Identifikace aminokyselin a jiných organických strukturních jednotek v přírodních a syntetických peptidech technikou GC-MS.

HTML
DOWNLOAD

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Identifikace aminokyselin a jiných organických strukturních jednotek v přírodních a syntetických peptidech technikou GC-MS."

Libuše Pokorná
před 9 lety
Počet zobrazení:

1 Setkání Thermo Fisher Scientific, Tichonice 2010 Identifikace aminokyselin a jiných organických strukturních jednotek v přírodních a syntetických peptidech technikou GC-MS. Identification of amino acids and other organic units in natural and synthetic peptides by GC-MS. Zahradníčková H., Hušek P., Šimek P. Biologické centrum v.v.i. Akademie věd České Republiky Laboratoř Analytické Biochemie České Budějovice

Identification of amino acids and other organic units in natural and synthetic peptides by GC-MS.

2 BIOLOGICKÉ CENTRUM Praha 150km Budějovice ČESKÉ BUDĚJOVICE 280km 200km Munich Vienna

3 UNIVERZITNÍ KAMPUS S BIOLOGICKÝM CENTREM

4 PROČ STUDOVAT AMINOKYSELINY? AMINOKYSELINY = základní stavební jednotky života Chemie aminokyselin je nezbytná pro široké spektrum disciplin. Stanovení jednotlivých členůřady proteinových AAs i neproteinových AAs je vzhledem k jejich strukturním odlišnostem velmi obtížný úkol. Ačkoli je analytika AAs studována již po desetiletí, neexistuje rutinní robustní univerzálně použitelná metoda stanovení AA. Matrice, v nichž jsou aminokyseliny studovány: - nejrůznější biologické tekutiny - nejrůznější tkáně živočichů - bakterie a jiné nižší organismy - léčiva, agrochemikálie - potraviny, nápoje, aromatické látky - voda - půda, sedimenty - meteority, lunární vzorky - nově syntetizované peptidy a proteiny - fosilie, kosterní nálezy

Ačkoli je analytika AAs studována již po desetiletí, neexistuje rutinní robustní univerzálně použitelná metoda stanovení AA.

5 CHIRALITA CHIRÁLNÍ je molekula mající zrcadlový obraz, který se s ní nekryje. CHIRALITA je neoddělitelnou vlastností základních stavebních jednotek života aminokyselin, cukrů a tedy i peptidů, proteinů a polysacharidů. ENANTIOMERY = molekuly, které jsou zrcadlovými obrazy jedna druhé. Strukturně se vzájemně liší absolutní konfigurací. DIASTEROIZOMERY = stereoizomery, které nejsou enantiomery, mají nejméně dvě chirální centra. CH 3 COOH CH 3 COOH NH 2 H NH 2 H L-alanin D-alanin (2S)-2-aminopropanová kyselina (2R)-2-aminopropanová kyselina

polysacharidů. ENANTIOMERY = molekuly, které jsou zrcadlovými obrazy jedna druhé. Strukturně se vzájemně liší absolutní konfigurací.

6 DŮSLEDKY ODLIŠNÉ STRUKTURY ENANTIOMERŮ Odlišné struktury enantiomerů způsobují různé účinky enantiomerů: toxikologické S-thalidomid teratogen, R-thalidomid sedativum organoleptické D-Leu, L-Phe sladký, L-Leu, D-Phe hořký biologické S-thyroxin-hormon štítné žlázy, R- thyroxin-snižuje hladinu cholesterolu D-AAs v potravinách jsou hůře stravitelné, než L-AAs celářada dalších účinků, i dosud nepoznaných

L-Phe sladký, L-Leu, D-Phe hořký biologické S-thyroxin-hormon štítné žlázy, R- thyroxin-snižuje

7 ENANTIOSELEKTIVNÍ METODY ANALÝZ AAs A) metody enzymatické - D-aminooxidázy reagují selektivně s D-aminokyselinami B) metody chromatografické HPLC, GC, TLC nepřímé metody: racemická směs + chirálníčinidlo = pár diastereomerů separován na nechirální fázi přímé metody: rozlišení enantiomerů pomocí chirálního selektoru, který může být součástí stacionární fáze nebo mobilní fáze C) ostatní - CE, SFC, rentgenová krystalografie, NMR

= pár diastereomerů separován na nechirální fázi přímé metody: rozlišení enantiomerů pomocí chirálního

8 GC SEPARACE ENANTIOMERŮ AAs GC metody výborné dělení i účinnost, rychlé AAs je nutno převést na těkavé deriváty Klasické postupy - karboxyskupinu je nutno esterifikovat za bezvodých podmínek, aminoskupinu acylovat anhydridy nebo acylhalogenidy za bezvodých podmínek nepřímé metody jedno z činidel musí být chirální přímé metody používají se chirální stacionární fáze (Chirasil-L-Val, cyklodextriny), též v kombinaci s MS Reakce s chlormravenčany acylace i esterifikace probíhá tímtéžčinidlem v jednom kroku ve vodněorganickém prostředí

podmínek nepřímé metody jedno z činidel musí být chirální přímé metody používají se chirální stacionární fáze (Chirasil-L-Val,

9 DERIVATIZACE ALKYLCHLORMRAVENČANY (ALKYLCHLORFORMIÁTY) Zahradníčková H., Hušek P., Šimek P., Hartvich P., Maršálek B., Holoubek I., Anal Bioanal Chem. 388 (2007) Hušek P., Šimek P.,Hartvich P., Zahradníčková H., J. Chromatogr.A (2008) Hušek P., Šimek P., Zahradníčková H., Anal.Chem. 80 (2008) Zahradníčková H., Hušek P., Šimek P., J. Sep. Sci. 32 (2009),

,Hartvich P., Zahradníčková H., J. Chromatogr.A. 1186 (2008) 391-400. Hušek P., Šimek P.

10 CHARAKTERISTIKY REAKCE Vodní prostředí, laboratorní teplota Průběh v několika vteřinách s velkým výtěžkem Polarita analytů se výrazně snižuje, tudíž snadno přecházejí do nemísitelné organické fáze Odstranění anorganických solí a jiných polárních interferencí, které by zhoršovaly následnou separaci a MS detekci Vzniklé deriváty jsou vhodné pro GC/FID, GC/ECD, GC/MS i LC/MS, jsou tepelně i chemicky stálé Zavedením atomů fluoru do molekuly chlorformiátu se zvýší těkavost derivátů, čímž se zkrátí doba analýzy a je možno pracovat s chirálními stacionárními fázemi, které jsou stabilní jen do 200 C.

a MS detekci Vzniklé deriváty jsou vhodné pro GC/FID, GC/ECD, GC/MS i LC/MS, jsou tepelně i chemicky stálé Zavedením atomů fluoru do molekuly

11 CO REAGUJE DERIVATIZACÍ ALKYLCHLORMRAVENČANY? Funkční skupina Derivát Typ látky NH 2 karbamát aminy(alifatické) NHR karbamát aminokyseliny N- heterocyclický karbamát imidazolyl OH (fenolická) karbonát fenoly SH thiokarbonát thioly COOH ester karboxylové kyseliny Hušek P., Šimek P., Current Pharmaceutical Analysis 3 (2006),

aminokyseliny N- heterocyclický karbamát imidazolyl OH (fenolická) karbonát fenoly

12 Rozlišení (N,O,S)-HFBOC-HFB esterů na Chirasil-L-Val Ala Val Ile Leu ThrOR Asp SerOR Glu Met Phe Asn Cys 4FPhe Gln His Orn Tyr Lys Trp Izotermálně/Teplota ( C) 4.00/ / / / / / / / / / / / / / / / / / /200 koloně Teplotní gradient C, 3 C/min

66/150 2.98/150 2.31/150 0.42/150 1.77/150 2.43/150 3.03/160 1.94/170 2.14/180 1.20/190 1.34/190 0.

13 CHIRÁLNÍ SEPARACE AMINOKYSELIN VÁZANÝCH V PEPTIDECH Aminokyseliny je nutno před analýzou uvolnit z peptidických vazeb hydrolýzou.ta probíhá v kyselém prostředí v zatavených ampulích za teplot > 100 C v atmosféře argonu > 12 hodin. Hydrolýza je velmi komplexní proces, podmínky hydrolýzy je nutno vždy optimalizovat. Doba hydrolýzy potřebná pro kompletní uvolnění AAs z peptidů závisí na povaze jejich vazeb. Chirální analýzy AAs jsou komplikovány racemizací AAs během hydrolýzy.

Hydrolýza je velmi komplexní proces, podmínky hydrolýzy je nutno vždy optimalizovat.

14 SYNTETICKÝ PEPTID CARBETOCIN Peptid je používán jako léčivo stimulující laktaci. N H 2 O H 2 N O O NH 2 O HN O O NH NH O H 3 C H 3 C O NH O N NH NH H 3 C O CH 3 S NH O H 3 C O

15 CÍL PRÁCE Stanovit molární % zastoupení L a D-enantiomerů aminokyselin ve vzorku D-Asn-Carbetocinu. Pro kontrolu byl dodán i L-Asn-Carbetocin. PRACOVNÍ POSTUP Hydrolýza peptidu: 100 nmol peptidu v 6M HCl s 1% thioglykolové kyseliny, 24 hod., 110 C, Po ochlazení odpaření proudem dusíku dosucha. Derivatizace aminokyselin: Roztoky standardů aminokyselin nebo peptidových hydrolyzátů (o množství až do 1500 nmol celkových aminokyselin) byly derivatizovány pentafluorpropylchlormravenčanem (PFPCF). Kolona: Alltech Chirasil-Val 25m x 0.25mm, 0,16 µm.

PRACOVNÍ POSTUP Hydrolýza peptidu: 100 nmol peptidu v 6M HCl s 1% thioglykolové kyseliny, 24 hod.

16 GC/ FID chromatogram enantiomerů AAs derivatizovaných PFPC představující poměr D- : L- AAs = 10 : 90 (2 nmol D-AAs : 18 nmol L-AAs).

17 GC/FID chromatogram aminokyselin v D-Asn Carbetocinu (100 nmol po hydrolýze a derivatizaci)

18 Výsledky stanovení enantiomerů AAs v Carbetocinu Aminokyselina Rozlišení *Poměr L-/D-Asp RSD [%] poměru D-/L- AA (n = 6) Celková L-Asn-Carb. D-Asn-Carb. Racemizace [% D enantiomeru] Způsobená hydrolýzou Leucin Asparagová * Glutamová Cystein O-Methyl-tyrosin Průběh racemizace L-AAs během hydrolýzy byl obdobný jako u racemizace D-AAs během hydrolýzy Enantiomerníčistota aminokyselin v D-Asn Carbetocinu byla počítána tak, že od hodnoty odpovídající racemizaci proběhlé v D-Asn-Carbetocinu (celková) byla odečtena hodnota odpovídající racemizaci proběhlé v L-Asn-Carbetocinu (způsobená hydrolýzou). Čistá

17 3.74 3.13 3.03 0.1 O-Methyl-tyrosin 1.22 2.49 3.12 8.05 7.01 1.

19 CÍL PRÁCE PŘÍRODNÍ PEPTID IZOLOVANÝ ZE SINIC Stanovit složení peptidu a určit chiralitu jednotlivých komponent. PRACOVNÍ POSTUP Hydrolýza peptidu: 1 nmol peptidu v 6M HCl s 0.4% sodné soli 2,3-dimerkapto-1-propansulfonové kyseliny, 24 hod., 115 C, Po ochlazení odpaření proudem dusíku dosucha. Derivatizace aminokyselin: Roztoky standardů aminokyselin nebo peptidových hydrolyzátů byly derivatizovány ethylchlormravenčanem (pro GC/MS identikaci) a heptafluorbutylchlormravenčanem (pro separaci na chirální koloně). Kolona: Varian Chirasil-Val 25m x 0.25mm, 0,12 µm.

, 115 C, Po ochlazení odpaření proudem dusíku dosucha.

20 IDENTIFIKACE LÁTEK V HYDROLYZÁTU

21 CHIRÁLNÍ ANALÝZA HYDROLYZÁTU u V( x 1,0 0 0 ) 1 0. C 0 h r o m a to g ra m L - a llo Ile / L - Ile / L - S e r O R / P r o / G ly / D - a llo Ile / u V(x 1,0 0 0 ) 1 0. C 0 h ro m a to g ra m D -P h e / D -G lu / L -G lu / L -P h e / D -G ln / m in m in

22 Výsledky stanovení enantiomerů AAs v přírodním peptidu Protože reakcí s heptafluorobutylchlormravenčanem nelze separovat D,Lprolin, byl hydrolyzát byl podroben reakci s methylaminem, vzniklé deriváty prolinu pak na chirální koloně poskytují dva dobře oddělené píky. V peptidu byly nalezeny tyto látky: D-Pro 8.67 % L-Pro 91.33% Gly D-alloILe 97.98% L-alloIle 2.02% L-Ile L-Ser D-Glu 92.27% D-Phe 9.65% L-Glu 7.73% L-Phe 90.35% D-Gln

23 ZÁVĚR Byly vypracovány nové postupy analýz aminokyselin v peptidech metodou plynové chromatografie. Peptidy jsou podrobeny kyselé hydrolýze a derivatizovány fluorovanými chlormravenčany. Produkty hydrolýzy jsou identifikovány pomocí GC/MS. Získané deriváty většiny aminokyselin jsou těkavé, snadno separovatelné na kapilární koloně Chirasil-Val. Metoda je aplikovatelná na stanovení optické čistoty farmaceuticky významných peptidů i analýzu enantiomerů aminokyselin v přírodních peptidech.

24 PODĚKOVÁNÍ Projekty 1. Fund for Research Support, EEA/Norway grant No. A/CZ0046/1/ Grant Agency of the Czech Republic, project No. 213/09/2014 Děkuji vám za pozornost

25 Překryté záznamy peptidu (černý) a DL-Pro (červený) u V(x 1 0, ) m i n

Podobné dokumenty

Přístupy k analýze opticky aktivních látek metodou HPLC

Přístupy k analýze opticky aktivních látek metodou HPLC Karel Lemr Katedra analytické chemie, Přírodovědecká fakulta Univerzity Palackého tř. Svobody 8, 771 46 Olomouc lemr@prfnw.upol.cz Zentiva, Praha,