V prvé řadě bych rád poděkoval Doc..RNDr. Miroslavu Poláškovi, CSc. za cenné rady,

PODĚKOVÁNÍ V prvé řadě bych rád poděkoval Doc..RNDr. Miroslavu Poláškovi, CSc. za cenné rady, odborné vedení, pomoc a trpělivost během celého mého postgraduálního studia a při přípravě disertační práce. Dále bych rád poděkoval Doc. RNDr. Marii Pospíšilové CSc, jejíž praktické zkušenosti s elektromigračními technikami byly výborným východiskem a základem pro rychlou orientaci a získání praktických dovedností v této oblasti. Chtěl bych také poděkovat všem svým kolegům a spolupracovníkům z katedry analytické chemie za vstřícnost a příjemnou pracovní atmosféru, která na tomto pracovišti vládla. Děkuji grantové agentuře FRVŠ za finanční podporu mých výzkumných úkolů a za možnost prezentovat výsledky své práce na zahraničních konferencích. Ivan Petriška 2

OBSAH 1 ÚVOD... 6 2 CÍL PRÁCE... 7 3 KAPILÁRNÍ ELEKTROMIGRAČNÍ METODY... 8 3.1 Vznik, vývoj a trendy v instrumentaci a aplikačních oblastech kapilární elektroforézy... 8 3.2 Rozdělení a charakteristika kapilárně elektroforetických technikchyba! Záloţka není defino 3.2.1 Kapilární izotachoforéza (ITP)... 11 3.2.2 Kapilární zónová elektroforéza (CZE, CE)... 12 3.2.3 Micelární elektrokinetická chromatografie (MEKC)... 12 3.2.4 Isoelektrická fokusace (IEF)... 12 3.2.5 Kapilární elektrochromatografie (CEC)... 13 3.2.6 Kapilární gelová elektroforéza (CGE)... 14 4 KAPILÁRNÍ IZOTACHOFORÉZA... 15 4.1 Základní popis metody... 15 4.2 Aplikace ITP v analýze látek přírodního původu... 18 4.3 Stanovení tetryzolinu a antazolinu v HVLP metodou ITP... 19 4.4 Stanovení hydroxycitronové kyseliny v extraktu rostliny Garcinia cambogia kapilární izotachoforézou... 21 5 KAPILÁRNÍ ZÓNOVÁ ELEKTROFORÉZA (CZE,CE)... CHYBA! ZÁLOŽKA NENÍ DEFINOVÁNA. 5.1 Základní popis metody... 23 5.2 Způsoby ovlivňování elektroforetické pohyblivosti analytů u CZEChyba! Záloţka není defin 3

5.3 Komplexace analytů jako prostředek k ovlivňování elektroforetické pohyblivosti... 29 5.4 Molybden, jeho oxosloučeniny a komplexotvorné vlastnostichyba! Záloţka není definována. 5.5 Flavonoidy, jejich výskyt, vlastnosti, využití ve farmacii a možnosti jejich stanovení kapilární elektroforézou... 32 5.6 Použití molybdenanu jako komplexujícího činidla v analýze polyhydroxysloučenin kapilární zónovou elektroforézou... 37 5.7 Stanovení manitolu a sorbitolu metodou kapilární elektroforézy... 40 6 MICELÁRNÍ ELEKTROKINETICKÁ CHROMATOGRAFIE (MEKC)... 41 6.1 Základní popis metody... 41 6.2 Aplikace MEKC v analýze přírodních látek... Chyba! Záloţka není definována. 6.3 Silice, jejich vlastnosti, složení, výskyt, použití ve farmacii a možnosti jejich stanovení... 47 6.4 Stanovení majoritních alkoholových složek lékopisných rostlinných silic metodou MEKC... 51 7 PŘÍLOHY... 53 7.1 Přehled publikovaných prací.... 54 7.1 Příloha I: Petriška I., Polášek M. : Česk. Slov. Farm. 53 (2), 61-66. (2004)... 56 7.3 Příloha II: Petriška I., Polášek M., Pospíšilová M., Petrů E.: Determination of antazoline and tetryzoline in pharmaceuticals by capillary isotachophoresis (připraveno k publikaci)... 64 7.4 Příloha III: Petriška I., Polášek M., Jahodář L., Němečková K.: Determination of hydroxycitric acid in Garcinia cambogia extracts and in mass-produced dietary supplements by capillary isotachophoresis (připraveno k publikaci)... 78 4

7.5 Příloha IV: Polášek M., Petriška I., Pospíšilová M., Jahodář L.: Talanta 69, 192-198. (2006)... 91 7.6 Příloha V: Pospíšilová M., Polášek, M., Šafra J., Petriška I.: Electrophoresis (přijato k publikaci)... 100 7.7 Příloha VI: Petriška I., Polášek M., Sladkovský R.: Pharmazie (v tisku)..chyba! Záloţka 8 SHRNUTÍ... 137 9 ZÁVĚR... 139 10 SEZNAM LITERATURY... 140 5

1 ÚVOD Kapilární elektromigrační metody nacházejí stále větší uplatnění v analýze komplikovaných směsí látek a to i ve vzorcích s komplexní matricí biologickou či environmentální. S prudkým rozvojem a intenzivním výzkumem se v posledních letech výrazně rozšířily aplikační moţnosti těchto metod i na analyty neiontového charakteru. Díky technickému zdokonalování instrumentálního vybavení vznikla kromě klasické kapilární zónové elektroforézy a izotachoforézy celá řada hybridních technik jako jsou kapilární isoelektrická fokusace (IEF), micelární elektrokinetická chromatografie (MEKC), kapilární elektrochromatografie (CEC) a kapilární gelová elektroforéza (CGE), k jejichţ realizaci jsou komerčně dostupné vysoce sofistikované a plně automatické přístroje. Techniky kombinující elektroforetický princip s chromatografickým (MEKC, CEC) tak umoţňují analyzovat nenabité, neutrální, často značně lipofilní látky. Elektromigrační metody tímto v současné době představují značný potenciál v kvalitativní a kvantitativní analýze vzorků, jimiţ mohou být roztoky sloţitých směsí od jednoduchých anorganických látek aţ po proteiny a jsou vhodnou alternativou ke standardní separační analytické metodě vysokoúčinné kapalinové chromatografii (HPLC). 6

2 CÍL PRÁCE Cílem práce bylo vyuţití potenciálu elektromigačních separačních technik (kapilární isotachoforéza a kapilární zónová elektroforéza) v analýze léčivých látek. Kapilární izotachoforéza byla vyuţita ve farmaceutické analýze vybraných léčiv ze skupiny imidazolových sympatomimetik se zřetelem na vypracování metodiky umoţňujících rutinní kontrolu obsahu a čistoty těchto léčiv v hromadně vyráběných farmaceutických přípravcích. Hlavní náplní byl vývoj elektromigračních metod v analýze látek přírodního původu. Kapilární izotachoforéza byla vyuţita pro stanovení polykarboxylových kyselin (zejména hydroxyderivátu kyseliny citrónové) v rostlinném extraktu. Vzhledem k tomu, ţe řada přírodních látek existuje za normálních podmínek v elektroneutrální formě, byly dále zvoleny dva přístupy pro jejich elektroforetickou analýzu. V prvém případě byl testován vliv přídavku potenciálního komplexotvorného činidla na separaci vybraných flavonoidních polyfenolických sloučenin rostlinného původu v závislosti na koncentraci činidla a ph elektromigračního prostředí. Vývoj této metodiky byl následně spojen s validací a aplikací na stanovení flavonoidů v rostlinných extraktech. Druhým přístupem výzkumu v této oblasti bylo vyuţití hybridní techniky micelární elektrokinetické chromatografie (MEKC) pro separaci, identifikaci a stanovení silně lipofilních těkavých siličných látek ve farmaceuticky významných rostlinných silicích. Metodika by tak mohla slouţit jako alternativa k nejčastěji pouţívané plynové chromatografii (GC). Vzhledem k tomu, ţe fenomenologický a matematický popis elektromigračních technik, stejně tak jako detailní pohled na pouţívanou instrumentaci, detekční způsoby včetně jejich schémat a stovky potenciálních aplikací je náplní značného počtu monografií 1-5, je tato problematika v teoretické části disertační práce (aţ na výjimky) hodnocena stručně. 7

3 KAPILÁRNÍ ELEKTROMIGRAČNÍ METODY 3.1 Vznik, vývoj a trendy v instrumentaci a aplikačních oblastech kapilární elektroforézy Jiţ po několik desetiletí představuje konvenční elektroforéza metodu volby pro řešení různých separačních problémů v biochemii. Tato technika je realizována v stabilizujících mediích, kterýmiţ jsou hydrofilní gely, a velice úspěšně vyţívána pro separace nabitých makromolekulárních látek jako nukleových kyselin, proteinů a peptidů. Nejčastěji je prováděna v plošném dvojrozměrném uspořádání, čímţ je dosaţeno nejvyššího moţného separačního rozlišení. Hlavní nevýhodou těchto technik je absence instrumentace umoţňující automatizaci analýz, z čehoţ vyplývá zdlouhavá výměna nosičů s gelem a nedostatečná dlouhodobá reprodukovatelnost výsledků. Realizace elektroforetické separace bez gelového stabilizujícího media nabízela sice moţnost eliminovat různé zdroje nereprodukovatelnosti, ale vyţadovala nalezení jiného principu stabilizace elektroforetických zón. Stabilizace migrujících zón byla zajištěna pouţitím tenkých kapilár, v nichţ neţádoucí disperze vlivem hydrodynamického toku byla minimalizována velice malým vnitřním průměrem kapiláry. Vyuţití kapiláry jako separační kolony umoţnilo velice jednoduchou výměnu základního elektrolytu a to reprodukovatelným způsobem. Výborné termické vlastnosti těchto kapilár představované schopností odvádět generované Joulovo teplo umoţnily pouţití elektrického pole vysoké intenzity, čímţ došlo k značnému urychlení analýz a k dosaţení vysoké separační účinnosti. Detekce začala být realizována on-line, tedy přímo na separační kapiláře. Roku 1967 zrealizoval S. Hjertén první elektroforetickou separaci v kolonovém uspořádání pouţitím rotující skleněné kapiláry s poměrně velkým vnitřním průměrem (3 mm). Na konci 70. let pouţili Mikkers a kol. teflonovou kapiláru o průměru 200 µm k separaci aniontů a dosáhli separační účinnosti odpovídající počtu 25 000 teoretických pater [6]. Hlavní nevýhodou jejich metody byla nízká citlivost detekce kvůli omezené optické dráze v detekční cele. Další rozvoj kapilární zónové elektroforézy byl spojen s vývojem kapilární izotachoforézy. V roce 1970 pouţil Everaerts a spolupracovníci vlastnoručně vyrobený ITP přístroj s kapilárou z polytetrafluoroethylenu (PTFE) průměru 0,5 mm pro separaci látek zónovou elektroforézou. Detekce byla on-line s vyuţitím 8

termočlánku 7. Vzhledem k nevhodnosti tohoto typu detekce nastal rychlý rozvoj on-line vodivostních a UV detektorů pro ITP, které umoţnily detekovat úzké migrující zóny a zaznamenat reálný profil zón v kapilární elektroforéze. Hlavními průkopníky moderní kapilární elektroforézy byli Jorgenson a Lukacs, kteří publikovali v roce 1981 práci, ve které popsali separaci derivatizovaných aminokyselin a peptidů kapilární elektroforézou za pouţití fluorescenční detekce [8]. Pracovali se skleněnou kapilárou, jejíţ parametry se jiţ blíţily kapilárám dnešním; délka 1 metr, vnitřní průměr 75 µm. Touto prací prakticky zavedli základní principy elektroforetické separace a popsali také vliv elektroosmotického toku na separaci analytů v kapiláře. Od tohoto okamţiku dochází k fenomenálnímu rozvoji kapilárně elektroforetických technik. Kapilární elektroforéza začíná představovat velice zajímavou a výhodnou alternativu k stávajícím chromatografickým technikám, zejména k HPLC. Hlavní oblastí dalšího vývoje bylo dosaţení co největší citlivosti detekce. Běţně vyuţívaná spektrometrická detekce v UV oblasti je u kapilární elektroforézy limitována malým vnitřním průměrem kapiláry (velmi krátká optická dráha detekčního okénka), a proto nelze dosáhnout při pouţití těchto detektorů podobných detekčních limitů jako například u HPLC. Rozvoj dalších detekčních technik, např. laserem indukovaná fluorescenční detekce [9] nebo na mikroelektrodách zaloţené amperometrické detektory [10], výrazně zvýšil jak citlivost tak selektivitu detekce. V současné době je největším trendem spojení kapilární elektroforézy s hmotovou spektrometrií, s moţností získávání informací o strukturách analyzovaných látek [11-13]. Současně s klasickou kapilární elektroforézou se vyvíjely další nové způsoby elektroforetické separace, micelární elektrokinetická chromatografie [14], kapilární gelová elektroforéza, vyuţívaná hlavně k analýze makromolekulárních látek [15] a elektrokinetická fokusace [16]. Od roku 1989, kdy se na trhu objevil první komerčně dostupný přístroj pro kapilární elektroforézu, se tato metoda rychle rozšířila do farmaceutických a biochemických laboratoří po celém světě. Jejími přednostmi a výhodami jsou zejména rychlost analýz, vysoká separační účinnost, překonávající i HPLC techniky, moţnost online detekce přímo na kapiláře, jednoduchost kvalitativního a kvantitativního hodnocení výsledků a v současné době i dostupnost velice sofistikovaného instrumentálního vybavení umoţňující plně automatický provoz. 3.2 Rozdělení a charakteristika kapilárně elektroforetických technik 9

Elektroforetické metody obecně jsou zaloţeny na pohybu nabitých částic v elektrickém poli. Rychlost částice je přímo úměrná intenzitě elektrického pole a elektroforetické pohyblivosti: V = u. E u elektroforetická pohyblivost [m 2.V -1. s -1 ] v rychlost elektroforetického pohybu [m. s -1 ] E intenzita elektrického pole [V. m -1 ] Elektroforetická pohyblivost vyjadřuje rychlost pohybu částice nebo iontu v jednotkovém elektrickém poli, roste úměrně s nábojem, klesá s velikostí částice. Pro dvojici iont prostředí je pohyblivost charakteristickou konstantou [17]. Kolem kaţdého iontu v roztoku vytvářejí ionty opačného znaménka tzv. iontovou atmosféru. Interakce mezi ionty ovlivňuje pohyblivost sledovaného iontu s rostoucí koncentrací jeho pohyblivost klesá. Pokud extrapolujeme koncentrační závislost elektroforetické pohyblivosti na nulovou iontovou sílu, získáme pohyblivost iontovou u 0. S rostoucí teplotou se iontová pohyblivost zvyšuje (zvýšení teploty o 1 o C vede ke zvýšení pohyblivosti o 2%) [17]. Skutečná pohyblivost je pohyblivost v reálném prostředí při reálné teplotě. Je zpravidla niţší neţ µ 0 díky vzájemným interakcím iontů v konečně zředěných roztocích [18]. Látky povahy slabých kyselin a bází se v roztoku vyskytují ve dvou formách. Ve formě iontu s příslušnou elektroforetickou pohyblivostí a ve formě neutrální molekuly, která elektroforetickou pohyblivost nevykazuje. Obě formy jsou ve směsi zastoupeny v určitém poměru vyjádřeném např. disociačním stupněm. Při elektroforéze nemůţe dojít k rozdělení rovnováţné směsi na nepohyblivé molekuly a pohyblivé ionty (ionizační rovnováha probíhá ve srovnání s elektromigrací nepoměrně rychleji). Směs putuje jednotnou rychlostí, která je úměrná disociačnímu stupni. Výsledná pohyblivost se nazývá efektivní pohyblivost u, je dána vztahem : u ui xi u i iontové pohyblivosti jednotlivých forem látky χ i molární zlomky 10

Volbou ph lze upravit sloţení rovnováţné směsi a tím regulovat pohyblivost podle potřeby od nulové aţ po plnou iontovou. Je to účinný prostředek k dosaţení optimálního dělení směsi kyselých a zásaditých látek [18]. Závislost elektroforetického chování jednosytných protolytů na aciditě prostředí popisuje vztah:[17] u u 1 10 pk ph Takto lze popsat i migrační chování komplexů. Pokud ustanovení rovnováţného stavu probíhá rychlostí srovnatelnou nebo niţší neţ je rychlost elektromigrace, je moţné jednotlivé formy téţe látky od sebe oddělit. Elektroforetické techniky mohou být klasifikovány z různých hledisek. Podle charakteristiky separačního procesu určeného typem a vlastnostmi separačního médiaelektrolytu lze rozlišit šest typů metod: kapilární izotachoforéza kapilární zónová elektroforéza micelární elektrokinetická chromatografie izoelektrická fokusace kapilární elektrochromatografie kapilární gelová elektroforéza V této části práce budou jednotlivé metody charakterizovány pouze stručně. Podrobněji bude o některých z nich (kapilární izotachoforéza, kapilární zónová elektroforéza a micelární elektrokinetická chromatografie) pojednáno v příslušných kapitolách. 3.2.1 Kapilární izotachoforéza (ITP) Kapilární izotachoforéza představuje metodu, která se svým principem i vlastní instrumentací poněkud odlišuje od ostatních elektromigračních technik a je příkladem separace v systému dvou nespojitých elektrolytů.. Vzorek je dávkován mezi vedoucí (LE) a koncový elektrolyt (TE). Během analýzy se ze směsné zóny vzorku obsahující látku A a B postupně vyděluje zóna látky A a zóna látky B, přičemţ část vzorku nadále putuje jako 11

směsná zóna obsahující látku A i B. Ke konci analýzy veškerá látka A i B vymigruje ze směsné zóny, takţe kapilárou migrují ustálenou konstantní rychlostí ostře ohraničené, těsně na sebe navazující zakoncentrované zóny látky A a B. 3.2.2 Kapilární zónová elektroforéza (CZE, CE) Tato metoda představuje klasickou separační techniku zaloţenou na elektromigraci. Kapilára je naplněna základním elektrolytem (background BGE), jehoţ vlastnosti jsou v celé délce kapiláry konstantní a který zajišťuje tok elektrického proudu a vznik konstantního elektrického pole po vloţení elektrického napětí. Za těchto podmínek kaţdá látka analyzované směsi migruje konstantní rychlostí, jejíţ velikost je určena příslušnou efektivní pohyblivostí a intenzitou elektrického pole. Zóny jednotlivých látek se během analýzy od sebe vzdalují a výsledným efektem je jejich rozdělení. 3.2.3 Micelární elektrokinetická chromatografie (MEKC) U této metody se vedle elektroforetického separačního principu uplatňuje také princip chromatografický. Základní elektrolyt zde navíc obsahuje povrchově aktivní aniontovou, kationtovou nebo nenabitou látku tenzid, v koncentracích umoţňujících tvorbu micel, které se chovají jako pseudostacionární fáze. Látky se poté dělí na základě jejich lipofility mezi základní elektrolyt (mobilní fáze) a vnitřek micely (pseudostacionární fáze). 3.2.4 Izoelektrická fokusace (IEF) Pokud sloţení základního elektrolytu není konstantní v celé délce kapiláry, potom v jejich různých částech je odlišná hodnota intenzity elektrického pole, a tudíţ i hodnota efektivní pohyblivosti analytu, coţ výrazně ovlivňuje separační proces. Migrace jednotlivých látek analyzované směsi můţe být v různých částech separační kapiláry zcela zastavena. Příkladem takového systému je izoelektrická fokusace (IEF) 1-3, kde základní elektrolyt je realizován směsí amfolytů vytvářející v separační kapiláře gradient ph. Analyty, které se liší v izoelektrických bodech, jsou separovány na základě zastavení migrace po dosaţení takového bodu v separační kapiláře, kde hodnota ph je totoţná s izoelektrickým bodem příslušné sloučeniny. Takto vytvořené zóny jsou velice úzké, 12

neboť analyty, které z nich oddifundují, jsou vráceny elektromigrací zpět. Analyty se následně uvedou do pohybu (tlakem, elektroforeticky po přidání soli). Posun ph gradientu má za následek posunutí zón látek a jejich přivedení k detektoru. Místo vlastního uvedení zón analytů do pohybu lze pouţit pohyblivý skenující detektor. Metoda izoelektrické fokusace se s výhodou pouţívá ke stanovení aminokyselin a bílkovin. 3.2.5 Kapilární elektrochromatografie (CEC) Kapilární elektrochromatografie 1-3 představuje hybridní techniku kombinující principy kapilární zónové elektroforézy a HPLC. První úspěšnou elektromigrační separaci v křemenné kapiláře o vnitřním průměru 170 m naplněné oktadecylsilanem (ODS) s 10 m zrněním provedli Jorgenson a Lukacs v roce 1981. Tak jako v HPLC dochází i zde k separaci látek na základě jejich rozdílné afinity k stacionární fázi. Mobilní fáze, nejčastěji směs vody, organického rozpouštědla (acetonitril, methanol) v příslušném pufru je hnána pomocí elektroosmotického toku loţem stacionární fáze v naplněné kapiláře. Molekuly analytů jsou unášeny mobilní fází směrem k detektoru a zároveň jsou zpoţďovány interakcí se stacionární fází. Tato technika je vhodná pro separaci neutrálních molekul i iontů. Nenabité analyty se separují na základě rozdílné distribuce mezi sorbetem (stacionární fází) a mobilní fází, u nabitých analytů je separace navíc podporována rozdíly v elektroforetických mobilitách. Elektroosmotický tok je generován větší měrou na povrchu stacionární fáze neţ na vnitřním povrchu kapiláry. Metodou kapilární elektrochromatografie lze často dosáhnout větší separační účinnosti neţ u HPLC (rovný rychlostní profil EOF). Další nespornou výhodou je absence vysokých tlaků oproti klasické HPLC, moţnost pouţití velmi malých částic náplně kolony a malá spotřeba vzorku a mobilní fáze. Limitem zůstává sloţitá příprava naplněných kapilár a uzavíracích frit, křehkost naplněných kapilár, moţnost vzniku bublin v mobilní fázi resp. menší citlivost vyplývající z malých rozměrů detekční cely. 3.2.6 Kapilární gelová elektroforéza (CGE) 13

Poslední kapilární elektromigrační technikou, kde se kromě základního elektroforetického principu uplatňuje současně ještě jiný separační mechanismus, je kapilární gelová elektroforéza 1-3. Gelová elektroforéza v polyakrylamidovém nebo agarozovém gelu realizovaná v plošném uspořádání je pouţívaná jako dominantní technika pro separace biopolymerů jiţ více neţ tři desetiletí. Hlavní nevýhody představují off-line detekce rozseparovaných zón a komplikovaná a časově náročná manuální manipulace vzhledem ke sloţitosti automatizace těchto postupů. Koncem 80. let publikovali Kasper a Cohen první práce o kapilární gelové elektroforéze DNA a proteinů. Tyto práce ukázaly, ţe téměř všechny aplikace realizované v plošném uspořádání mohou být velice jednoduše převedeny do kapilárního formátu, čímţ bylo dosaţeno vysoké separační účinnosti a rozlišení, moţnosti on-line detekce a zpracování dat, dávkování malých objemů vzorku a jednoduché validace analytických metod. Gel naplněný v kapiláře funguje jako molekulové síto, tudíţ k separaci dochází zejména vlivem různé molekulové hmotnosti jednotlivých fragmentů. Těţší molekuly jsou gelem více brţděny a tak dochází k dělení fragmentů i se stejným elektrickým nábojem. Pouţívané gely lze rozdělit na chemické (vzájemně zesíťované chemickou vazbou) a fyzikální (tvořené řetězci makromolekul gelu, které jsou volně poskládány vzájemně přes sebe). Chemické zesíťované gely nelze z kapiláry vymýt a velikost jejich pórů a ok je dána chemickými vazbami. Příkladem chemického gelu je zesíťovaný polyakrylamid nebo agarosa. Oproti tomu lineární fyzikální gely lze v separační kapiláře vyměňovat a velikost pórů gelu není přesně definována. Příkladem fyzikálního gelu je polyakrylamid, hydroxymethylethylcelulosa, polyethylenglykol nebo dextrany. Gelovou elektroforézou lze separovat pouze jeden druh iontů během jednoho experimentu (kationty nebo anionty). Metoda je vhodná pro analýzu makromolekulárních látek (peptidů, bílkovin, sacharidů nebo štěpů DNA a RNA). 14

4 KAPILÁRNÍ IZOTACHOFORÉZA (ITP) 4.1 Základní popis metody Začátek rozvoje kapilární izotachoforézy [4,5] jako moderní instrumentální analytické metody se datuje do konce 60. a začátku 70. let minulého století a tento rozvoj byl iniciován pracemi Everaertse et al. [4,19,20]. V následujících 20 letech dosáhla velkého rozvoje zejména z hlediska metodologického a značný počet aplikací byl publikován v odborných časopisech. Kapilární izotachoforéza představuje elektroseparační metodu, při které se vzorek dávkuje mezi vedoucí (leading - LE) a koncový (terminating - TE) elektrolyt. Za těchto podmínek lze separovat buď anionty nebo kationty. Vedoucím iontem, který je hlavní součástí vedoucího elektrolytu, je iont s největší efektivní pohyblivostí a naopak zakončující elektrolyt je tvořen iontem s nejmenší efektivní pohyblivostí. Zóny jednotlivých sloţek (A. B, C) se pohybují v ustáleném stavu stejnou rychlostí (isotacho) těsně za sebou (viz obr. 1): v = E L u L = E A u A = E B u B = E C u C =... = E T u T E je intenzita elektrického pole u je efektivní pohyblivost iontů Platí: u A > u B > u C Další součástí elektrolytových roztoků je protiiont, jehoţ hlavní úlohou je pufrace ph v jednotlivých zónách a dále selektivní ovlivňování migrace jednotlivých sloţek.. V zónách se skokově mění ph tak, ţe při aniontové separaci vzrůstá od vedoucího k zakončujícímu elektrolytu a při kationtové separaci je tomu opačně. Elektrický odpor (R) v jednotlivých zónách skokově roste od vedoucího ke koncovému elektrolytu a stejně tak intenzita elektrického pole a teplota. Opačně je tomu u vodivosti (obr.1). Koncentrace iontů v zónách závisí na koncentraci vedoucího iontu ve vedoucím elektrolytu dle Kohlrauschova funkce (koncentrace v zóně se přizpůsobí předcházející zóně, která se přizpůsobí předcházející zóně atd. aţ k zóně vedoucího iontu): c A = c L u A (u L + u R ) / [(u A + u R ) u L ] c A,L a u A,L jsou koncentrace a pohyblivost iontu (analytu) A a vedoucího iontu L u R je pohyblivost protiiontu 15

Projevem tohoto efektu je zvýšení nebo naopak pokles koncentrací v zónách. Koncentrace vedoucích iontů v zóně je největší a postupně klesá k zóně zakončujícího iontu. Tento koncentrační efekt je velmi významný a dovoluje soustředit velké mnoţství analytu do malé zóny, kterou lze dávkovat k další separaci např. pomocí zónové kapilární elektroforézy. Obr. 1 Princip izotachoforetické separace iontů. A, B, C stanovované sloţky vzorku, L vedoucí ion, T zakončující ion Dalším důleţitým rysem izotachoforetické separace je samozaostřující efekt, který má za následek stabilně velmi ostré zóny, které se v důsledku difůze nerozmývají. Jestliţe by totiţ vznikl jakýkoliv iont do zóny migrující před ním, t.j. do oblasti s menší intenzitou elektrického pole, zpomalí se (podmínka konstantní rychlosti) a vrátí se zpět do své zóny. Kdyby se naopak zpomalil tak, ţe by pronikl do zóny za sebou, kde je oblast s vyšší intenzitou elektrického pole, tam se urychlí a vrátí se zpět do své zóny. 16

Instrumentace pro izotachoforézu je dobře propracována a její podrobný popis lze nalézt jinde [4,5]. K separaci dochází v kapiláře vyrobené z plastu (obvykle fluorovaných polymerů), 20 60 cm dlouhé, průměru 0,2 0,8 mm. Konce kapiláry jsou připojeny k elektrodovým komůrkám, které obsahují vedoucí elektrolyt a koncový elektrolyt a platinové elektrody pro připojení zdroje vysokého napětí. Neţádoucímu hydrodynamickému proudění elektrolytu se zabraňuje semipermeabilní membránou umístěnou obvykle v místě připojení kapiláry ke komůrce s vedoucím elektrolytem. Vzorek se dávkuje buď dávkovacím kohoutem nebo injekční stříkačkou. Dávkovaný objem bývá 1 20 µl. Nejčastěji pouţívanou detekční technikou je vodivostní detekce, která registruje změny vodivosti, respektive odporu, na ostrých zónových rozhraních a představuje univerzální metodu. Odezva detektoru je zaznamenávána jako schodovitá izotachoforetická křivka izotachoforeogram (obr. 1). Výhodné je pouţití UV detekce, zejména s ohledem na větší selektivitu a citlivost stanovení. Neabsorbující spacery oddělující zóny analytů umoţňují získání UV záznamu ve formě klasických píků, jejich výběr je však sloţitý a klade značné nároky na příslušného pracovníka. Separace se můţe provádět v jedné kapiláře nebo ve dvou spojených kapilárách tak, ţe v první tzv. předseparační kapiláře s větším průměrem dojde k rozdělení na jednotlivé zóny a ve druhé uţší kapiláře dochází k detekci. Vyuţívá se zde toho, ţe délka jednotlivých zón se mění s průměrem kapiláry, tj. ţe se zmenšujícím se průměrem kapiláry se délka zón zvětšuje. Touto technikou tzv. spojených kolon (kapilár) lze selektivně vybrat z předseparační kapiláry jednu nebo více zón, které se v analytické kapiláře detegují. Vzájemná poloha zón vůči zóně vedoucího a standardního nebo zakončujícímu iontu slouţí k identifikaci neznámé sloţky vzorku. V současnosti nachází ITP uplatnění v oblasti farmaceutických, medicínských a biologických analýz, s výhodou je také vyuţívána při monitorování kvality ţivotního prostředí - zejména analýzy anorganických iontů, při kontrole jakosti potravin a při sledování fermentačních biotechnologických procesů. Univerzalita vodivostní detekce, snadnost kvalitativního i kvantitativního hodnocení výsledků, správnost a přesnost naměřených dat a to nejen v rámci jedné laboratoře, ale i při realizaci stejných analýz v jiných laboratořích při pouţití optimálního validovaného elektrolytového systému, umoţňuje vyuţití ITP pro rutinní analýzu vzorků. 17

4.2 Aplikace ITP v analýze látek přírodního původu Prudký rozvoj kapilární zónové elektroforézy a její nesporné přednosti ve srovnání s ITP vedl k přesunu zájmu většiny výzkumníků na metodologický, aplikační a technický rozvoj kapilárně elektroforetických technik. Přesto však je kapilární ITP v analytické praxi nadále pouţívanou technikou. Problematika nalezení optimální dvojice LE a TE je poněkud sloţitější ve srovnání s volbou BGE pro CZE analýzu, přesto však základní operační systémy pro aniontovou a kationtovou ITP s odstupňovanou hodnotou ph byly v literatuře popsány, coţ výrazně usnadňuje jejich výběr pro analýzu léčiv, zejména v případě, pokud jsou známé pka hodnoty analyzovaných látek 4, 5. Podrobný přehled analytických aplikací ITP se objevuje v mnoha dřívějších monografiích [5,21-24]. Podstatným znakem izotachoforézy je omezení aplikačního uţití na ionogenní látky (kationty nebo anionty). Toto omezení aplikačního pole je ovšem na druhé straně výhodou, protoţe neionogenní látky, které jsou často majoritními sloţkami analyzovaného vzorku, neruší analýzu látek ionogenních. Proto hlavní těţiště praktických aplikací leţí v analýze organických, či anorganických iontů v oblasti ţivotního prostředí, nebo v potravinářství. Objevují se i aplikace této metody pro stanovení sloţitějších látek přírodního původu, které jsou často produktem sekundárního metabolismu (alkaloidy, flavonoidy, anthokyany) v rostlinných extraktech. Příklady některých aplikací ITP pro analýzu látek obsaţených v lékopisných rostlinných drogách jsou uvedeny v rešeršní práci v příloze I. Následující tabulka 1 uvádí příklady šíře aplikačních moţností kapilární ITP pro analýzu vzorků přírodního původu. Tabulka 1: Příklady aplikací kapilární ITP ANALYZOVANÉ LÁTKY ZDROJ REF. POZN. organické, anorganické kyseliny víno 25 pouţita UV i vodivostní detekce chinin tonic. bylinné nápoje 26 + stanovení v moči isochinolinové alkaloidy rostliny čeledi 27 Papaveraceae ephedrin, pseudoephedrin, methylephedrin, methylpseudoephedrin, Ephedra 28 18

phenylpropanolamin, norpseudoephedrin alkaloidy Fumaria parviflora, 29 uţití i HPLC Fumaria capreolata glycyrrhizin lékořice 30 kávová kyselina, chlorogenová kyselina, luteolin, kaempferol, isokvercitrin, rutin Sambucus nigra 31 v extraktu analyzován pouze rutin pelargonidin, cyanidin, delphinidin, Polygonum cuspidatum 32 malvidin + jejich glykosidy dusičnany, sírany různé rostlinné 33 materiály sloučeniny platiny trávy ošetřené solemi platiny 34 kvantifikace adsorpční voltametrií fumarová kyselina jablečný dţus 35 ITP-CZE Cl,SO 2 4,PO 3 4, citronová kyselina, pomerančový dţus 36 jablečná kyselina, mléčná kyselina rutin, quercetin, isoquercitrin, quercitrin, Hypericum perforatum 37 ITP-CZE hyperosid, chlorogenová kyselina isocitronová kyselina citronový dţus 38 uţití i HPLC octová kyselina, citronová kyselina, jablečná kyselina, šťavelová kyselina tabák 39 4.3 Stanovení tetryzolinu a antazolinu v HVLP metodou kapilární izotachoforézy Cílem práce (která se poněkud vymyká hlavní náplni disertační práce, neboť se v tomto případě nejedná o látky přírodního původu) byla optimalizace a validace podmínek pro ITP hodnocení obsahu farmaceuticky významného sympatomimetika tetryzolinu a antihistaminika antazolinu v nosních a očních kapkách. Tetryzolin jako periferní α- sympatomimetikum vyvolává stimulaci sympatického nervstva má rychlý a výrazný vazokonstrikční účinek na sliznice. Vyuţívá se především k dekongesci sliznic, při zánětech horních cest dýchacích. Tetryzolin se pouţívá také v oftalmologii. Po oční 19

aplikaci vede k vazokonstrikci především spojivky a jeho hlavní indikace v této oblasti jsou alergické neinfekční konjunktivitidy a oční hyperémie. Antazolin kompetitivně antagonizuje účinek histaminu na H 1 receptorech. Patří mezi sedativní antihistaminika. Hlavní pouţití v oftalmologii (v kombinaci s tetryzolinem) jsou akutní i chronické alergické konjunktivitidy (zvláště u alergické sezónní rinitidy). Vzhledem k tomu, ţe jedno z analyzovaných HVLP byl sloţený přípravek obsahující obě léčivé látky (Spersallerg kapky) bylo nutné aby operační systém umoţňoval vzájemnou separaci obou látek. Vliv koncentrace LE iontu (K ), typ protiiontu (pikolinát, acetát) a typ TE, stejně tak jako velikost separačního a detekčního proudu byl sledován vzhledem k účinnosti separace, tvaru detekované ITP zóny, citlivosti stanovení a celkové doby trvání analýzy. Z těchto hledisek se ukázal jako optimální elektrolytový systém obsahující 5 mm pikolinát draselný a 5 mm kyselinu pikolinovou o ph 5,37 (LE) a 10 mm kyselinu mravenčí o ph 2,6 (TE). Obě látky migrovaly korektně izotachoforeticky, detekované zóny byly od sebe náleţitě separované, pravoúhlé a tudíţ vhodné ke kvantitativnímu hodnocení. Vzhledem k pouţití univerzální konduktometrické detekce byla délka ITP zón v sekundách (t) brána jako kvantitativní parametr a kalibrační závislost vyjádřena jako funkce délky zóny na koncentraci analytu t f(c). Lineární rozsah pro jednotlivá léčiva byl v rozmezí 5 40 mg/l s korelačním koeficientem 0,9999. Opakovanou analýzou (n = 6) kalibračního roztoku (20 mg/l příslušné látky) byla zjištěna RSD hodnota v rozmezí 1,2 2,3%, coţ ukazuje na vhodnost pouţitého ITP elektrolytového systému. Výsledky stanovení obsahu vyvinutou ITP metodou byly ve shodě s deklarovaným obsahem léčivých látek a reprodukovatelnost měření vyjádřená pomocí RSD v % ze šesti po sobě následujících měření byla v rozmezí 0,9 2,4% pro příslušné HVLP. Vzhledem k tomu, ţe oficinální lékopisná metoda pro stanovení obsahu antazolinu (tetryzolin není v lékopisu vůbec uveden) je potenciometrická titrace, coţ je značně neselektivní metoda stanovení a rovněţ placebo jednotlivých lékových forem nebylo k dispozici, byla správnost výsledků ITP měření ověřena technikou standardního přídavku a vyjádřena v % jako výtěţnost (recovery). Hodnoty výtěţností pro analyzovaná léčiva byly v rozmezí 96,6 102,0 %, coţ ukazuje na vyhovující správnost navrţené ITP metody. Tato práce je náplní publikace, která je uvedena v příloze II. 20

4.4 Stanovení hydroxycitronové kyseliny v extraktu rostliny Garcinia cambogia kapilární izotachoforézou Kyselina hydroxycitronová (HCA) je jedna z hlavních obsahových látek plodů jihoindické rostliny Garcinia cambogia. Studie ze 70. let ukázaly, ţe (-)-HCA inhibuje citrátové štěpící enzymy, syntézu mastných kyselin v játrech krys. Další práce prozradily, ţe inhibuje lipogenezi a sniţuje syntézu cholesterolu. Zjistilo se také, ţe HCA způsobuje signifikantní redukci v příjmu potravy a příjmu tělesné váhy u pokusných krys. Má totiţ supresivní efekt na chuť k jídlu. Je to moţný kompetitivní inhibitor ATP citrát lyázy, enzymu zasahujícího do přeměny karbohydrátů na tuk u savců. Proto se tato látka v současné době vyuţívá při profylaxi a léčbě humánní obezity. Cílem práce byla optimalizace a validace podmínek pro ITP hodnocení obsahu HCA v extraktu rostliny a následně v HVLP Citrimax diet tablet. Hlavním cílem bylo nalézt takový optimální ITP systém, v kterém by bylo moţné vzájemně separovat HCA od samotné kyseliny citronové, která je v malém mnoţství v rostlině také přítomna. ITP operační systém byl optimalizován s ohledem na kvalitu separace obou kyselin, citlivost ITP stanovení a dobu trvání analýzy. Byly testovány rozličné elektrolytové systémy s Cl - ionty jako vedoucími ionty. Optimalizace zahrnovala pouţití několika druhů a koncentrací protiiontů (a tím ph vedoucího elektrolytu) a v návaznosti s tím různé sloţení koncového elektrolytu. Jako vhodné se jevily dva elektrolytové systémy obsahující 10 mm Cl - o ph 6,1 (upraveno protiiontem kreatininem) resp. o ph 4,1 (upraveno kyselinou ε- aminokapronovou) jako LE a 10 mm kyselinu sorbovou (ph 5,0) resp. 10 mm kyselinu benzoovou (ph 4,5). V těchto elektrolytových systémech byly izotachoforetické zóny obou kyselin separované a pravoúhlé. Analýza v systému se sorbovou kyselinou jako koncovým elektrolytem trvala o něco kratší dobu, a proto se tento systém jevil jako vhodnější. V takto optimalizovaném operačním systému bylo moţno rozdělit a detegovat i jiné polykarboxylové kyseliny - kyselinu šťavelovou a kyselinu jablečnou. Nevýhodou byla nemoţnost separace další všeobecně rozšířené vinné kyseliny od kyseliny citronové. Z velkého počtu látek testovaných jako standardy pohyblivosti ke zjištění efektivní pohyblivosti HCA se nejlépe osvědčila kyselina pikrová (pikrát). Kalibrační závislost HCA byla proměřena v koncentračním rozsahu 10 100 mg/l stejným způsobem jako v předchozím případě v obou elektrolytových systémech. Opakovanou analýzou (n = 6) kalibračního roztoku (25 mg/l) byla zjištěna RSD hodnota 1,8 %, coţ ukazuje na vhodnost pouţité ITP metodiky. Metoda byla poté pouţita ke stanovení obsahu HCA v extraktu 21

rostliny Garcinia cambogia a v HVLP Citrimax diet tablet. Výsledky stanovení obsahu vyvinutou ITP metodou byly ve shodě s deklarovaným obsahem HCA. Správnost metody byla poté ověřena analýzou pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie a výsledky obou metod byly v dobré shodě. Detailní popis problému, stejně tak jako získané hodnoty uvedených validačních parametrů, jsou uvedeny v publikaci zařazené v příloze III. 22

5 KAPILÁRNÍ ZÓNOVÁ ELEKTROFORÉZA (CZE, CE) 5.1 Základní popis metody Jak jiţ bylo řečeno, migračním prostředím je při CZE jediný pracovní elektrolyt, který zaujímá celý migrační prostor. Jeho sloţení je všude stejné, v důsledku toho je v celé kapiláře konstantní elektrické pole. Základní elektrolyt má mít takové vlastnosti, aby umoţnil maximalizovat rozdíly v efektivních pohyblivostech analyzovaných látek. Za těchto podmínek kaţdá látka analyzované směsi migruje konstantní rychlostí, jejíţ velikost je určena příslušnou efektivní pohyblivostí a intenzitou elektrického pole. Zóny jednotlivých látek se během analýzy od sebe vzdalují a výsledným efektem je jejich rozdělení. Tento fenomenologický popis charakterizuje separační proces kapilární zónové elektroforézy (CZE, CE) 1-3. Separace je realizována v křemenné kapiláře vnitřního průměru 5-100 m a délky 20-100 cm separačním napětím o velikosti 5-30 kv. V kapilární zónové elektroforéze se vyuţívá dvou transportních jevů: - elektroforetické migrace iontů - elektoosmotického toku kapaliny (EOF) Elektroosmotický tok konstantním příspěvkem ovlivňuje pohyb částic [40]. Je způsoben přítomností nabitých silanolových skupin na vnitřním povrchu nepokryté křemenné kapiláry. Negativní náboje těchto skupin přitahují kationty tlumivého roztoku a dochází ke vzniku elektrické dvojvrstvy přilehlé ke stěně kapiláry. Hydratované kationty migrují směrem ke katodě a strhávají s sebou roztok v kapiláře (obr. 2). 23

Obr. 2 Elektroosmotický tok Velikost EOF je závislá na velikosti zeta potenciálu elektrické dvojvrstvy vytvořené na rozhraní proudící kapaliny a stěny kapiláry. Rychlost EOF je dána vztahem [3]: - permitivita roztoku - elektrokinetický potenciál E intenzita elektrického pole - viskozita roztoku.. E v Zeta potenciál a tedy i EOF jsou závislé na ph. Při ph 2 je tok téměř nulový a se vzrůstem ph se zvyšuje (dochází k významnějšímu nahrazování H + iontů na vnitřním povrchu kapiláry za ionty tlumivého roztoku (obr. 3). Obr. 3 Vliv ph na vnitřní povrch kapiláry 24

Elektroosmotický tok směřuje od anody ke katodě a jiţ při neutrálním ph nabývá rychlosti, která převyšuje elektromigraci většiny aniontů, takţe anionty putují paradoxně ke katodě. Výsledná rychlost pohybu aniontů a kationtů je dána vektorovým součtem jejich migrační rychlosti a rychlosti pohybu EOF. Neutrální částice tudíţ migrují rychlostí odpovídající rychlosti EOF, anionty jsou v závislosti na velikosti náboje vymývány jako poslední. Kationty, které se pohybují ve směru EOF, jsou vymyty jako první [3]. Základní separační princip CZE je znázorněný ve schématu na obrázku 4. Obr 4: Princip CZE separace látek Velikost efektivní pohyblivosti, která je základem selektivní separace analyzovaných látek, je ovlivňována nejen hodnotou ph základního elektrolytu, ale můţe být také cíleně modifikována přídavkem komplexujících činidel (ligandu resp. centrálního iontu), tvorbou inklusivních komplexů s cyklodextriny nebo crown-ethery, organického rozpouštědla, nebo tvorbou iontových asociátů s opačně nabitými ionty s vyšším nábojem. Výrazné ovlivnění separace představuje modifikace EOF generovaného na silanolových skupinách vnitřního povrchu křemenné kapiláry. EOF můţe být zpomalen (vyšší koncentrace BGE, přídavek organického rozpouštědla), zastaven (kovalentní nebo dynamické pokrytí) nebo otočen směrem k anodě (CTAB). Vzorek nadávkovaný do separační kapiláry jako krátký, pravoúhlý puls je v průběhu analýzy zřeďován a dispergován celou řadou faktorů - joulovým teplem generovaným při průchodu 25

elektrického proudu, prostou difúzí, interakcemi s kapilární stěnou a elektromigrační disperzí. Vzhledem k tomu má detekovaná zóna profil Gausovy křivky. Velikost vlivu elektromigrační disperze je srovnatelná s ostatními faktory za předpokladu, ţe koncentrace analytu je nejméně stokrát menší neţ koncentrace BGE, v opačném případě jsou detekované píky velmi asymetrické buď na čelním nebo zadním rozhraní 1,41. Co se týče instrumentálního uspořádání, kaţdé zařízení musí obsahovat zdroj vysokého napětí, vstupní a výstupní nádobky, vstupní anodu a uzemněnou katodu, separační kapiláru s detekčním okénkem, detektor a zařízení pro záznam analytického signálu [17] (obr. 5). Dávkování vzorku do kapiláry má vliv na kvantitativní výsledky měření. Obecně lze rozlišit dva způsoby dávkování hydrodynamické a elektromigrační (obr. 6). Hydrodynamické dávkování spočívá ve vtlačování úzkého sloupce kapalného vzorku do kapiláry vlivem tlakových rozdílů podél kapiláry. Tento způsob dávkování je zaloţen na aplikaci určitého objemu vzorku, tudíţ efektivita dávkování je stejná pro kationty, anionty a neutrální částice. Vyuţívá se různých mechanismů dávkování pomocí tlaku, pouţití vakua, samospádové dávkování vyuţívající tzv. sifonového efektu. Hydrodynamický způsob dávkování se uţívá především v kapilární zónové elektroforéze a micelární elektrokinetické chromatografii. Elektromigrační dávkování spočívá v tom, ţe anodický konec kapiláry se přesune z nádobky s pracovním elektrolytem do nádobky se vzorkem, přičemţ dávkovací napětí je niţší neţ je pracovní a čas aplikace je krátký. Tento způsob je zaloţen na elektroforetické pohyblivosti jednotlivých částic vzorku. Je to jediný moţný způsob dávkování vzorku v kapilární gelové elektroforéze [17]. 26

Obr. 5 Schéma instrumentálního uspořádání pro kapilární elektroforézu Obr. 6 Způsoby dávkování v kapilární elektroforéze Detekce je realizována tak jako u většiny ostatních elektroforetických kapilárních technik metodou on-line, tedy přímo na separační kapiláře. Podobně jako v HPLC je 27

nejčastěji vyuţívána UV fotometrická absorpční detekce. Pro identifikaci píků se s výhodou pouţívá diode array detektor, který vyuţívá polychromatického paprsku. Výsledkem je trojrozměrný elektroforeogram, kde je pro kaţdý pík zachyceno celé spektrum a tím přispívá k přesnější identifikaci. Z dalších optických metod je vyuţívána fluorescenční detekce, zejména při pouţití laseru jako zdroje primárního záření jsou dosahovány extrémně nízké detekční limity 42-45. Problémy spojené s kombinací CE s hmotnostní spektrometrií byly z velké části vyřešeny intenzivním výzkumem v této oblasti, takţe i tato detekční technika umoţňující nejen kvalitativní a kvantitativní analýzu, ale především získání strukturálních informací o struktuře neznámé látky, je v současnosti běţně realizována a komerční instrumentace je dostupná 11-13. Druhou skupinu představují elektrochemické detekční techniky, a to zejména vodivostní a amperometrická detekce. Při vodivostní detekci (CD), která je téměř univerzální neselektivní technikou, je sledována vodivost (vyjádřená jako rozdíl mezi hodnotou odporu čistého BGE a odporu v zóně analytu R 0 -R). Při amperometrické detekci dochází k redoxní reakci analytu na pracovní elektrodě detekční cely a vznikající elektrochemický proud je konvertován na napětí, které je registrováno jako výstupní signál detektoru. Aplikační moţnosti CZE jsou v dnešní době s rozvojem instrumentálního vybavení prakticky neomezené. CZE nachází uplatnění v analýze aminokyselin, peptidů, proteinů (určení aminokyselinového sloţení hydrolyzátu neznámých proteinů, stanovení sekvence aminokyselin v bílkovinách, peptidové mapy apod.), v analýze nukleotidů, nukleových kyselin (určování sekvencí bazí v molekule DNA), v analýze tělních tekutin (separace sérových bílkovin, monitorování lékových hladin, stanovení toxických agens) a v neposlední řadě v analýze léčiv, při stabilitních studiích či v analýze potravin. Kapilární zónová elektroforéza se také ve velké míře s výhodou vyuţívá ke stanovení látek přírodního původu, o čemţ svědčí několik dostupných rešeršních prací [46-49]. 5.2 Způsoby ovlivňování elektroforetické pohyblivosti analytů u CZE Při analýze směsi látek je potřeba maximalizovat rozdíly v migračních časech všech nebo alespoň hlavních komponentů vzorku. Jedna z cest, jak toho dosáhnout, je pouţití delší kapiláry. Nevýhodou v tomto případě je prodlouţení doby analýzy. K tomuto kroku se přistupuje aţ po vyčerpání dalších moţností. Snahou je najít takové podmínky, aby rozdíly elektroforetických pohyblivostí mezi sousedními zónami byly co největší. Nejjednodušším krokem vedoucím ke změně elektroforetické pohyblivosti látek povahy 28

slabých kyselin a bazí je změna ph pracovního elektrolytu. Pří hledání optimálního ph pro separaci určitých látek je potřeba vycházet ze závislosti elektromigračních pohyblivostí těchto látek na ph pracovního elektrolytu. Vhodná hodnota ph je taková, při které je rozdíl pohyblivostí největší [17]. Dalším přístupem můţe být tvorba inkluzivních komplexů analytů s cyklodextriny přidanými do základního elektrolytu. Cyklodextriny jsou neionogenní oligosacharidy tvořené 6 8 molekulami glukózy, které vytvářejí dutý válec, na jehoţ obvodu jsou hydroxylové skupiny a vnitřní jádro zůstává hydrofobní. Do tohoto jádra mohou vstupovat hydrofobní skupiny a vznikají tak různě pevné hostitelské komplexy. Vzhledem k tomu, ţe hydroxylové skupiny na povrchu jsou chirální, vytváří cyklodextriny s chirálními separandy komplexy lišící se stabilitou, coţ umoţňuje jejich separaci. Jinou z moţností je tvorba iontových asociálů, která se vyuţívá ke sníţení rychlosti migrace analytů [3]. Ionty s vyšším nábojem vytváří díky silným coulombickým interakcím iontové asociáty s ionty opačného znaménka. Čím vyšší je náboj interagujících iontů, tím větší je sníţení pohyblivostí. Nejčastěji jsou pouţívány kyseliny a baze o vyšším náboji (např. kyselina citronová, kyselina fytová, spermin) [17]. Velký vliv můţe mít také přídavek nevodných rozpouštědel do základního vodného elektrolytu. Přídavkem nevodného rozpouštědla dochází ke změně solvatace separovaných iontů a ke změně viskozity elektrolytu. Tím dochází k ovlivnění iontové pohyblivosti, coţ můţe zlepšit separaci. Nejčastěji se vyuţívá methanol, ethanol, propanol, aceton, acetonitril a dimethylsulfoxid. Velikost efektivní pohyblivosti můţe být také cíleně modifikována přídavkem komplexujících činidel (ligandu resp. centrálního iontu). 5.3 Komplexace analytů jako prostředek k ovlivňování elektroforetické pohyblivosti U analyzovaných látek, které mohou vytvářet komplexy, můţe dojít vhodným přídavkem iontu kovu nebo ligandu k tlumivému roztoku ke zlepšení jejich separace. Elektroforetická pohyblivost vzniklých komplexů se podstatně odlišuje od pohyblivosti samotného analytu. Konstanta stability komplexu závisí na druhu kovu a druhu ligandu, coţ vede k vysoce selektivní analýze [3]. Takto lze vyuţít tvorbu komplexů při analýze kovů, kde se hledá vhodný ligand a jeho koncentrace na dosaţení úplné separace. Analogicky se hledá vhodný kov pro separaci ligandů. K interakci dvojice analytkomplexující činidlo dochází buď před započetím analýzy (tzv. pre-column komplexace), nebo k ní dochází aţ v průběhu analýzy, kdy je komplexující činidlo součástí BGE. 29

Schopnost těţkých kovů tvořit komplexy s vhodnými ligandy je velmi často vyuţívána při jejich stanovení kapilární elektroforézou. Prvky lanthanoidové řady tak mohly být detekovány po jejich reakci s kyselinou cyclohexano-1,2-diaminotetraoctovou přímou on column UV detekcí při 214 nm [50]. Zpětně bylo vyuţito přídavku Cu 2+ a Ni 2+ iontů do elektroforetického pufru pro separaci a identifikaci polyaminopolykarboxylových kyselin (EDTA, nitrilotrioctová kyselina, 1,2- diaminocyklohexanotetraoctová kyselina a diethylentriaminopentaoctová kyselina) [51]. Kapilární zónová elektroforéza tak nachází uplatnění při studiu konstant stability komplexů, jako třeba v případě komplexů Cu 2+ iontů s 1,10-phenanthrolinem a 2,2'- bipyridinem [52]. Tvorba chelátů byla rovněţ vyuţita ke stanovení Cr 3+ a Cr 6+ iontů v kontaminované půdě. K pre-column komplexaci byla pouţita kyselina 2,6- pyridindikarboxylová [53]. Tento ligand tvoří s prvky těţkých kovů (Cu 2+, Zn 2+, Ni 2+, Cd 2+, Mn 2+, Pb 2+, Fe 2+, Al 2+, Ca 2+ ) nabité aniontové komplexy, které je moţno pohodlně elektroforeticky stanovit [54]. Samostatnou kapitolu tvoří vyuţití schopnosti borátu komplexovat sloučeniny s volnými hydroxylovými skupinami, mezi které se řadí velké mnoţství látek přírodního původu. Výsledné komplexy borátu s polyhydroxy sloučeninami získávají záporný náboj potřebný pro elektroforetickou separaci. Nejjednodušším způsobem je pouţití borátového pufru, který má funkci jak samotného pufračního média, tak selektivního komplexotvorného agens. Podařilo se například separovat a stanovit osm katecholaminů v elektrolytu tvořeném 100 mm hydroxidem draselným a 200 mm kyselinou boritou [55]. Elektrolyt o sloţení tetraboritan sodný/hydroxid sodný umoţňoval separaci polyhydroxyalkaloidů tzv. kalysteginů a jejich stanovení v rostlinách Calystegia septum a Atropa belladonna [56]. Takto se dají stanovit i neutrální látky (např. monosacharidy), katecholy, nukleotidy [57], antidiabetikum miglitol [58] nebo celá řada přírodních flavonoidů (viz. dále). Stabilita vzniklých komplexů s borátem je závislá na ph prostředí (komplexy bývají v závislosti na druhu ligandu stabilní v alkalické oblasti ph). 5.4 Molybden, jeho oxosloučeniny a komplexotvorné vlastnosti Molybden (molybdaenum Mo) je kovový prvek VI B skupiny periodické soustavy prvků, který objevil v roce 1778 K.W. Scheele. Ve svých sloučeninách nabývá různých oxidačních čísel (II,III,IV,V,VI). Ve vyšších oxidačních stavech (IV-VI) se molybden vyskytuje ve formě oxosloučenin molybdenanů [Mo VI O 4 ] 2 ; poly- a heteropolymolybdenanů, a v komplexech ve formě Mo VI O 2, Mo V O, Mo V 2O 3, Mo V 2O 4, 30

Mo IV O, a Mo IV O 2 jako centrálních iontů [59]. Jednotlivé aniontové formy molybdenanů - jsou silně závislé na ph prostředí. Při ph 2 je molybdenan přítomný ve formě HMoO 4, při vyšší koncentraci jsou polyanionty uspořádány v podobě Mo 7 O 6-24 a HMo 7 O 5-24. Zvýšením - ph na hodnotu 6 anionty HMoO 4 postupně disociují na MoO 2-4. Při ph 6 9 jsou molybdenany kompletně přítomny ve formě MoO 2-4 nebo jako volné polyanionty [60]. Schopnost Mo(VI) sloučenin tvořit komplexní sloučeniny aniontového charakteru s látkami s funkčními OH-skupinami je známa uţ řadu let [61]. Tyto komplexy jsou obecně stabilnější neţ analogické komplexy s borátem (B(III)), který se pro tyto účely v kapilární elektroforéze hojně pouţívá. V roce 1971 prokázali Soni a Bartušek [62] pomocí spektrofotometrie a papírové elektroforézy, ţe MoO 2-4 sloučeniny reagují s 1,2- difenoly (jako je např. katechol, nebo pyrogalol) v neutrálních vodných roztocích za vzniku komplexních sloučenin podle následující rovnice. MoO 4 2-2- + 2H 2 L MoO 2 L 2 + 2H 2 O H 2 L - příslušné 1,2-difenoly 2- MoO 2 L 2 - vzniklé aniontové komplexy (charakterizované rovnováţnými konstantami logk 2 v rozmezí 5 6,5) V dalších letech byly intenzivně studovány komplexotvorné reakce Mo(VI) sloučenin s různými organickými ligandy obsahujícími OH-skupiny ve svých molekulách. Tyto studie byly často podněcovány zájmem o výzkum molybdenu jako důleţité součásti kofaktorů různých redoxních enzymů [63,64]. Byly publikovány studie zabývající se tvorbou stabilních aniontových komplexů Mo(VI) sloučenin se solemi kyseliny jablečné [65,66]. Podle autorů mohou mít komplexy strukturu mononukleární [MoO 3 (mal)] 3- či [MoO 2 (mal) 2 ] 4-, dinukleární [Mo 2 O 5 (mal) 2 ] 4-, nebo dokonce tetranukleární [Mo 4 O 11 (mal) 2 ] 4-. Byly také popsány struktury komplexů Mo(VI) sloučenin se solemi kyseliny citronové jako mononukleární [MoO 3 (cit)] 4- a dinukleární [Mo 2 O 5 (cit) 2 ] 4- formy komplexních sloučenin [67,68], dále struktury komplexů s cukry sorbosou a fruktosou [69], s galakturonovou a glukuronovou kyselinou [70] a kyselinou glukonovou [71]. U všech ligandů na cukerné bázi dochází díky přítomnosti většího mnoţství funkčních -OH skupin v jejich molekulách k tvorbě rozmanitých komplexů, jejichţ struktura je závislá na počtu a umístění těchto funkčních skupin v molekulách cukrů a na typu Mo (VI) sloučenin jako centrálních iontů. Přes všechny tyto poznatky se jeví oxosloučeniny Mo(VI), zejména 31

molybdenany, vhodné jako potenciální separační selektory pro analýzu polyhydroxysloučenin v kapilární zónové elektroforéze. O O O 2- Mo O O O Obr. 7: Pravděpodobná struktura aniontového komplexu molybdenanu s polyhydroxysloučeninami 5.5 Flavonoidy, jejich výskyt, vlastnosti, využití ve farmacii a možnosti jejich stanovení kapilární elektroforézou Flavonoidy v širším významu jsou často pouţívaný termín pro všeobecná rostlinná barviva, jsou odpovědné za barvu květů, plodů a někdy i listů. Příkladem mohou být ţluté flavonoidy (chalkony, aurony a ţluté flavonoly) nebo purpurové anthokyaniny. Flavonoidy přítomné v epidermálních celách listů zabezpečují ochranu listů před škodlivými vlivy UV záření. V současné době je známo okolo 4 000 flavonoidů biosyntetického původu vycházející ze stejného základního strukturního elementu, 2-fenylchromanového základu. Rozdělují se do několika tříd v závislosti na stupni oxidace centrálního pyranového kruhu, který můţe být otevřen a opětovně uzavřen za vzniku furanového kruhu (dihydrofuranony). Jedná se o 2-fenylchromony (flavony, flavonoly plus jejich dimerní sloučeniny, flavanony, dihydroflavonoly, isoflavony a isoflavanony), 2-fenylchromany (flavany, flavan-3-oly, flavan-3,4-dioly), chalkony, dihydrochalkony (pyranový kruh otevřený), aurony, anthokyaniny [21]. Nejrozšířenější skupinou flavonoidů jsou flavony a jejich deriváty, které jsou podstatou ţlutých a oranţových barviv. Podstatná většina nejznámějších flavonoidních látek má základní strukturu uvedenou na následujícím obrázku. 32

Obr. 8: Typická struktura flavonoidních sloučenin Flavonoidy tvoří jednu z největších skupin přírodních fenolů. V rostlinách se vyskytují zpravidla jako O-glykosidy. Jedna nebo více flavonoidních hydroxylových skupin se váţe poloacetalovou vazbou (nestálou v kyselém prostředí) s jedním či více cukry. Glykosylací se sníţí reaktivita flavonoidů a zvýší se rozpustnost ve vodě. Nejčastějším cukrem vyskytujícím se v molekulách flavonoidů je glukóza, běţně bývají přítomny i jiné cukry jako galaktóza, rhamnóza, xylóza a arabinóza. Často se také ve spojení s flavonoidy vyskytují di-, tri- či tetrasacharidy. U glykosidů se také setkáváme s jinou další modifikací a to acylací. Acylované glykosidy mají jednu nebo více hydroxylových skupin u cukrů derivatizovanou např. kyselinou octovou, ferulovou nebo kávovou. Jiným typem flavonoidních glykosidů jsou C-glykosidy, cukry se váţou v tomto případě přímo k flavonoidnímu jádru vazbou C-C, která je odolná v kyselém prostředí. Výskyt těchto C- glykosidů je však na rozdíl od O-glykosidů daleko menší. V posledních letech byl zaznamenán nebývalý zájem o biologické účinky flavonoidů, které jsou konzumovány s ovocem a zeleninou v poměrně velkém mnoţství. Zjišťovala se jejich prospěšnost nejen jako venofarmak a hepatoprotektiv, ale především z hlediska jejich antioxidační aktivity [73-75]. Struktura flavonoidů předurčuje tyto látky k zhášení volných radikálů, protoţe redukční potenciály radikálů flavonoidů jsou niţší neţ redukční potenciály alkyl peroxylových radikálů a superoxidového radikálu. To znamená, ţe flavonoidy mohou inaktivovat tyto radikály a předcházet zhoubným následkům jejich působení [76-77]. Strukturní podmínky, podmiňující antioxidační aktivitu rostlinných polyfenolů lze shrnout do tří kritérií [78]: 33

přítomnost o-dihydroxy seskupení na kruhu B, které zapříčiňuje vyšší stabilitu radikálové formy a spolupůsobí při delokalizaci elektronů; 2,3-dvojná vazba v konjugaci se 4-oxo funkcí v kruhu C je zodpovědná za delokalizaci elektronů z kruhu B antioxidační schopnost je závislá na struktuře z hlediska elektronové delokalizace aromatického jádra. Kdyţ tyto sloučeniny reagují s volným radikálem, vzniklý fenoxylový radikál je stabilizovaný rezonančním efektem aromatického jádra; 3- a 5-OH skupiny se 4-oxo funkcí v A a C kruhu jsou podmínkou pro maximální účinek zhášení radikálů; V praxi se s flavonoidy můţeme setkat ve formě sušených drog nebo jejich extraktů, stále více je nalézáme i v potravních doplňcích (nutraceutikách), ale i v některých léčivých přípravcích např.: flavonoidy citrusových plodů (Pericarpium aurantii amarum et dulce) hesperidin (2,3-dihydrodiosmin), diosmin (2,3-dehydrohesperidin) ke sníţení kapilární permeability a zvýšení rezistence této části cévního systému - diosmin, (Movene ), směs hesperidinu a diosminu (Daflon, Detralex ), případně směs s rutinem (Venophanol ). Rut OCH 3 Rut OCH 3 O O OH O O OH OH O OH O Hesperidin Diosmin Rutin (kvercetin 3-rutinosid) (Flos sophorae japonicae, Herba rutae, Herba fagopyri esculenti) se uţívá ve stejných indikacích jako flavonoidy citrusových plodů. Analog 3,4,7 -tris( -hydroxyethyl)rutosid) troxerutin má výrazně vyšší biologickou dostupnost (Cilkanol, Drisi-Ven, Troxerutin -ratiopharm, Venoruton ). Při ţilním městnání, edémech, těhotenských varixech od 17. týdne těhotenství, hematomech a hemeroidech. Samotný rutin je obvykle kombinován s kyselinou askorbovou, která potencuje jeho protektivní účinek na cévní stěnu (Ascorutin ) [79]. 34

CH 2 CH 2 OH O CH 2 CH 2 OH O O O CH 2 CH 2 OH O rut OH O Troxerutin Flavonoidy jsou za normálních podmínek látky elektricky neutrální. K jejich elektroforetickému stanovení se s výhodou uţívá borátového základního elektrolytu (tvořeného tetraboritanem sodným či kyselinou boritou) při ph v rozmezí 8,5 10,5 (tabulka 2). Borátový pufr v tomto případě figuruje nejen jako vlastní elektroforetické pufrační médium, ale také jako komplexotvorné agens, které s flavonoidy tvoří záporně nabité komplexy a tím umoţňuje jejich separaci ve směsi. V některých případech je součástí základního borátového elektrolytu určité mnoţství (obvykle v rozmezí 5 20%) organického rozpouštědla (methanol, acetonitril). Pouţívá se jednak ke zlepšení separační účinnosti a jednak zamezuje zpětnému vysráţení lipofilních flavonoidů v separační kapiláře. V případě stanovení dvou enantiomerů medikarpinu a vestitonu byl testován vliv přídavku hydroxypropyl-gama-cyklodextrinu na jejich separaci v základním elektrolytu [88]. Následující tabulka ukazuje přehledně široké moţnosti uplatnění kapilární elektroforézy v analýze těchto polyfenolických látek. Příklady některých aplikací kapilární elektroforézy pro stanovení flavonoidů v lékopisných rostlinných drogách jsou uvedeny v rešeršní práci v příloze I. 35

Tabulka 2: Vybrané parametry aplikací CZE v analýze flavonoidů ANALYT MATRICE ZÁKLADNÍ ELEKTROLYT REF. rutin borát, ph 10 80 polyfenoly, flavonoidy citronový dţus 35 mm tetraboritan sodný, ph hesperidin, neohesperidin, narirutin kaempferol-3-rutinosid, avicularin, isokvercitrin, kaempferol, kvercetin rutin, kvercitin, isohamnetin, genistein, diadzein a jejich glykosidy syntetické monohydroxyflavony, methylderiváty luteolinu flavon, rutin, katechin, kvercetin, myricetin biochanin A, daidzein, daidzin, genistein, puerarin medikarpin, vestiton pomerančový dţus 9,3 35mM tetraboritan sodný/5% acetonitril, ovocný dţus, víno 0,1 M boritá kyselina, ph 9,5 83 sójové maso Eucommia (listy), červené víno Puerariae radix ulmoides daidzein, rutin, kvercetin Ligustrum lucidum, rutin, kvercetin, hesperidin, hesperetin, isokvercitrin, naringin naringenin Cinnamomum camphora (listy) baicalein, baicalin, kvercetin Scutellaria baicalensis protopseudohypericin, pseudohypericin, protohypericin, hypericin, 200 mm boritá kyselina, ph 8,6 25 mm boritan sodný ph 9,5/methanol (4 : 1) 30mM Na 2 HPO 4, ph 8,85 NaH 2 PO 4 /30mM- 20 mm tetraboritan sodný, ph 10,1 25 mm borát (ph 10) + 2mM- hydroxypropyl-beta- cyklodextrin/20mm- hydroxypropyl-gama- cyklodextrin/10% methanol 81 82 84 85 86 87 88 100 mm borát, ph 9.0 89 potravní doplňky 0,1 M kyselina boritá, ph 10 90 (kořen) Hypericum perforatum (květy a listy) 100 mm borát, ph 9 91 50 mm octan amonný, 150 mm octan sodný v methanolu/ dimethylsulfoxidu/n- 92 36

hyperforin, adhyperforin methylformamidu (3:2:1, v/v/v) calycosin, licochalcon, Glycyrrhizae radix 100 mm kyselina boritá, ph licoisoflavon, liquiritin 10,5 apigetrin, isokvercitrin, luteolin-7-o-beta-glukosid, rutin epikatechin, katechin, rutin, apigenin, luteolin, kvercetin kvercetin, rutin, kvercitrin, kaempferol, katechin apigenin, apigenin-7-oglukosid, vitelin, luteolin-7-oglukosid, orientin, isoorientin, rutin, isorhamnetin-3-orutinosid Solidago gigantea (nať), 25 mm tetraboritan sodný/ Taraxacum officinale methanol (20%), ph 9,5 (listy), Morus nigra (listy) 93 94 Ginkgo biloba borát, ph 9,0 95 Morus alba (listy) 150 mm kyselina boritá, ph 10,0 Achillea setacea (nať) 25 mm tetraboritan sodný/ methanol (20%), ph 9,3 96 97 Další velmi uţívanou elektroforetickou technikou pro stanovení flavonoidů je micelární elektrokinetická chromatografie (viz. dále v tabulce 3). 5.6 Použití molybdenanu jako komplexujícího činidla v analýze polyhydroxysloučenin kapilární zónovou elektroforézou Jak jiţ bylo řečeno kyslíkaté sloučeniny molybdenu mohou tvořit záporně nabité komplexy se sloučeninami obsahujícími ve své molekule více hydroxylových funkčních skupin. Této vlastnosti bylo vyuţito při stanovení přírodních polyhydroxysloučenin flavonoidů kapilární zónovou elektroforézou. Byl testován vliv přídavku molybdenanu sodného do základního elektrolytu na separaci vybraných sloučenin. Tato problematika tvořila v podstatě hlavní cíl disertační práce jako úplně nový poznatek v přístupu k analýze přírodních látek pomocí kapilárních elektromigračních metod. I přes výše zmíněné známé komplexotvorné vlastnosti Mo(VI) sloučenin, nebylo tohoto poznatku k ovlivnění elektroforetické separace látek ještě nikdy vyuţito a vliv těchto sloučenin na elektroforetickou separaci neutrálních přírodních látek dosud nebyl nezkoumán. V prvém případě byl sledován vliv přídavku molybdenanu na separaci vybraných derivátů skořicové kyseliny (ferulová, kávová, 3-hydroxyskořicová a skořicová). Tyto 37

látky byly pro začátek vybrány záměrně. Jako kyseliny mohou tyto sloučeniny v roztoku existovat při dostatečně vysokém ph ve formě anionu a tyto anionty lze separovat klasickou CZE. Existoval předpoklad, ţe za přítomnosti molybdenanu můţe docházet u některých aniontů organických kyselin selektivně ke vzniku molybdátových komplexů, coţ by mohlo pozitivně ovlivnit jejich vzájemnou separaci. Byl vybrán elektrolytový systém s MES (morfolinethansulfonová kyselina, pka 6,1). V tomto základním elektrolytu byl testován vliv ph, koncentrace MES a následně vliv koncentrace přidaného molybdenanu sodného. V elektrolytu o sloţení 25 mm MES/TRIS o ph 5,4 5,6 se podařilo látky separovat aţ na dvojici kyselin ferulová / kávová. Přídavkem molybdenanu do základního elektrolytu došlo jiţ při jeho relativně nízké koncentraci (0,1 mm) k patrnému ovlivnění separace těchto dvou kyselin, a to změnou migrace kyseliny kávové, u které lze díky její struktuře (kyselina 3,4-dihydroxyskořicová) předpokládat schopnost tvořit s molybdenanem komplex s vyšším záporným nábojem, neţ kterým disponuje její vlastní anion, existující v této oblasti ph. Při koncentraci molybdenanu 0,15 mm byly všechny kyseliny rozděleny, a to uţ při ph kolem 5,5. Jiţ bylo řečeno, ţe molybdenan při nízké koncentraci a při hodnotách ph > 5 existuje převáţně ve formě monosloučeniny MoO 2-4, a proto můţe mít vzniklý komplex strukturu uvedenou na obrázku 7. Další zvýšení koncentrace molybdenanu na 0,2 mm vedlo ke zhoršení symetrie píku kávové kyseliny a následně k nedokonalé separaci od 3-hydroxyskořicové kyseliny. Na příkladu těchto kyselin bylo demonstrováno, ţe přítomnost molybdenanu v základním elektrolytu podstatně má podstatný vliv na migraci a tvar píku dihydroxyderivátu kyseliny kávové. V případě analýzy flavonoidních látek se muselo k problematice přistupovat s tím, ţe flavonoidy jakoţto aromatické hydroxysloučeniny jsou mnohem slabšími kyselinami neţ karboxylové kyseliny a tudíţ přidaný molybdenan by měl mít zásadní vliv na jejich migraci, pokud dojde ke tvorbě příslušných aniontových komplexů. Testovaná směs standardních látek obsahovala pět flavonoidů (apigenin, rutin, hyperosid, kvercetin a luteolin) a dvě fenolické kyseliny (p-kumarová a chlorogenová). Díky nepřítomnosti karboxylové skupiny v molekule flavonoidů jsou tyto látky daleko slabšími kyselinami neţ zmiňované hydroxyfenylkarboxylové kyseliny (pka hodnota fenolické skupiny nejjednoduššího 7-hydroxyflavonu je 7,39 [98]). S tímto ohledem byl testován elektrolyt obsahující HEPPSO (2-hydroxy-3-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]propansulfonová kyselina, pka 7,5) jako základní sloţku. Z důvodu limitované rozpustnosti flavonoidních látek ve vodě obsahovaly všechny testované roztoky 25 % methanolu a kyselost základního elektrolytu byla měřena jako zdánlivá (pseudo) ph hodnota značená jako ph*. 38

Opět jako v předchozím případě byl testován vliv ph*, koncentrace HEPPSA a mnoţství přídavku molybdenanu sodného na separaci výše uvedených látek. Podle předpokladů migrovaly v elektrolytovém systému (25 mm HEPPSO, ph* 7,4, upraveno pomocí TRIS) bez přítomnosti molybdenanu všechny flavonoidy nerozseparované ve směsi jako neutrální látky, došlo pouze k oddělení obou kyselin, které migrovaly jako anionty za směsí flavonoidů. Po přidání 0,5 mm molybdenanu do základního elektrolytu došlo k oddělení apigeninu od ostatních flavonoidů. Zřetelně oddělený pík apigeninu se objevil před směsnou zónou flavonoidů (apigenin, jako jediný z testovaných flavonoidních látek nedisponuje hydroxylovými skupinami v ortho-poloze, které mají nejvyšší sklon ke komplexaci). Optimální koncentrace molybdenanu pro separaci těchto látek byla 2 mm. Při této koncentraci došlo k rozdělení všech flavonoidů na základní linii. Jak se dalo podle struktury předpokládat, migrace apigeninu a p-kumarové kyseliny (4-hydroxyskořicová kyselina) nebyla přídavkem molybdenanu sodného do základního elektrolytu ovlivněna. V takto optimalizovaném elektrolytovém systému byla proměřena kalibrační závislost v koncentračním rozsahu 8 35 mg/l pro všechny testované látky. Vypracovaná metodika byla poté aplikována na analýzu některých flavonoidních látek v rostlinných extraktech: Matricaria recutita listy (apigenin a luteolin) a Hypericum perforatum nať (rutin a hyperosid). Vliv molybdenanu na separaci flavonoidních látek je v tomto případě podobný vlivu velmi často pouţívaného borátu. Důleţitým novým poznatkem byl fakt, ţe molybdenan ve srovnání s borátem působí komplexotvorně jiţ v daleko menších koncentracích a při niţších hodnotách ph (slabě kyselá neutrální oblast). Pro ilustraci separace flavonoidů bylo dosaţeno v základním elektrolytu o ph 7 7.5 za přítomnosti 2 mm molybdenanu, zatímco separace flavonoidů za pouţití borátu jako základního elektrolytu probíhá běţně aţ při ph hodnotách 9-11 a při daleko vyšších (25-100 mm) koncentracích komplexotvorného činidla (viz. tabulka 2). Vzhledem k tomu, ţe aromatické polyhydroxysloučeniny jsou v alkalickém prostředí (ve kterém projevuje borát komplexotvorné vlastnosti) náchylné k spontánní oxidaci atmosférickým kyslíkem, lze pouţitím molybdenanu jako komplexotvorného činidla při niţších hodnotách ph tuto oxidaci potlačit. Detailní popis vývoje metodiky včetně všech validačních parametrů jsou uvedeny v publikaci v příloze IV. 39

5.7 Stanovení manitolu a sorbitolu v infůzních roztocích metodou kapilární elektroforézy V této práci bylo vyuţito známé vlastnosti borátu tvořit záporně nabité komplexy s původně neutrálními polyoly. Komplexy vzniklé přímo v separačním mediu poté migrují vlastní elektroforetickou pohyblivostí a lze je tedy od sebe separovat. Vzhledem k tomu, ţe manitol ani sorbitol nemají ve své molekule chromofory a neabsorbují UV záření, bylo jejich následné stanovení realizováno metodou nepřímé detekce, kdy je monitorován UV signál absorbujícího spoluiontu základního elektrolytu a detekční signál analytu je vytvořen náhradou absorbujících iontů BGE za UV transparentní ionty analytu v detekční cele, coţ vyvolá sníţení monitorovaného signálu a zaznamenání negativního píku analytu. Je známo, ţe pouze analyty s hodnotou mobility blízkou mobilitě spoluiontu BGE jsou detekovány jako píky symetrické 1. Z tohoto důvodu je proto v praxi výhodné zvolit takový UV absorbující spoluiont, jehoţ efektivní mobilita bude co moţná nejbliţší efektivní mobilitě dvojici iontů analytů a který zároveň disponuje vysokým molárním absorpčním koeficientem při zvolené vlnové délce. Nejlepší výsledky byly získány uţitím 3-nitrobenzoátu jako spoluiontu v základním elektrolytu. Optimální elektrolytový systém obsahoval 50 mm borátový pufr (ph 9,3, upravené pomocí triethylaminu) + 10 mm 3- nitrobenzoát. V takto optimalizovaném elektrolytovém systému byla proměřena kalibrační závislost v koncentračním rozsahu 0,2 2 mg/ml pro obě testované látky. Zvolená vlnová délka pro nepřímou detekci byla 215 nm, délka analýzy nepřesáhla 13 minut. Vypracovaná metodika byla poté aplikována na analýzu manitolu a sorbitolu ve farmaceutických infůzních roztocích. Správnost metody byla ověřena paralelně provedenou lékopisnou metodou (jodometrická titrace) a výsledky obou metod byly statisticky porovnány pomocí Studentova t-testu. Detailní popis vývoje metodiky včetně všech validačních parametrů jsou uvedeny v publikaci zařazené v příloze V. 40

6 MICELÁRNÍ ELEKTROKINETICKÁ CHROMATOGRAFIE (MEKC) 6.1 Základní popis metody Micelární elektrokinetická chromatografie 1-3 je realizována v kontinuálním základním elektrolytu, jehoţ sloţení je v celé kapiláře konstantní, ale který obsahuje navíc povrchově aktivní aniontovou, kationtovou nebo nenabitou látku tenzid, v koncentracích umoţňujících tvorbu micel, které se chovají jako pseudostacionární fáze. Vedle elektroforetického separačního principu se zde uplatňuje také princip chromatografický, kdy se látka rozděluje na základě její lipofility mezi základní elektrolyt (mobilní fáze) a vnitřek micely (pseudostacionární fáze). Poprvé byla tato metodika představena Terabem a spol. v roce 1984 [14]. Její hlavní předností oproti jiným elektroforetickým technikám je moţnost separace nabitých, ale i nenabitých solutů. Při koncentraci nad kritickou micelární koncentrací (CMC) tvoří tenzid micely, ve kterých jsou molekuly nejčastěji orientovány tak, ţe hydrofobní řetězce směřují do středu, aby se vyhnuly interakci s hydrofilním pufrem, a polární nabité části jsou na povrchu micely. (Obr. 9) Nad touto koncentrací jsou monomery tenzidu v rovnováze s micelami. Kromě CMC jsou micely charakterizovány tkzv. agregačním číslem, coţ je počet molekul tenzidu podílejících se na struktuře micely. Na příkladu velmi často uţívaného aniontového tenzidu dodecylsulfátu sodného (SDS) se dá vysvětlit podstata MEKC separace. Aniontový charakter síranové skupiny SDS zapříčiňuje, ţe surfaktant a micely mají elektroforetickou pohyblivost opačnou, neţ je směr vlastního elektroosmotického toku. Ve výsledku monomery tenzidu a micely putují díky silnějšímu EOF ke katodě, ale menší rychlostí neţ je rychlost EOF. Jestliţe jsou uţity kationtové tenzidy, je stěna kapiláry potaţena jejich pozitivně nabitými částicemi, coţ mnohdy vede ke zvratu směru EOF. Je proto nezbytné obrátit polaritu elektrod k zajištění migrace kationtových micel. Během MEKC separace dochází k distribuci analytů mezi hydrofobním vnitřkem micely a hydrofilním pufrem. (Obr. 10) 41

A B Obr. 9: Struktura micely s hydrofobní dutinou (A), s hydrofilní dutinou (B) Obr. 10: Znázornění distribuce analytů (A) na základě jejich hydrofobicity u MEKC Analyty, které vůbec nevstupují do vnitřku micel (silně hydrofilní látky) migrují rychlostí odpovídající elektroosmotickému toku, u o, a jsou detegovány jako první v retenčním čase t m. Analyty, které jsou micelami kompletně solubilizovány (vysoce hydrofobní látky) migrují rychlostí samotných micel, u c, a vstupují do detektoru jako poslední v čase t c [14]. Výsledná rychlost micel je definována jako: 42