Chirální separace v CE Chiralitu vykazují jak organické sloučeniny tak anorganické sloučeniny. Projevuje se existencí dvou konstitučně identických molekul (enantiomerů), které se liší pouze ve vzájemném uspořádání atomů a vazeb v prostoru. Enantiomery mají v achirálním prostředí shodné fyzikálně-chemické vlastnosti. Vykazují odlišné biologické, toxikologické a farmakologické vlastnosti. Potřeba účinných analytických technik, které umožní separaci jednotlivých enantiomerů a jejich stanovení. Klepnutím lze upravit styl předlohy podnadpisů. S-enantiomer: teratogenní účinky R-enantiomer: sedativum 1.3.2010 R-enantiomer je sedativum S-enantiomer S-enantiomer má teratogenní účinnky
Enantioselektivní rozpoznávání patří mezi základní vlastnosti přírody, protože enantiomery vykazují shodné vlastnosti pouze v izotropním prostředí, zatím v chirálním (což je obecné prostředí organismů) vykazují chování odlišné. Pro úspěšnou separaci enantiomerů je nutné v separačním prostředí vytvořit chirální (stereoselektivní) prostředí. Dalglish model 3-bodové interakce Pro enantioselektivní rozpoznání je nutné, aby analyt současně interagoval třemi různými interakceni s chirálním selektorem (CS) a alespoň jedna interakce s CS musí být stereoselektivní. Má-li dojít k separaci enantiomerů, pak každý z nich musí interagovat různě silně. Síly, které se podílejí na stereoselektivní interakci mohou být jak přitažlivé, tak odpudivé. 1.3.2010
Typy interakcí podílejících se na molekulárním rozpoznávání Pro uskutečnění chirálních separací se v praxi používají separační metody GC, LC, SFC, CE a v poslední době se objevují práce využívající k stereoselektivní diskriminaci MS. 1.3.2010
Způsoby realizace enantioselektivní prostředí v moderních separačních technikách 1.3.2010
Chirální separace uskutečňované kapilární elektroforézou Nepřímá chirální separace k tvorbě diastereomerů mezi CS a separovanými enantiomery probíhá před separací (nejčastěji jako derivatizace chirálním derivatizačním činidlem). Separace probíhá v achirálním prostředí. Přímá chirální separace k tvorbě diastereomerů dochází během separace interakcí separovaných enantiomerů s chirálním selektrorem, který je součástí pracovního elektrolytu. Separace probíhá v chirálním prostředí. Nepřímé separace vyžadují nutnost derivatizace činidlem, které musí být čistým enantiomerem, derivatizační krok je nutné validovat a analyty musí mít vhodné funkční skupiny pro derivatizaci. Např. Marfyho činidlo (1-fluoro-2,4-dinitrofenyl-5-L-alaninamid), GITC (2,3,4,6-tetra-Oacetyl- -D-glukopyranozylizothiokyanát). Přímé separace vyžadují přítomnost CS v pracovním elektrolytu, případně může být součástí gelové matrice, nebo být navázán na stěnu kapiláry. Pro úspěšnou přímou chirální separaci je nutné najít vhodný CS a optimalizovat podmínky, tak aby rozlišení bylo vhodné pro kvantifikaci každého enantiomeru zvlášť. V přímých chirálních separacích jsou enantiomery separovány na základě různých konstant stability vzniklých přechodných stabilních diastereomerních komplexů s chirálním selektorem. 1.3.2010
Nutné podmínky pro přímé chirální separace Selektor musí být čistým enantiomerem a musí být k dispozici v dostatečné čistotě. Se selektorem musí interagovat oba enantiomery Rychlost tvorby diastereomerních komplexů mezi enantiomery a chirálním selektorem musí být dostatečně velká Diastereomerní komplexy se musí lišit v konstantách stability. Chirální selektory využívané pro přímé CE separace: 1. Cyklodextriny a jejich deriváty, 2. Antibiotika (makrocyklické, glykopeptidy, makrolidy...) 3. Crown ethery 4. Proteiny 5. Polysacharidy 6. Komplexy přechodných kovů s chirálními ligandy (aminokyselina, peptidy apod.) 7. Chirální tenzidy (žlučové kyseliny, deriváty aminokyselin apod.) 1.3.2010
Chirální selektory používané v CE (přímé separace) 1. Nativní cyklodextriny Cyklodextriny (CD) jsou produkty enzymatické degradace škrobu glukosyltransferázami bakterií Bacilus macerans. Jsou to cyklické oligosacharidy složené ze 6 a více D-glukopyranosových jednotek spojených α-1,4 vazbami. Nejčastěji užívané CD mají 6 (α), 7 (β) a 8 (γ) glukosových jednotek v kruhu. 1.3.2010
Vnitřní kavita má hydrofóbní charakter a vnější obal má polární hydrofilní charakter. Mechanismy interakcí CD s enantiomery - Inkluzní komplexace - Interakce na povrchu 1.3.2010
Příklady separací chirálních sloučenin s cyklodextriny R,S-Tamsulosin Sulfatovaný-b-CD jako chirální selektor 1.3.2010
1.3.2010 Chirální selekotor S-beta-cyklodextrin
Chirální separace s využítím makrocyklických antibiotik v CE Makrocyklické antibiotika - chirální selektory nesoucí několik stereoselektivních center Vankomycin Teikoplanin Ristocetin, Rifamicyn, (Avoparcin, Balhymicin) Teicoplanin Vankomycin Rifamycin
Ristocetin Nejpoužívanějším makrocyklickým antibiotikem pro chirální separace v CE je vankomycin.
Fyzikálně chemické vlastnosti vankomycinu Charakteristika Vankomycin Molekulová hmotnost 1449 Počet stereogenních center 18 Počet mikrocyklů 3 Počet hydroxylových skupin 9 (z toho 3 fenolické) Počet aminoskupin 2 Počet karboxylových skupin 1 Počet amido skupin 7 Počet aromatických jader 5 pi 7,2 Relativní stabilita až 2 týdny pk a 2,9;7,2;8,6;9,6;10,5;11,7 Vankomycin se používá nejčastěji pro chirální separace karboxylových kyselin. Vankomycin vykazuje i několik nevýhod pro CE: Poměrně silná absorpce UV záření v oblasti 190 až 260 nm Sorpce na křemennou kapiláru Omezená stabilita v extrémních hodnotách ph
Uvedené nevýhody je možné odstranit: Separací v kapilárách s kovalentním pokrytím omezení sorpce -> zvýšení účinnosti separace Využití techniky částečného plnění kapiláry vankomycinem -> možnost UV detekce separovaných analytů v oblasti 190-260 nm. Základní princip techniky částečného plnění Pracovat v pokryté kapiláře, kde je potlačení EOF. V kyselém prostředí je vankomycin kladně nabitý (ph 4 7), karboxylové kyseliny jsou v tomto ph záporně nabité. Do kapiláry se dávkuje pufr s vankomycinem po detekční okénko (nutno experimentálně změřit čas a tlak potřebný k nadávkování pufru s vankomycinem po detekční okénko). Po vložení negativní polarity, vankomycin migruje směre od detekčního okénka k inletu a karboxylová kyselina migruje v opačném směru. V průběhu migrace enantiomerů přes zónu vankomycinu dochází ke stereoselektivní interakci
Technika částečného plnění je použitelná pro jakékoli absorbující nebo pro detekci nevhodné adititivum v pracovním elektrolytu.
Porovnání s cyklodextriny
Využití crown-etherů pro chirální separace ( )-(18-Crown-6)-2,3,11,12-tetracarboxylic acid Crownethertetrakarboxylová kyselina (CETK) je použitálná pouze pro separace chirální primárních aminů (aminokyseliny, dipeptidy, léčiv). Používá se buď samostatně nebo v kombinaci s nenabitými cyklodextriny. CETK je možné využít ve vodném i nevodném prostředí. Mechanismus separace spočívá v interakcí vodíků primární aminoskupiny s kyslíky polyetherovým kruhu pomocí vodíkových vazeb.
S polyetherovým kruhem komplexují také i některé kationty např. K + a NH 4 + Separační účinnost je možné zvýšit přídavkem cca 100 mm tetra-nbutylammonium perchlorátu jako podpůrného elektrolytu. Přídavke triethylaminu je možné v některých případech výrazně zvýšit rozlišení. Chirální separace s využitím mechanismu ligandové výměny Mechanismus ligandové výměny využívá tvorby ternární diastereomerních komplexů mezi komplexem kov (II, III) + chirální ligand (L-prolin, L-tartrát, L- aspartam) a separovanými enantiomery. Je nutné aby separovaném enantiomery ve své struktuře měli funknčí skupiny vhodné ke tvorbě ternárních diastereomerních komplexů.
Chirální tenzidy v CE Žlučové kyseliny je možné použít jako chirální selektory, které se chovají jako tenzidy. Mají schopnost tvořit micely. Díky chirálním centrům mohou interagovat jak s nabitými, tak nenabitými chirálními látkami. Kyselina cholová několik opticky aktivních center
Omezení použití žlučových kyselin pro chirální separace v CE žlučové kyseliny se rozpuštějí ve vodných pracovních elektrolytech pouze v alkalickém ph. Nejčastěji používáná oblast ph je 8 až 11. Přispívají v generaci Joulova tepla při průchodu proudu kapilárou Žlučové kyseliny se hodí k separaci pouze omezeného typu látek, které by měli mít planární strukturu.
Syntetické chirální tenzidy Pindolol
Využití proteinů pro chirální separace v CE Hovězí sérový albumin (BSA) Produkován v játrech, nejvíc zastoupený protein v séru savců. Monomerní a poměrně dobře rozpustný ve vodných elektrolytech. Obsahuje velké množství stereoselektivních center. Nevýhody: sorpce na stěnu kapiláry, absorpce UV záření hrozí možnost denaturace při vyšších teplotách, nebo při použití extrémních ph
Separace derivatů D,Ltryptofanu s pomocí BSA ph 7,4
Využití vaječného proteinu pro chirální separace