvýšením koncentrace polyakryamidového gelu, přičemž se ale také prodlužuje čas potřebný pro stanovení. Nevýhodami použití MetaPhor agarosových gelů může být jejich poměrně vysoká finanční náročnost, kterou je ale možné řešit opakovaným rozvařováním již použitých gelů
(doporučení výrobce). Při výrobě gelů se jako nevýhodná jeví vysoká pěnivost speciální agarosy a následně křehkost hotových gelů (při porovnání s klasickou agarosou). Vizualizace produktů na MetaPhor agarose je však vhodnou alternativou detekce mikrosatelitů všude tam, kde nelze pro stanovení využít polyakrylamidových gelů. Obr. 1: Dendrogram charakterizující genetickou podobnost studovaných genotypů SSR markery ZÁVĚR Prakticky byla ověřena možnost využití mikrosatelitních markerů pro testovaní rezistence jarního ječmene vůči FHB. V budoucnu bude soubor testovaných mikrosatelitních markerů ještě dále rozšířen, tak aby se zvýšila statistická průkaznost zvolené metody. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY KOBLÍŽKOVÁ, A.: Mapování geonomů rostlin pomocí mikrosatelitových markerů. Biologické listy, 63, 1998, 2: 139 149. SÝKOROVÁ, S.: Monitoring obsahu fusariových mykotoxinů ve vzorcích pšenice, ječmene a žita (2000 2002). Sborník (CD) z konference Jakost obilovin 2003, ZVÚ Kroměříž, 2003. VELÍŠEK, J.: Chemie potravin 3 díl. Ossis Tábor, 1999, 368 s.