Úloha cyklofilinů v sestřihu

Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta Katedra buněčné biologie Úloha cyklofilinů v sestřihu Bakalářská práce Zdeněk Cit Školitel: RNDr. František Půta, CSc. Praha 2010

Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracoval samostatně s pomocí citované literatury a na základě konzultací se svým školitelem RNDr. Františkem Půtou, CSc. Chtěl bych poděkovat svému školiteli RNDr. Františku Půtovi, CSc. za trpělivost a užitečné rady. Také chci poděkovat svým rodičům a přátelům za skvělou podporu. 2

Obsah Abstrakt... 4 Klíčová slova... 4 Abstract... 5 Keywords... 5 Seznam použitých zkratek... 6 1 Úvod... 8 1.1 Sestřih pre-mrna... 8 1.2 Imunofiliny... 11 1.3 Cyklofiliny... 12 2 Cyklofiliny účastnící se sestřihu... 14 2.1 PPIH... 14 2.2 PPIG... 18 2.3 PPIE... 21 2.4 PPIL1... 25 2.5 PPIL2... 27 2.6 PPIL3... 28 2.7 PPWD1... 31 2.8 Cwc27... 32 3 Závěr... 34 Seznam bibliografických citací... 35 3

Abstrakt Sestřih je proces nezbytný pro správné fungování eukaryotických buněk. Jedná se o velice složitý a dynamický děj, na němž se podílí velké množství proteinů, které plní různorodé funkce buď přímo uvnitř sestřihového komplexu, nebo i mimo něj. Mezi proteiny, které v sestřihu plní důležitou úlohu, patří nepochybně i cyklofiliny. Ty pravděpodobně způsobují konformační změny ostatních komponentů sestřihového komplexu, nebo je udržují v požadovaných konformacích, čímž přispívají k dynamice spliceosomu. Tato práce poskytuje přehled cyklofilinů, u nichž byl potvrzen podíl na sestřihu pre-mrna, a shrnuje návrhy možných funkcí, jež tyto proteiny mohou v sestřihu zastávat. Klíčová slova cyklofilin, sestřih, spliceosom, PPIH, PPIG, PPIE, PPIL1, PPIL2, PPIL3, PPWD1, Cwc27 4

Abstract Splicing is a process essential for the proper functioning of eukaryotic cells. It is a complicated and highly dynamic process, participated by large numbers of proteins which perform diverse functions, either directly within the splicing complex, or sometimes outside of it. Among the proteins, which play an important role in splicing, are cyclophilins. Cyclophilins probably cause conformational changes in the other components of splicing complex. They can also maintain them in the desire conformation thereby they contribute to the dynamics of the spliceosome. This work provides an overview of cyclophilins, which were confirmed to participate on pre-mrna splicing, and summarizes suggestions of possible functions that these proteins may perform. Keywords cyclophilin, splicing, spliceosome, PPIH, PPIG, PPIE, PPIL1, PPIL2, PPIL3, PPWD1, Cwc27 5

Seznam použitých zkratek Ala - alanin Arg - arginin Asn - asparagin Asp - kyselina asparagová ATP - adenozin-5 -trifofát BPS - specifická sekvence nacházející se uvnitř intronu CASPs - SR proteiny spojené s CTD největší podjednotky RNA polymerázy II CsA - cyklosporin A CTD - C-koncová doména CypE - cyklofilin E CypG - cyklofilin G CypH - cyklofilin H Cys - cystein FCBPs - proteiny vázající zároveň imunosupresivní látky FK506 a cyklosporin A FKBPs - proteiny vázající imunosupresivní látku FK506 G protein - protein vázající guanosin-5 -trifofát Gln - glutamin Glu - kyselina glutamová Gly - glycin H3K4met3 - histon H3 trimethylovaný na lyzinu 4 His - histidin hnrnp - komplex proteinů a pre-mrna Ile - izoleucin Leu - leucin Lys - lyzin Met - metionin MIGs - shluky proteinů přítomné během buněčného dělení v cytoplasmě NLS - jaderný lokalizační signál PBF - část proteinu SKIP vázající protein PPIL1 PHD - vazebná doména proteinu MLL Phe - fenylalanin PPIáza - enzym katalyzující cis/trans izomeraci peptidových vazeb, které předchází prolin pre-mrna - prekurzor mrna 6

Pro - prolin RNP-1, RNP-2 - RNA vazebné motivy RRM - RNA vazebná doména RS doména - doména obsahující dipeptid arginin-serin Ser - serin SR protein - protein obsahující RS doménu TCR - oprava spřažená s transkripcí Thr - treonin Trp - tryptofan Tyr - tyrozin U snrnp - málé jaderné komplexy obsahující proteiny a RNA bohaté na uridin U-box - doména typická pro ubiquitin ligázy Val - valin WD40 - repetice zakončená dvojicí aminokyselin tryptofan - kyselina asparagová 7

1 Úvod 1.1 Sestřih pre-mrna Exprese eukaryotických genů často vyžaduje odstranění protein-nekódujících sekvencí, tzv. intronů (Reidt et al., 2003), z prekurzoru mrna (zkráceně pre-mrna), a následné spojení protein-kódujících sekvencí pre-mrna, tzv. exonů (Mesa et al., 2008). Toho se dosahuje dvěma transesterifikačními reakcemi, které katalyzuje sestřihový komplex zvaný spliceosom (z anglického splice, což znamená spojit). Tvorba spliceosomu z menších podjednotek je velmi dobře řízený proces (Reidt et al., 2003), který vyžaduje malé jaderné ribonukleoproteinové partikule bohaté na uridin zvané snrnp (z anglického small nuclear ribonucleoproteins; Mesa et al., 2008). Každá U snrnp obsahuje jednu (U1, U2, U5) nebo dvě (U4/U6) snrna a několik proteinů (Reidt et al., 2003). Tyto snrna formují centrální smyčkovitou strukturu, která usnadňuje interakce snrna-protein a snrna-pre-mrna (Wang a Heitman, 2005). Všechny snrna (až na U6 snrna) mají na svém 5 konci trimethylguanosinovou čepičku, která je asociovaná se sedmi Sm proteiny. Sm proteiny jsou přítomny ve všech sestřihových snrnp vyjma U6 snrnp, která obsahuje LSM proteiny (z anglického like Sm; Lorkovic et al., 2005). Společné Sm ribonukleoproteiny (B/B, D1, D2, D3, E, F, a G) jsou uspořádány kolem vysoce konzervovaného Sm místa v U1, U2, U4 a U5 snrna (Reidt et al., 2003). Mimo to každá snrnp obsahuje množství snrnp-specifických proteinů a je spojená s řadou non-snrnp sestřihových faktorů (Lorkovic et al., 2005). V rané fázi formování sestřihového komplexu asociuje U1 snrnp bez spotřeby ATP s 5 sestřihovým místem na pre-mrna a vytváří E komplex. U1 snrnp podporuje za spotřeby ATP vznik interakcí mezi U2 a BPS (vzniká A komplex; BPS z anglického branch poit sequence - specifická sekvence, která se nachází uvnitř intronu). V dalším kroku tri-snrnp komplex složený z dimeru U4/U6 a monomeru U5 interaguje s U2 snrnp a s 5 sestřihovým místem, takto vzniklý komplex se nazývá B1 (Mesa et al., 2008). Během zrání spliceosomu je rozhodujícím krokem právě přeměna neaktivního komplexu B1 na katalyticky aktivní komplex B2 (Xu et al., 2006). Nově vzniklá U2/U6 snrnp se potom podílí na transesterifikačních reakcích (Reidt et al., 2003). První transesterifikační reakce proběhne v B2 komplexu a dá vzniknout volnému 5 exonu a lasovitému intronu spojenému s 3 exonem. V lariátu je 5 konec intronu napojen na 2 uhlík adenosinu v sekvenci BPS. C1 komplex je potom zodpovědný za druhou transesterifikační reakci, během které dojde k odstřižení 3 konce intronu a k oddálení intronu od 3 exonu. V té době drží U5 snrnp oba exony v těsné blízkosti a jejich ligací nakonec 8

vzniká C2 komplex, nezávislý lasovitý intron a U2/U6.U5 tri-snrnp, jenž se později rozpadá na jednotlivé snrnp. snrnp jsou recyklovány v přípravě na další kolo sestřihu (Mesa et al., 2008; Obr. 1). Obr. 1: Schematické znázornění práce sestřihového komplexu zachycuje sestavení spliceosomu, vystřižení intronu z pre-mrna, spojení dvou exonů a rozpad spliceosomu. Upraveno podle Mesa et al., 2008. Pomocí takovýchto rozsáhlých konformačních změn vznikají aktivní spliceosomy po celé délce pre-mrna (Obr. 2). Detailní mechanismus těchto pochodů je ale stále zahalen tajemstvím (Reidt et al., 2003). 9

Obr. 2: Model znázorňující sestřih pre-mrna. (A) Sestavení sestřihových komplexů na vznikající pre-mrna za přítomnosti RNA polymerázy II. (B) Po dokončení syntézy je částečně sestřižený transkript odpojen od RNA polymerázy II. (C) Plně sestřižená mrna, která prošla i řadou dalších úprav, je připravená pro přepravu ven z jádra. Upraveno podle Chen et al., 2007. Dynamika spliceosomu je sice nepopiratelná, ale jen málo se ví o změnách protein-proteinových interakcí během sestřihu. Ačkoliv tyto změny mohou nastat v důsledku konformačních změn RNA, tak se dá rovněž uvažovat o tom, že některé sestřihové proteiny fungují jako chaperony nebo izomerázy, čímž podporují konformační změny a dynamiku sestřihového komplexu (Teigelkamp et al., 1998). V savčích systémech se na sestřihu podílí přes tři stovky proteinů. Mnoho z těchto proteinů bylo dříve identifikováno v jiných buněčných procesech jako je regulace transkripce, vnitrobuněčný transport, mezibuněčný transport, apoptóza, sbalování proteinů či kinázová aktivita. Bylo též identifikováno několik sestřihových faktorů patřících do rodiny imunofilinů (Mesa et al., 2008). 10

1.2 Imunofiliny Imunofiliny jsou různorodá skupina proteinů známá svou schopností vázat imunosupresivní látky. První imunofilin byl izolován roku 1984 z kravských thymocytů jako látka s vysokou afinitou k cyklosporinu A (CsA). Teprve později bylo zjištěno, že tento protein vykazuje tak zvanou peptidyl-prolyl cis/trans izomerázovou aktivitu, která je charakteristická pro všechny členy této rozsáhlé rodiny (Mesa et al., 2008). Každý imunofilin tedy obsahuje alespoň jednu peptidyl-prolyl cis/trans izomerázovou (zkráceně PPIázovou) doménu zprostředkovávající většinu jeho buněčných funkcí (Mesa et al., 2008). PPIázy obecně katalyzují cis/trans izomeraci peptidových vazeb, které předchází prolin (Horowitz et al., 2002), což je obvykle krok omezující aktivitu a rychlost sbalování proteinů (Mesa et al., 2008). Tímto způsobem mohou imunofiliny především pomáhat při sbalování cílových proteinů, hrát roli při změně proteinové konformace nebo fungovat jako chaperony (Horowitz et al., 2002). Některé jaderné imunofiliny interagují přímo se sestřihovými faktory a vytvářejí část sestřihového komplexu, případně se váží též k C-koncové doméně největší podjednotky RNA polymerázy II (zkráceně CTD - z anglického C-terminal domain; Mesa et al., 2008). CTD je součástí největší podjednotky RNA polymerázy II. Obsahuje tandemově se opakující heptapeptidový motiv s konsenzus sekvencí Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser a slouží jako vazebné místo pro sestřihové a jiné faktory související s úpravou pre-mrna (Bourquin et al., 1997). Soudě podle konzervovanosti a role imunofilinů u mnoha druhů organismů lze soudit, že se účastní procesů souvisejících s transkripcí a zpracováním pre-mrna již odedávna. Navíc tyto proteiny lze nalézt ve všech organismech (Archea, Bacteria i Eukaryota), v různých organelách (mitochondrie, endoplasmatické retikulum, Golgiho aparát, jádro ; Mesa et al., 2008) i v genomu virů (Davis et al., 2008). To vše nasvědčuje faktu, že se jedná o velice důležitou skupinu proteinů, jejíž zástupci často plní životně důležité funkce a jsou potřební pro správné fungování všech živých buněk i všech hlavních buněčných organel (Pemberton, 2006). Superrodina imunofilinů se dělí na tři podrodiny. Patří sem cyklofiliny vázající cyklosporin A (CsA), FKBPs (z anglického FK506 binding proteins) vázající FK506, a parvuliny, jež váží rapamycin. Existují také proteiny obsahující cyklofilinové i FKBP domény zároveň, které propojují obě tyto podrodiny. I když cyklofiliny a FKBPs postrádají sekvenční a strukturní identitu (Wang et al., 1996), identifikace cyklofilin-fkbp hybridních proteinů (zkráceně FCBPs, z anglického FK506 and cyclosporin-binding proteins) odkazuje na jejich možný společný původ (Adams et al., 2005). 11

Imunosupresivní účinek CsA, FK506 a rapamycinu však nezbytně nemusí být spojen s enzymatickou funkcí PPIázové domény. Zatím ale nelze dokázat, že PPIázová aktivita je jedinou funkcí imunofilinů, ani nelze dokázat, že je tou hlavní funkcí. Navíc existuje množství proteinů, které jsou nezbytné pro správnou práci imunofilinů v buňce, a které by zároveň mohly stimulovat jejich případné skryté aktivity (Davis et al., 2008). Tyto tři proteinové rodiny však nesdílejí konzervované funkce v buňce. Někteří zástupci těchto skupin ani nemusejí být esenciální (popř. mohou být vyžadováni jen za některých podmínek nebo jen v malém množství), některé jejich funkce mohou totiž zastávat jiné proteiny. Imunofiliny také mohou mít klíčovou roli v patogenicitě některých mikroorganismů (Pemberton, 2006) či virů (významná je např. interakce proteinu CypA s kapsidovým proteinem viru HIV; Gamble et al., 1996). 1.3 Cyklofiliny Cyklofiliny jsou evolučně konzervovaná rodina proteinů přítomná ve velkém množství v každém organismu. Jádro cyklofilinu tvoří asi 180 aminokyselin složených v jednu kompaktní doménu, jejíž katalytické centrum tvoří 110 vysoce konzervovaných aminokyselin (Horowitz et al., 2002). Tato doména obstarává jak vazbu imunosupresivní látky CsA, tak peptidyl-prolyl cis/trans izomerázovou (PPIázovou) aktivitu, a je obklopena variabilním C-koncem a variabilním N-koncem (Zhou et al., 2001). Role cyklofilinů in vivo je však stále nejasná. Mohou se účastnit skládání proteinů (urychlují izomeraci peptidyl-prolylové vazby), jejich efekt na sbalování je však postupný, což svědčí o tom, že tato jejich funkce není úplně nepostradatelná. PPIázy též dokáží vázat hydrofóbní oblasti na svých cílových proteinech, aniž by způsobily izomeraci peptidyl-prolylových vazeb, čímž mohou zabraňovat špatnému sbalování proteinů (a fungovat tak jako chaperony), nebo upravovat aktivitu cílových proteinů. Nehledě na to, kterou z těchto dvou funkcí cyklofilin plní, je jeho interakce s cílovým proteinem přechodná. Samozřejmě existují některé cyklofiliny, které stabilně asociují s jinými typy proteinů, takovéto interakce jsou však zprostředkovány jinými doménami přítomnými v cyklofilinu (Ingelfinger et al., 2003). Už dřívější studie dokázaly, že vazebné determinanty pro cyklofiliny se často nacházejí mimo aktivní místo. Tyto studie naznačují, že existují oddělené sekvence pro vazbu substrátu, které jsou selektivnější než ty pro katalytické zpracování substrátu. Ony selektivnější determinanty jsou nejspíše nějakým způsobem určovány aminokyselinami mimo minimální aktivní povrch cyklofilinů. Proto je logické při určování potenciální vazebné 12

specifity cyklofilinů prozkoumávat N-koncové a C-koncové oblasti těchto molekul (Davis et al., 2008). Mezi substráty cyklofilinů patří např. RNázaT1, transferrin či kolagen. Mimo to jsou cyklofiliny též důležitou součástí imunitního systému právě kvůli vazbě CsA (Zhou et al., 2001). Lidský genom kóduje celkem devatenáct cyklofilinů, ale pouze u několika z nich byla prokázána přítomnost v sestřihovém komplexu. Role cyklofilinů působících v sestřihu však není příliš dobře prozkoumána a totožnost jejich interakčních partnerů zůstává často zahalena tajemstvím (Xu et al., 2006). Zajímavé ovšem je, že různé analýzy spliceosomů se liší jak v počtech, tak v typech identifikovaných cyklofilinů. To může být způsobeno mezidruhovými rozdíly nebo rozdíly v sestřihu u různých typů tkání. Pozorované odlišnosti mohou ale být způsobeny též dynamikou celého komplexu, která je hůře vystihnutelná s použitím klasické analýzy (Mesa et al., 2008). I když se zjistí, které cyklofiliny se podílejí na zajišťování funkčnosti sestřihového komplexu, tak mnohem těžší je určit jejich konkrétní úlohu. Většina teorií přisuzuje cyklofilinům roli chaperonů udržujících cílový protein v požadované konformaci, nebo katalyzátorů urychlujících změnu konformace cílových proteinů. V této oblasti však existují mnohé nejasnosti a je možné, že některé cyklofiliny působí v sestřihu i zcela odlišným způsobem (Horowitz et al., 2002). Lidský sestřihový komplex obsahuje minimálně osm cyklofilinů, které se ke komplexu připojují v různých fázích sestřihu (Wang et al., 2010). Tyto cyklofiliny pravděpodobně plní významné role v regulaci aktivity spliceosomu. Jsou schopny katalyzovat množství transportních a sbalovacích reakcí, které nejspíše přispívají ke kompletování a dynamice spliceosomu, k jeho propojení s transkripčním aparátem a k aktivaci či inaktivaci jeho proteinových komponentů (Mesa et al., 2008). 13

2 Cyklofiliny účastnící se sestřihu 2.1 PPIH Peptidyl-prolyl izomeráza H (známá především pod označením USA-Cyp, Snu-Cyp20 nebo CypH; Mesa et al., 2008) představuje po sekvenční i funkční stránce klasický cyklofilin. Tvoří jej 177 aminokyselinových zbytků, jeho relativní molekulová hmotnost je 19,2 kda (Horowitz et al., 1997), a z hlediska množství nashromážděných informací se jedná o jednoho z nejlépe prozkoumaných zástupců této skupiny (Horowitz et al., 2002). Analýza jeho krystalové struktury odhalila konformaci typickou pro cyklofiliny: osm antiparalelních β-listů (β1 až β8) tvořících β-barel, který je na každém konci uzavřený α-helixem (α1 a α2; Reidt et al., 2000; Obr. 3). Výsledky pokusů in vitro i in vivo naznačují, že hlavní úloha tohoto cyklofilinu se týká sestřihu pre-mrna. PPIH je totiž pevně vázán ke dvěma odlišným proteinům v sestřihovém aparátu, a z těchto dvou pozic může působit ve spliceosomu (Horowitz et al., 2002). CypH tedy vytváří dva stabilní komplexy, jeden s proteinem hprp4 a druhý s proteinem hprp18 (z anglického human precursor mrna processing ; Horowitz et al., 2002). Protein hprp18 se uplatňuje v druhé sestřihové reakci, v níž vzniká pre-mrna ze sestřihovývh intermediátů, a je součástí řetězce interagujících faktorů zapojených do druhého kroku (Horowitz a Krainer, 1997). N-koncová oblast hprp18 se podobá oblasti hprp4 pro interakci s CypH, zatímco C-koncová doména nejspíš poskytuje další interakční motivy pro sestřihový faktor Slu7 a pro partikuli U5 snrnp, které oba interagují s 3 sestřihovým místem (Jiang et al., 2000). V pozdějších stádiích sestřihové reakce je CypH spojen s ostatními komponenty spliceosomu nepřímo právě přes hprp18 (Jiang et al., 2000). Oproti tomu hprp4 je nedílnou součástí U4/U6 di-snrnp a uplatňuje se při skládání spliceosomu i v konformačních změnách předcházejících první sestřihové reakci (Ayadi et al., 1997). Mimo to obsahuje C-koncovou doménu se sedmi WD40 repeticemi, a tak se v případě komplexu PPIH/hPrp4 jedná o první objevenou interakci mezi cyklofilinem a proteinem obsahujícím WD40 repetici (Dalrymple et al., 1989). Motiv WD40 se nachází ve všech eukaryotech ve velkém množství proteinů bez zjevné společné funkce, 14 Obr. 3: Znázornění přirozené konformace cyklofilinu H. Červeně jsou vyobrazeny α-helixy, modře β-listy. Převzato z Reidt et al., 2003.

ale nenachází se v prokaryotech. Obvykle jej tvoří 40 aminokyselinových zbytků zakončených dvojicí aminokyselin tryptofan - kyselina asparagová (Pemberton, 2006). V případě hprp4 je od sebe těchto sedm WD40 repetic odděleno pravidelnými mezerami o velikosti 42 aminokyselinových zbytků. Celý protein je patrně sbalen do struktury složené ze sedmi podjednotek, z nichž každá obsahuje čtyři β-listy (Obr. 4). Takováto konformace je podobná struktuře β-podjednotek trimerních G-proteinů (Dalrymple et al., 1989) a v případě proteinu hprp4 tvoří lešení pro vazbu proteinu hprp3 (Ayadi et al., 1998). hprp3 je velmi zásaditý protein, a pokud se komplex hprp3/hprp4/ppih váže přímo k RNA, potom je pravděpodobné, že tato interakce je uskutečněna právě prostřednictvím hprp3 (Horowitz et al., 1997). Během pokusů, které měly za úkol potvrdit schopnost cyklofilinu H vázat se k proteinům hprp4 a hprp18, se však nepodařilo znovuvytvořit komplex PPIH/hPrp4/hPrp3 užitím syntetizovaných proteinů a buněčného lyzátu. To nejspíše znamená, že vznik takového komplexu je mnohem složitější záležitost, než se předpokládalo. Možná je vyžadována určitá posttranslační modifikace proteinu hprp3, bez níž nedojde k jeho zapojení do komplexu. Nebo v lyzátu může chybět jeden či více faktorů umožňujících stabilní spojení hprp3 s PPIH či s hprp4. Otázkou též zůstává, zda s U4/U6 di-snrnp interaguje preformovaný komplex PPIH/hPrp4/hPrp3, nebo jsou ke vzniku komplexu PPIH/hPrp4/hPrp3 potřeba, byť jen přechodně, i RNA-protein interakce. V takovém případě by komplex PPIH/hPrp4/hPrp3 mohl vzniknout až po kontaktu proteinů s U snrnp. Není však ani známo, zda tyto proteiny interagují jen s U4 snrnp, nebo pro vznik interakcí vyžadují přímo U4/U6 di-snrnp. Také se ví jen málo o tom, jak dojde ke znovuvytvoření tri-snrnp z U4, U6 a U5 snrnp, a v souvislosti s tím též není známo, zda komplex PPIH/hPrp4/hPrp3 prodělává nějaký opakovaný rozpad a znovusestavení v souvislosti s cyklem tri-snrnp (Teigelkamp et al., 1998). Vazebnou doménu pro hprp4 (popř. hprp18) má PPIH pouze jednu. Ta je vzhledem k jeho aktivnímu místu lokalizována na opačné straně (Reidt et al., 2003). V komplexech s hprp4 a hprp18 má cyklofilin H vystavené svoje aktivní místo, což vyplývá ze zjištění, že PPIH je schopen vázat současně CsA i hprp18 (případně CsA i hprp4), aniž by se tyto vazby vzájemně ovlivňovaly. Logicky lze tedy dospět k úvaze, že pokud je aktivní místo 15 Obr. 4: Znázornění přirozené konformace proteinu Prp4. Šipky představují β-listy. Převzato z Ayadiet al., 1998.

znepřístupněno prostřednictvím CsA, potom musí být vazba k hprp4 či k hprp18 realizována přes jinou část molekuly cyklofilinu. Stabilní vazba na jednom místě potom zřejmě umožňuje, aby cyklofilin svou katalytickou oblastí účinně působil na místě jiném, kde pravděpodobně zprostředkovává konformační změny proteinů v sestřihovém komplexu (Horowitz et al., 2002). Ve srovnání s jinými cyklofiliny, jako je třeba CypA, má však CypH zakomponovaný do U4/U6.U5 tri-snrnp značně sníženou PPIázovou aktivitu, což ale nemusí být nutně způsobeno nižší katalytickou účinností, ale třeba i různou substrátovou specifitou (Teigelkamp et al., 1998). V případě PPIH se tedy vazba k jiným proteinům neuskutečňuje výhradně skrz jeho aktivní místo. To umožňuje nastavit cyklofilin pomocí vazby interakčního partnera do tohoto jiného místa tak, aby CypH svým aktivním místem působil na specifický cíl. V souladu s tím byly objeveny konzervované oblasti, které odlišují PPIH od ostatních příbuzných cyklofilinů jako je kupříkladu CypA. Jedná se o asi 25 C-koncových aminokyselin a 5 aminokyselin vložených v místě 51 (Horowitz et al., 1997; Horowitz et al., 2002). Tyto oblasti mohou být důležité při interakci cyklofilinu s hprp4 a hprp18. Horowitz a kolegové dále zjistili, že hprp4 a hprp18 mají společné vazebné místo pro cyklofilin H, které představuje homologní oblast o délce 31 aminokyselinových zbytků konzervovaná v širokém spektru organismů (Horowitz et al., 1997; Horowitz et al., 2002). Mimo tuto oblast však nejsou příbuzné ani sekvenčně, ani strukturně. Navíc každý z nich má jinou funkci a uplatňuje se i v jiném kroku sestřihu. Domněnku o společném, 31 aminokyselin dlouhém, vazebném místě pro cyklofilin H podporuje i fakt, že kvasinka Saccharomyces cerevisiae postrádá jak homolog pro PPIH, tak tato potenciální vazebná místa v proteinech Prp4 a Prp18 (Horowitz et al., 2002). Podle dosavadních poznatků vycházejících z analýzy sekvence cyklofilinu H by se na vazbě hprp4 a hprp18 měly podílet aminokyselinové zbytky v oblastech Thr48 až Gly62 a Gln173 až Met177. Arg67 a His138 potom představují aminokyselinové zbytky důležité pro kontakt aktivního místa se substrátem. Bylo také zjištěno, že pro funkčnost enzymu je důležitý i His104, ten ale podle všeho není v přímém kontaktu se substrátem. Poslední zajímavá oblast se nachází v rozmezí Ile145 až Pro168 (Obr. 5). Tato sekvence se nepodobá aktivnímu místu ani místu pro vazbu hprp4 (popř. hprp18) a je možné, že zprostředkovává interakce s dalšími proteiny. V takovémto případě by cyklofilin mohl sloužit i jako most umožňující kontakt oněch proteinů s hprp18 či hprp4 (Reidt et al., 2003). 16

Obr. 5: Srovnání primární struktury různých typů cyklofilinů H s primární strukturou cyklofilinu A. Na červeném pozadí jsou aminokyselinové zbytky identické ve všech srovnávaných cyklofilinech, na žlutém pozadí jsou konzervované zbytky, na modrém pozadí zbytky identické ve skupině zahrnující cyklofiliny H a na šedém pozadí jsou zbytky identické v různých podskupinách cyklofilinů H. Oblasti zajišťující vazbu proteinu Prp4 (případně Prp18) jsou označeny azurovým pruhem nad primární strukturou, fialové šipky označují aminokyselinové zbytky důležité pro kontakt aktivního místa se substrátem (Arg67 a His138) a zelená šipka označuje zbytek, který podle všeho není v přímém kontaktu se substrátem, ale pro funkčnost enzymu je nezbytný (His104). Sekundární struktury jsou znázorněny černě pod primární strukturou. Upraveno podle Reidt et al., 2003. Je sice známo několik případů, kdy velký cyklofilin vytváří stabilní komplex, v němž je jeho aktivní místo vystavené na povrchu, není však jasné, zda se ostatní malé cyklofiliny chovají způsobem popsaným u PPIH (Horowitz et al., 2002). Navzdory konzervovanosti tohoto cyklofilinu a jeho vazebného místa i mezi velmi vzdálenými organismy se zdá, že má pouze menší efekt na sestřih pre-mrna in vitro. Sestřih in vitro totiž trvá desítky minut, zatímco samovolná peptidil-prolyl izomerace trvá sekundy až minuty. Jestliže CypH funguje v sestřihu jako PPIáza, potom může být jeho role in vitro nahrazena spontánní izomerizací, která probíhá vzhledem k sestřihu in vitro relativně rychle. V buňkách je ale sestřih mnohem rychlejší a rychlost spontánní izomerace tedy není dostačující. Vliv cyklofilinu H, který má za následek rapidní zvýšení rychlosti izomerace, bude in vivo pravděpodobně mnohonásobně větší. In vivo výzkumy totiž nepopiratelně dokazují, že CsA má čistě inhibiční efekt na sestřih pre-mrna (Horowitz et al., 2002). I když se toho o PPIH ví poměrně mnoho, tak stálé zůstávají nezodpovězeny jedny z prvotních otázek. Např. jakým způsobem se PPIH vůbec účastní sestřihu? Při takovýchto úvahách je třeba myslet i na to, že skrz konformační změny jednoho či více proteinů může cyklofilin ovlivňovat také RNA tvořící samotné jádro spliceosomu (Teigelkamp et al., 1998). 17

Za takových podmínek a s tak omezenými poznatky potom dojdeme k mnoha hypotetickým funkcím cyklofilinu H. Mohl by napomáhat sbalování hprp3 a hprp4 nebo vůbec umožňovat jejich správné sbalení, mohl by napomáhat vstupu hprp18 do spliceosomu, mohl by napomáhat kompletování U4/U6 di-snrnp či U4/U6.U5 tri-snrnp, mohl by napomáhat vzniku sestřihového komplexu C z komplexu B, mohl by ovlivňovat konformaci spliceosomu během druhého kroku sestřihu, mohl by napomáhat rozpadu U4/U6 di-snrnp, mohl by se též podílet na opravě poškození spliceosomu či na jeho rozpadu, nebo by mohl fungovat i jako chaperon a podílet se na obnově funkce sestřihového komplexu v průběhu tepelného šoku (Ayadi et al.; 1997; Horowitz et al., 1997). Další otázkou hodnou pozornosti je, které molekuly vlastně zpracovává jeho aktivní místo. Existuje mnoho potenciálních substrátů, na něž by mohl tento cyklofilin působit, a v podezření jsou i jeho výše diskutovaní interakční partneři. CypH totiž potřebuje mít vysokou afinitu k substrátu a cíle jeho působení mohou být dány vzdáleností. Jedna z hypotéz, která by zároveň vysvětlovala proč je PPIH připojen právě k hprp3/hprp4 a k hprp18, tedy předpokládá, že právě tyto proteiny fungují zároveň jako jeho substráty (Horowitz et al., 2002). Nejkonzervovanější oblast proteinu hprp18 sice vytváří ohebnou smyčku, na níž teoreticky může PPIH působit (Jiang et al., 2000), ale hprp4 se oproti tomu zdá být jako nepravděpodobný cíl, protože obsahuje WD40 repetice a předpokládá se, že vytváří stabilní strukturu. hprp3 představuje vhodnějšího adepta (Horowitz et al., 2002). Možnost vazby hprp4 do katalytického centra PPIázové domény se rozhodl prověřit Reidt se svým týmem. Zaměřili se na dva prolinové zbytky (Pro117 a Pro125) v sekvenci hprp4. Výsledky jejich pokusů potvrdily teoretické předpoklady a prokázaly, že tyto proliny se nedokáží vázat do aktivního místa cyklofilinu a hprp4 tedy nemůže být substrátem pro PPIH. Možnost vazby hprp18 či hprp3 do katalytické domény však zatím nikdo nepotvrdil ani nevyvrátil (Reidt et al., 2003). 2.2 PPIG Peptidyl-prolyl izomeráza G (označovaná též jako SRcyp, CARS-Cyp nebo CypG; Mesa et al., 2008) je cyklofilin, který se řadí do skupiny SR proteinů. Má relativní molekulovou hmotnost 88,6 kda (Dubourg et al., 2004), jeho N-koncová část obsahuje PPIázovou doménu a v jeho C-koncové části se nachází dvě Nopp140 repetice a jedna dlouhá RS doména (Nestel et al., 1996). Nopp140 repetice představuje motiv, v němž se střídají úseky kyselých aminokyselinových zbytků s úseky zásaditých aminokyselinových zbytků 18

(Nestel et al., 1996). Oproti tomu RS domény obsahují dipeptidy arginin-serin a nachází se převážně v pre-mrna sestřihových faktorech (Fu, 1995). Bylo dokázáno, že RS doména PPIG je potřebná pro specifickou interakci cyklofilinu s CTD největší podjednotky RNA polymerázy II. Interakce CTD a CypG nemůže být jednoduše vysvětlena vysokou frekvencí pozitivních nábojů v RS doméně, ale jasně vyžaduje specifické sekvence. Nelze sice říci, že SR proteiny obecně interagují s CTD skrz svojí RS doménu, za to se ale zdá, že SR proteiny váží CTD buď skrz svou RS doménu, nebo skrz jinou doménu, což pravděpodobně umožňuje komplikovanější síť interakcí (Bourquin et al., 1997). Je také možné, že právě CTD je cílem PPIázové aktivity cyklofilinu G. Tvorba komplexů pro transkripci či úpravu RNA by totiž mohla být ovlivňována stupněm fosforylace CTD nebo její konformací, a fosforylace či defosforylace CTD by též mohla být ovlivňována její konformací. Ke změně konformace CTD může docházet právě díky PPIázové aktivitě, protože CTD má oblasti bohaté na prolin. Eventuelně může formace specifických proteinových komplexů na CTD vyžadovat některé chaperonové funkce. Obě možnosti otevírají cestu pro zapojení cyklofilinu do těchto pochodů (Bourquin et al., 1997). PPIG a další proteiny, které obsahují SR doménu a interagují s CTD, se souhrnně nazývají CASPs (z anglického CTD-associated SR-like proteins). Předpokládaná je jejich účast na elongaci nebo regulaci sestřihu. Přesná úloha CypG není dosud známá, ale je pravděpodobné, že spojuje pre-mrna sestřih a transkripci tak, že svou PPIázovou aktivitou působí na hyperfosforylovanou CTD a proteiny s ní asociované během elongační fáze (Lin et al., 2004). Cyklofilin G byl lokalizován převážně v nukleoplasmě, v takzvaných jaderných skvrnách, což je jaderný kompartment bohatý na sestřihové faktory (Bourquin et al., 1997). Tyto jaderné skvrny se podílejí především na uskladňování a distribuci transkripčních faktorů a na zrání pre-mrna transkriptů, zvláště potom na sestřihu. Signálem postačujícím pro lokalizaci proteinu do tohoto kompartmentu je právě RS doména (Lamond a Spector, 2003). Další výzkum prozradil, že CypG fyzicky interaguje s jadernou formou pininu, který také disponuje RS doménou a asociuje se sestřiženými mrna. Oba tyto proteiny se shodně nacházejí v jaderných skvrnách a jsou nejspíše funkčně propojeny. S tím koresponduje fakt, že pinin obsahuje 6,7 % prolinu a představuje tak ideální cíl pro PPIázovou doménu. PPIG při vyšší expresi vyvolává distribuci pininu z jaderných skvrn v difusní jadernou formu. Podobně působí i na ostatní SR proteiny v jaderných skvrnách. CypG může tudíž ovlivňovat aktivitu sestřihových faktorů z rodiny SR proteinů a hrát 19

tak základní úlohu v regulaci pre-mrna sestřihu prostřednictvím regulace distribuce SR proteinů v jádře (Lin et al., 2004). Stejný efekt má i kináza Clk/Sty (Clk z anglického cdc2-like kinase). Kináza Clk/Sty se účastní sestřihu a má duální specifitu. To znamená, že dokáže fosforylovat aminokyselinové zbytky serinu a treoninu i aminokyselinové zbytky tyrozinu (Ben-David et al., 1991). Při zvýšené expresi tohoto enzymu jsou SR proteiny hyperfosforylovány a sestřihové faktory (typicky lokalizované v jaderných skvrnách) difundují do nukleoplasmy. Fosforylace SR proteinů je totiž spojena s jejich uvolněním z jaderných skvrn a následným přesunem do míst transkripce (Colwill et al., 1996). Fosforylace a defosforylace SR proteinů závisí na interakčních partnerech a slouží nejspíše k regulaci sestřihového cyklu. Za jejich fosforylaci jsou zodpovědné dvě skupiny kináz, Clk a SRPK (z anglického SR protein kinase), které specificky fosforylují SR domény (Lorkovic et al., 2004). PPIG se váže k Clk/Sty a proto se předpokládá, že Clk/Sty jej fosforyluje a tím ovlivňuje jeho aktivitu (Nestel et al., 1996). Přestože Clk/Sty způsobuje relokalizaci pininu a dalších SR proteinů do nukleoplasmy, tak neexistují důkazy, že dochází k přímé interakci kinázy s těmito proteiny. Kompletování jaderných skvrn může být ovlivňováno změnami konformací jaderných SR proteinů, a jejich konformace mohou být zase ovlivňovány právě PPIG. Clk/Sty tedy může způsobovat uvolnění SR proteinů prostřednictvím fosforylace cyklofilinu G (Lin et al., 2004). CypG by potom mohl svou PPIázovou aktivitou zapříčinit rovnou změnu lokalizace SR proteinů, nebo by jim také mohl vnutit konformaci, která by upřednostňovala protein-proteinové interakce vhodné pro fosforylaci, a teprve tato fosforylace by měla za následek změnu lokalizace (Lorkovic et al., 2004). V souvislosti se sestřihem pre-mrna je ale nutné podotknout, že PPIG nebyl dosud nalezen v žádném z mnoha sestřihových komplexů, což může znamenat, že cyklofiliny obsahující RS doménu jsou se spliceosomem asociovány pouze přechodně během jeho sestavování. Samotná účast PPIG na transkripci i sestřihu by potom představovala krásný příklad blízkého propojení dvou buněčných procesů (Lorkovic et al., 2004). Takovéto propojení by mohlo teoreticky zprostředkovávat kontrolní mechanismus zastavující transkripci v případě, že sestřih je přerušen (Yuryev et al., 1996). Zajímavé je také zjištění, že gen pro PPIG není exprimován v NK buňkách (z anglického natural killers). To může být způsobeno expresí genu pro protein NK-TR1, který je cyklofilinu G blízce příbuzný (ale má sníženou citlivost vůči CsA) a mohl by tedy zastávat jeho funkce v NK buňkách (Nestel et al., 1996). Proto by bylo vhodné propojit 20

výzkum PPIG s výzkumem NK-TR1 a zaměřit se při tom na otázku, jak dalece jsou si podobní. Fosforylace PPIG je ale regulována i buněčným cyklem, a jedná se tudíž o první cyklofilin, u něhož byl popsán tento způsob regulace. CypG obsahuje pět míst fosforylovatelných kinázou Cdc2, která pracuje v komplexu s cyklinem B. Mimo Cdc2 dokáže PPIG fosforylovat pravděpodobně i mitotická kináza SRPK1. Enzym SRPK1 je však lokalizován v cytoplasmě a ze sterických důvodů tedy nemůže dojít k jeho interakci s CypG. Když ale komplex Cdc2-cyklin B v průběhu mitózy nafosforyluje PPIG, tak dojde k jeho uvolnění do cytoplasmy, kde už může interagovat se SRPK1 (Dubourg et al., 2004). Během celé mitózy se PPIG chová jako klasický faktor pro regulaci transkripce a sestřihu. V metafázi je rozptýlen v cytoplasmě, v anafázi se společně s dalšími podobnými proteiny shlukuje do kondenzovaných útvarů zvaných MIGs (z anglického mitotic interchromatin granule clusters) a na konci telofáze vstupuje do nově utvářeného jádra. Z přítomnosti PPIG v MIGs lze odhadovat, že tento cyklofilin je jedním z hlavních faktorů spouštějících genovou expresi v nově vzniklé buňce. Sestavování transkripčních a sestřihových komplexů v telofázi je totiž nenáhodné, a jednotlivé partikule jsou do těchto komplexů zařazovány v přesně stanoveném pořadí. Uvolňování proteinů z MIGs v potřebném pořadí by pak mohl zajišťovat právě CypG (Dubourg et al., 2004). Podle těchto informací se zdá, že PPIG zasluhuje mnohem větší pozornost, než jaké se mu zatím dostalo. Nynější poznatky nasvědčují tomu, že cyklofilin G se pravděpodobně významným způsobem podílí na několika klíčových buněčných pochodech a jeho další výzkum by mohl pomoci pochopit, jakým způsobem jsou propojeny jednotlivé buněčné procesy v dynamický fungující systém, nebo jak je celý tento systém regulován v průběhu mitózy. 2.3 PPIE Peptidyl-prolyl izomeráza E (nazývaná také Cyp33 nebo CypE; Mesa et al., 2008) je jaderný cyklofilin obsahující dvě funkční domény, PPIázovou doménu na C-konci a RNA vazebnou doménu (zkráceně RRM z anglického RNA recognition motiv) na N-konci (Obr. 6). Jedná se tak o první popsaný případ kombinace takovéhoto typu domén v jednom proteinu (Mi et al., 1996). Obr. 6: Schematické znázornění cyklofilinu E s RNA vazebnou doménou na N-konci a PPIázovou doménou na C-konci. Převzato z Hom et al., 2010. 21

PPIE je nejvíce exprimován ve svalech a v mozku (Kim et al., 1998) a zdá se, že existuje ve dvou rozdílných formách. Mi společně se svými kolegy totiž in vitro transkribovali cdna pro PPIE a ve výsledku byli schopni rozlišit dva produkty. Jeden o relativní molekulové hmotnosti 33 kda a druhý o relativní molekulové hmotnosti 30 kda (Mi et al., 1996). Další informace o těchto izoformách však zatím nejsou známy. RRM doména cyklofilinu E obsahuje dva konzervované motivy, RNP-1 (o sekvenci Arg-Gly-Phe-Ala-Gly-Val-Glu-Phe) a RNP-2 (o sekvenci Leu-Tyr-Val-Gly-Gly-Leu) oddělené mezerou o velikosti 33 aminokyselinových zbytků, a nejvíce se podobá RNA vazebné doméně proteinu SAP49, který je součástí sestřihového komplexu. Už podle toho lze předběžně odhadovat, že PPIE by se mohl účastnit sestřihu (Mi et al., 1996). RRM doménu CypE tvoří pět antiparalelních β-listů a dva α-helixy (Obr. 7). K základnímu RRM tvaru βαββαβ se tak v případě PPIG přidružuje ještě jeden β-list navíc (list β4), který páruje s listem β5 (Hom et al., 2010). PPIE se prostřednictvím této domény váže preferenčně k polya a polyu sekvencím, ale mnohem hůře k polyc či polyg sekvencím (Mi et al., 1996). S tím koresponduje zjištění, že se cyklofilin E váže především k mrna, která obsahuje jednak polyadenylační signál AAUAAA a jednak polya přesah na 3 konci. Pokusně byla zatím prokázána zvýšená tendence k interakci se sekvencí AAUAAA, zvýšená tendence k interakci s polya přesahem zatím potvrzena nebyla. Vazba k mrna navíc podporuje PPIázovou aktivitu CypE (Wang et al., 2008). Obr. 7: Znázornění přirozené konformace RRM domény cyklofilinu E. Hnědě jsou vyobrazeny α-helixy, modře β-listy. Převzato z Hom et al., 2010. RNA vazebné proteiny se u eukaryot obvykle podílejí na sestřihu, dalších úpravách a transportu RNA. Mimo to i mnoho dalších faktů nasvědčuje přímému zapojení PPIE do sestřihu pre-mrna. Např. Cyp-13, ortolog PPIE v C. elegans, je součástí operonu společně s geny uaf-2 a sf-1. Oba tyto geny kódují proteiny zapojené do sestřihu pre-mrna, a protože jsou transkribované ze stejného promotoru jako Cyp-13, tak je pravděpodobné, že i on se podílí na sestřihu (Anderson et al., 2002). CypE byl také identifikován při analýze sestřihového komplexu jako součást spliceosomu (Zhou et al., 2002), a později bylo prokázáno, že je stabilní součástí sestřihového komplexu C (Bessonov et al., 2008). Podle 22

Wanga ale vazba PPIE k polyadenylační sekvenci AAUAAA naznačuje, že cyklofilin E by se mohl podílet také na vzniku polya přesahu na 3 konci pre-mrna (Wang et al., 2008). PPIE neinteraguje přes svoji RRM doménu pouze s RNA, ale váže se skrz ni i k třetí PHD doméně (PHD3 - z anglického plant homeodomain) proteinu MLL (z anglického myeloid lymphoid leukemia), který se podílí na expresi HOX genů během vývoje zárodku. Pro vznik a udržení této vazby RRM doména vůbec nepotřebuje interagovat s RNA (Fair et al., 2001). Interakce s PHD3 se přímo nebo nepřímo účastní úsek spojující β2 a β3 list RRM domény. Aminokyseliny v této oblasti totiž vykazují největší konformační změny při navázání PHD3 motivu. Tato vazba v konečném důsledku stabilizuje RRM doménu. Podle dalších změn provázejících vazbu PHD3 lze říci, že menší úlohu zde hrají i listy β1, β2 a β3. Vazba RRM k PHD3 doméně proteinu MLL je ale vysoce specifická, takže RRM nedokáže vázat jiný motiv podobného typu (Hom et al., 2010). Oproti tomu na vazbě RNA se nejvíce podílejí aminokyselinové zbytky v oblasti β1 (zbytky 9 až 11), β3 (zbytky 49 až 52), β5 (zbytky 80 až 82) a zbytky 85 až 88. Přičemž aminokyselinové zbytky v oblasti β1 a β3 jsou součástí motivů RNP-2 a RNP-1. Tyr9, Phe49 a Phe51 potom představují ideální kandidáty pro přímou interakci s RNA. Vazebná místa pro PHD3 a RNA ve struktuře PPIE se částečně překrývají, proto se cyklofilin nemůže vázat k PHD3 i RNA zároveň. Pokusně bylo dokázáno, že interakce s PHD3 je mnohonásobně silnější a snadno vytěsní jakoukoliv RNA z vazebného místa (Hom et al., 2010). Protein MLL ovlivňuje expresi genů HOX a MEIS1. Pokusy dokázaly, že čím více PPIE je přítomno, tím méně jsou exprimovány tyto geny. Z toho vyplývá, že cyklofilin E negativně reguluje transkripční funkci proteinu MLL. Přesný mechanismus takové regulace ale nebyl doposud objasněn, i když existuje několik hypotéz. Podlé jedné z nich PHD3 motiv rozeznává histon H3 trimethylovaný na Lys4 (zkráceně H3K4met3), a tato interakce je důležitá pro transkripci genu. Vazba PHD3 k RRM však může oslabit vazbu PHD3 k H3K4met3, a tím by mohlo dojít ke snížení genové exprese. Také je možné, že vazba PHD3 nastavuje PPIázovou doménu PPIE tak, aby mohla působit buď přímo na MLL, nebo na nějaký jiný protein regulující jeho aktivitu. Izomerace a změna konformace takto zacíleného proteinu by potom vyústila ve snížení aktivity proteinu MLL a v pokles genové exprese. Ale ať už PPIázová doména hraje v tomto mechanismu jakoukoliv roli, je jasné, že se neúčastní rozpoznávání RNA ani PHD3 (Hom et al., 2010). 23

Jádro katalytického místa cyklofilinu E má klasickou strukturu, osm antiparalelních β-listů složených v β-barel a dva α-helixy na koncích tohoto barelu (Obr. 8). Za interakci PPIázové domény se substrátem jsou zodpovědné aminokyselinové zbytky Arg191, Phe196, Met197, Gln199, Ala237, Asn238, Phe249, Leu258 a His262, z nichž Arg191 a Asn238 přímo kontaktují prolin v aktivním místě. Konkrétní cíle PPIázové domény PPIE však zatím nebyly odhaleny. Aminokyselinové zbytky zapojené do vazby CsA jsou Arg191, Phe196, Met197, Gln199, Gly208, Ala237, Asn238, Ser239, Gln247, Phe249, Trp257, Leu258 a His262. Celá PPIázová doména CypE je velice podobná struktuře PPIázové domény cyklofilinu A. Obr. 8: Znázornění přirozené konformace PPIázové domény cyklofilinu E. Červeně je vyobrazena její N-koncová část, modře potom její C-koncová část. Spirály představují α-helixy, šipky představují β-listy. Převzato z Wang et al., 2005. U CypA vede mutace v Trp121 k prudkému poklesu citlivosti k CsA. Je tedy pravděpodobné, že mutace v obdobném aminokyselinovém zbytku u cyklofilinu E (Trp257) bude mít obdobný účinek (Wang et al., 2005). PPIE je také součástí XAB2 komplexu, který se podílí na transkripci, sestřihu pre-mrna a na TCR (z anglického transcription-coupled repair; oprava spřažená s transkripcí). Součástí tohoto komplexu jsou proteiny IBP160, hsyf1, hprp19, CCDC16, hisy1 a PPIE, které jsou všechny nějakým způsobem spjaty se sestřihem pre-mrna. Cyklofilin E se v tomto uskupení váže přímo k proteinu hsyf1, se kterým interaguje prostřednictvím aminokyselinových zbytků v oblasti 3 až 81 (zde se nachází RRM doména). Přesná funkce PPIE v XAB2 komplexu je ale zatím nejasná (Kuraoka et al., 2008). Celkově se předpokládá, že CypE se v buňce podílí na transkripci a úpravách pre-mrna (Anderson et al., 2002), na skládání či transportu proteinů a na protein-proteinových, popř. protein-rna interakcích (Mi et al., 1996). Také je pravděpodobná jeho účast na transportu mrna z jádra nebo úloha v buněčné signalizaci. mrna by v takovém případě mohla sloužit jako spouštěč PPIázové aktivity cyklofilinu. Po navázání mrna by pak PPIE svým katalytickým místem měnil konformace přepravních či signálních proteinů a zahajovat tak signalizaci či transport (Wang et al., 2008). 24

2.4 PPIL1 Tento protein patří do cyklofilinové podrodiny nazývané PPIL (z anglického peptidyl-prolyl isomerase-like), pro kterou je typická ztráta tří aminokyselinových zbytků v oblasti spojující α-helix α2 a β-list β3 PPIázové domény (Galat, 1999). PPIL1 tvoří 166 aminokyselinových zbytků o relativní molekulové hmotnosti 20 kda (Ozaki et al., 1996) a jeho struktura vykazuje konformaci typickou pro cyklofiliny, osm antiparalelních β-listů formuje β-barel, který je na koncích ohraničen dvěmi α-helixy (Obr. 9A). Aktivní místo se potom nachází na β-listech β3 a β4 (Stegmann et al., 2010). PPIL1 je součástí 45 S penta-snrnp (ta obsahuje mnoho sestřihových faktorů a všechny základní snrnp - U1, U2, U4, U5 i U6) v aktivovaném komplexu B2, a 35 S U5 snrnp, která se pravděpodobně podílí na aktivaci spliceosomu (Makarov et al., 2002). Další nezbytnou součástí 45 S penta-snrnp a 35 S U5 snrnp související s tímto cyklofilinem je protein SKIP (z anglického Ski interacting protein). Jedná se o transkripční koaktivátor interagující s řadou proteinů, který se účastní též aktivace spliceosomu (Jurica et al., 2002). SKIP ani PPIL1 nejsou trvale spojeni s U4/U6.U5 tri-snrnp a nejsou ani součástí pre-spliceosomu. Oba jsou připojeni před prvním katalytickým krokem a možná plní nějakou úlohu v aktivaci spliceosomu (Makarov et al., 2002). Pokusy, které provedl Xu a jeho kolegové naznačují, že N-koncová část proteinu SKIP, zahrnující aminokyselinové zbytky 59 až 129, je schopná pevně interagovat s proteinem PPIL1 in vitro. Navíc byly získány experimentální důkazy o utváření ternárního komplexu PPIL1/CsA/SKIP(59-129). Z toho lze usuzovat, že PPIL1 se váže ke SKIP jiným než aktivním místem. To jasně dokládá i zjištění, že komplex PPIL1/SKIP vykazuje PPIázovou aktivitu, která katalyzuje izomeraci substrátu podobně jako samostatný PPIL1. SKIP by tedy mohl sloužit jako adaptor dopravující cyklofilin na místa, kde se uskutečňují rozsáhlé přestavby. Takovýto mechanismus se může uplatňovat jak při transkripci, tak při úpravě pre-mrna. SKIP a PPIL1 tak mohou patřit mezi faktory propojující tvorbu a úpravu pre-mrna (Xu et al., 2006). Interakci těchto dvou proteinů dále zkoumal Wang se svým týmem. Společně zjistili, že PPIL1 se váže k proteinu SKIP skrze PBF (z anglického PPIL1 binding fragment), což je oblast proteinu SKIP zahrnující aminokyselinové zbytky Gly59 až Lys79 (Obr. 9). Ze strany PPIL1 se na interakci přímo podílejí zbytky Tyr28, Lys30, Asp59, Asp89 až Leu98, Thr115 až Pro118, Gly130 až Asn140 a Met144. Ze strany proteinu SKIP se do vazby přímo zapojují zbytky Gly59 až Leu74, Met76 a Gly77, z nichž jsou klíčové Glu66 a Met76. Glu66 25

elektrostaticky interaguje s Arg131 v PPIL1 a Met76 vkládá svou methylovou skupinou do hydrofóbní dutiny v PPIL1. Mutace kterékoliv z těchto dvou aminokyselin znemožní vznik komplexu PBF/PPIL1 (Wang et al., 2010). Obr. 9: Znázornění konformace PPIL1 vážícího PBF. (A) PBF je vyobrazen zeleně, α-helixy hnědě a β-listy tyrkysově. (B) Povrch PPIL1 (zobrazen šedě) interagující s PBF (zobrazen hnědě). Upraveno podle Wang et al., 2010. Současně se skupinou Wanga tuto interakci zkoumal i Stegman a jeho kolegové. Ti zjistili, že minimální aminokyselinová sekvence SKIP potřebná pro vazbu SKIP k PPIL1 je Gly61-Gly62-Ala63-Phe64-Pro65-Glu66-Ile67-His68. Autoři si všimli, že vazebné místo pro SKIP ve struktuře PPIL1 vykazuje zvýšenou afinitu pro peptidy obsahující prolin a položili si otázku, proč se SKIP váže do alternativního vazebného místa cyklofilinu a ne do katalytického místa. Podle Stegmana odpověď nabízí přítomnost Glu66, který se nachází hned vedle Pro65. Glu66 totiž vytváří klíčové interakce nezbytné pro vznik komplexu SKIP/PPIL1. Tendence ke vzniku interakcí mezi Glu66 a alternativním vazebným místem PPIL1 je pak nejspíš mnohem vyšší než tendence ke vzniku interakcí mezi Pro65 a katalytickým místem cyklofilinu. Důležitou roli Glu66 navíc dokládají i Wangovy výsledky. Důvod, proč Stegman narozdíl od Wanga nedokázal odhalit i klíčovou úlohu aminokyselinového zbytku Met76 je ten, že fragment proteinu SKIP, se kterým Stegman pracoval, neobsahoval Met76 (Stegmann et al., 2010). Podobně jako u ostatních cyklofilinů je ale přesná role PPIL1 neznámá. Podle nynějších představ dojde k připojení PPIL1 k sestřihovému komplexu prostřednictvím proteinu SKIP během přestavby spliceosomu z komplexu B1 na komplex B2 (Xu et al., 2006). PPIL1 se potom stane stabilní součástí komplexu C, kde pravděpodobně plní důležitou úlohu jako chaperon nebo jako izomeráza (Bessonov et al., 2008). 26

Je možné, že každý sestřihový cyklofilin vyžaduje specifického partnera, který by ho připojil k příšlušné části spliceosomu. Takto připojený cyklofilin by potom sám mohl připojovat ke komplexu další proteiny, s nimiž interaguje. Úloha cyklofilinů v sestřihu by pak mohla být mnohem komplikovanější, než se původně očekávalo (Xu et al., 2006). Ovšem transkripce a sestřih nejsou jedinou oblastí působení cyklofilinu PPIL1, která zasluhuje pozornost. Při výzkumu rakoviny tlustého střeva Obama se svým týmem zjistili, že v rakovinných buňkách dochází ke zvýšené expresi PPIL1. Také prokázali, že PPIL1 interaguje s cytoplasmatickým proteinem stathminem. To vše je v souladu s pozorovanou lokalizací cyklofilinu. Ten byl totiž objeven v jádře i v cytoplasmě. Protože PPIL1 nemá žádný jaderný lokalizační signál (zkráceně NLS z anglického nuclear localization signal), předpokládá se, že jeho umístění závisí na vazebných partnerech, s nimiž je v kontaktu (Obama et al., 2006). Stathmin je součástí cytoskeletu a reguluje přestavbu mikrotubulů. PPIL1 by proto mohl ovlivňovat cytoskelet rakovinných buněk právě prostřednictvím interakce s tímto proteinem. Prostřednictvím interakce s proteinem SKIP by zase mohl regulovat transkripci a sestřih tak, aby posouval rovnováhu ve prospěch nekontrolovatelného buněčného růstu. Vazba ke stathminu je navíc ovlivněna stupněm fosforylace stathminu. PPIL1 má vyšší afinitu k fosforylovanému stathminu než k jeho defosforylované variantě. PPIL1, v kombinaci se stathminem a jeho kinázami, by tedy mohl představovat důležitou komponentu rakovinného bujení. Zevrubné informace o cyklofilinu PPIL1 by tak mohly pomoci nejen při objasnění mechanismu základních buněčných procesů, ale též při navrhování a tvorbě nových léků cílených proti nádorovým buňkám (Obama et al., 2006). 2.5 PPIL2 PPIL2, neboli Cyp60, je cyklofilin o relativní molekulové hmotnosti 60 kda (Wang et al., 1996), který je lokalizován v jádře i v cytoplasmě (Pushkarsky et al., 2005). V souvislosti s jeho PPIázovou doménou lze sledovat mírné odlišnosti. Zatímco ostatní lidské cyklofiliny vykazují podobnost 60 až 80 % v konzervované oblasti, která se nachází u CypA na pozicích 18 až 143, tak PPIL2 v této oblasti vykazuje podobnost s jinými lidskými cyklofiliny pouze 46 až 52 % (Wang et al., 1996). Ve své struktuře také obsahuje U-box, což je doména tvořená přibližně sedmdesáti konzervovanými aminokyselinovými zbytky. U-box je typický pro proteiny fungující jako ubiquitin ligázy. Role tohoto cyklofilinu v ubiquitinylaci či ve fungování proteazomu však zatím nebyla potvrzena (Espeseth et al., 2006). 27

PPIL2 byl sice identifikován jako součást sestřihového komplexu, jeho úloha v sestřihu však zatím nebyla blíže prozkoumána. Předpokládá se, že funguje podobně jako jiné sestřihové cyklofiliny a prostřednictvím svojí PPIázové či chaperonové aktivity usnadňuje či umožňuje konformační změny sestřihových proteinů, případně se účastní jejich transportu do či ze spliceosomu (Zhou et al., 2002). Ohledně funkce tohoto cyklofilinu v jádře se zjistilo, že se podílí na genové expresi a interaguje např. s inhibitorem proteináz eglinem c (Wang et al., 1996). Bylo též dokázáno, že pozitivně reguluje hladinu mrna enzymu BACE1, který hraje důležitou roli v patogenezi Alzheimerovi choroby (Espeseth et al., 2006). Z mimojaderných funkcí byla doložena interakce PPIL2 se třemi povrchovými proteiny, insulinovým receptorem, Ftl3 ligandem a proteinem CD147. V souladu s tím bylo prokázáno snížení transportu těchto proteinů na povrch buňky v přítomnosti CsA, který účinně inhibuje aktivní místo cyklofilinu. Příromnost CsA však neovlivnila celkové množství oněch proteinů v buňce. Je tedy pravděpodobné, že PPIL2 pouze pomáhá při jejich transportu. Přesný mechanismus regulace transportu proteinů je ale také neobjasněný (Pushkarsky et al., 2005). 2.6 PPIL3 Sekvenční analýza cdna knihovny z mozku lidského plodu odhalila dva proteiny patřící do rodiny cyklofilinů. Další výzkum prokázal, že se jedná o sestřihové varianty téhož genu (genu pro PPIL3, zvaného také CypJ), který se skládá z osmi exonů. Varianty byly nazvány PPIL3a a PPIL3b. cdna proteinu PPIL3a je 1137 párů bází dlouhá a kóduje 165 aminokyselin o relativní molekulové hmotnosti 18,6 kda. cdna proteinu PPIL3b je 1114 párů bazí dlouhá a kóduje 161 aminokyselin o relativní molekulové hmotnosti 18,1 kda. PPIL3b má dva polyadenylační signály, AAUAAA (v oblasti 1023 až 1028) a AUUAAA (v oblasti 1048 až 1053), oproti tomu PPIL3a má pouze jeden polyadenylační signál AUUAAA (v oblasti 1100 až 1105). Navíc sekvenční analýza 5 konce ukázala, že PPIL3 má tři alternativní varianty sestřihu, z nichž dvě byly identifikovány (Zhou et al., 2001). Z obou variant PPIL3 byla pouze u PPIL3b zjištěna přítomnost ve spliceosomu, a to sice v sestřihovém komplexu B2 (Chen et al., 2007). O úloze PPIL3b v sestřihu je známo jen velmi málo. Z dostupných informací lze zatím pouze předvídat, že tento cyklofilin je součástí U2 snrnp (Mesa et al., 2008). 28

Huang a kolegové srovnali strukturu PPIL3 s ostatními cyklofiliny (Obr. 11) a zjistili, že má zkrácený N-konec, prodloužený C-konec, a navíc obsahuje jeden disulfidový můstek mezi aminokyselinovými zbytky Cys18 a Cys25. Na první pohled však připomíná klasický cyklofilin. Hlavním motivem v jeho struktuře je osm β-listů složených v β-barel, který je ale v tomto případě ohraničen čtyřmi α-helixy (Obr. 10). Další rozdíly v terciární struktuře byly pozorovány v oblastech Asp8 až Val9, Cys32 až Asn35, Asp73 až Leu79 a Pro135 až Asn145, které jsou všechny lokalizovány na povrchu cyklofilinu a vykazují inzerce či delece aminokyselinových zbytků. Největší rozdíly vykazuje oblast Pro135 až Asn145, v níž dochází ke vzniku tří vodíkových můstků Pro135(O) Leu144(N), Asn137(N) Arg142(O) a Asn37(O) Tyr141(N). Srovnání Obr. 10: Znázornění přirozené konformace PPIL3. Modře jsou vyobrazeny α-helixy, červeně β-listy, fialově je znázorněn disulfidový můstek mezi Cys18 a Cys25. Převzato z Huang et al., 2005. aktivních míst cyklofilinů napovídá, že His43 a Gln52 jsou klíčová místa podílející se na interakcích se substráty. Vazebné místo pro CsA je potom tvořeno třinácti aminokyselinovými zbytky (obdobně jako v případě CypA), jmenovitě Arg44, Phe49, Met50, Gln52, Gly60, Ala90, Asn91, Asn92, Gln100, Phe102, His110, Leu111 a Tyr115. S výjimkou zbytků Asn92, His110 a Tyr115 jsou všechny shodné s těmi v cyklofilinu A, což by mohlo vyústit nanejvýš v drobné odlišnosti při vazbě CsA (Huang et al., 2005). 29

Obr. 11: Srovnání primární struktury lidského PPIL3 s primární strukturou lidského cyklofilinu A, lidského cyklofilinu B, myšího cyklofilinu C a lidského cyklofilinu H. Aminokyselinové zbytky formující α-helixy jsou podtrženy plnou čarou, ty, které formují β-listy, jsou podtrženy přerušovanou čarou. Zeleně jsou zvýrazněny zbytky identické ve všech srovnávaných cyklofilinech, tučně potom ty, které jsou identické ve všech srocnávaných cyklofilinech vyjma PPIL3. Cys18 a Cys25, které formují disulfidový můstek, jsou zvýrazněny červeně. Převzato z Huang et al. 2005. PPIL3 se nachází též v cytoplasmě, kde byla prokázána jeho specifická a silná interakce s proteinem apoptinem, který vyvolává apoptózu transformovaných a nádorových buněk. Pro spuštění apoptózy je ale důležitá přítomnost apoptinu v jádře. Cyklofilin se však váže k jeho C-koncové oblasti (pravděpodobně k aminokyselinovému zbytku Pro109), čímž blokuje NLS a udržuje apoptin v cytoplasmě. Tímto způsobem by zvýšená exprese PPIL3 mohla napomáhat rakovinnému bujení. Role PPIL3 v buněčné lokalizaci tohoto proteinu však nejspíše není až tak zásadní, protože sám nedokáže udržet všechen apoptin mimo jádro (Huo et al., 2008). 30

2.7 PPWD1 PPWD1 (původně popsán pod označením KIAA0073) je cyklofilin asociovaný se sestřihovým komplexem C (Jurica a Moore, 2003). Ve svojí N-koncové oblasti obsahuje WD40 repetici, podle které byl pojmenován (PPWD z anglického peptidyl-prolyl isomerase containing WD40 repeat; Davis et al., 2008). Davis a jeho spolupracovníci analyzovali krystalovou strukturu PPWD1. Konečný model tohoto cyklofilinu se skládá ze tří polypeptidových řetězců (jedná se tedy o homotrimer). Ve struktuře každého z nich lze rozlišit dva α-helixy a osm β-listů tvořících jeden uzavřený β-barel (Davis et al., 2008; Obr. 12). Mezi podjednotkami tohoto trimerního asymetrického komplexu byly pozorovány vzájemné vnitřní interakce. Aktivní místo každého řetězce se totiž váže k sedmi N-koncovým aminokyselinovým zbytkům (Gln-Ala-Glu-Gly-Pro487- Lys-Arg) následujícího řetězce podobným způsobem, jako se váže k substrátu. Přičemž Pro487 se nachází v trans konformaci a je ponořen do aktivního místa přilehlého monomeru, avšak nedochází k jeho katalytickému zpracování. Může se ale jednat o pouhý artefakt krystalizace. Použitá metoda totiž nedokáže rozlišit přirozené interakce od interakcí vzniklých v důsledku krystalizace (Davis et al., 2008). Pokud vnitřní interakce mezi molekulami PPWD1 nevznikly v důsledku krystalizace, potom Obr. 12: (A) Znázornění přirozené konformace PPWD1. Spirály představují α-helixy, šipky představují β-listy. (B) Srovnání struktury PPWD1 (zobrazen fialově) a cyklofilinu A (zobrazen zeleně). (C) Interakce tří molekul PPWD1 v krystalické struktuře. N-koncová část jednoho cyklofilinu je vázána do aktivního místa následujícího cyklofilinu. Převzato z Davis et al., 2008. by mohly v sestřihovém komplexu ovlivňovat seskupování spliceosomu nebo jeho aktivitu (Davis et al., 2008). Obdobné interakce lze totiž pozorovat i mezi dvěma molekulami PPIH, 31