FM styrylové sloučeniny/barvičky (fy. Mol.Probes) fluoreskují po zapojení do membrány. Internalizují se endocyózou. Optimální je pro rostlinné buňky FM4-64
Cytokinese a endocytóza GFP či YFP-AtEB1 a CLIP170 značí + konce MTs. GFP či YFP- MAP4 značí celé MTs.
http://www.pubmedcentral.gov/arti clerender.fcgi?tool=pubmed&pub medid=15831100 Videa, která stojí za vidění jako Suppl. Data na konci článku.
KAT1 draselný vtokový kanál a změny objemu svěracích buněk průduchů. Měření membránové kapacitance
Genom Arabidopsis obsahuje celý komplement genů kódujících a regulujících klatrinové obaly
Various receptors and clathrin protein coats recognize vesicle types, and these are delivered (along cytoskeleton pathways?) to appropriate target sites in the cell. Other recognition molecules, such as (vesicle) v - snares and (target) t-snares are involved in targeting vesicles with one set of contents to one site, and another set of vesicles to another site. Fig. 13-6 Clathrin coated vesicles. Deep freeze etching EM of inner surface of plasma membrane of cultured fibroblast cells.
Aktivovaný receptor (př. receptorová kináza) může stabilizovat vznikající obalené jámy.
v
Internalizace obsazeného receptoru nemusí být jen krok, vedoucí k jeho destrukci (a oslabení signalizace), ale v některých případech signalizace pokračuje v endosomu signalizační endosom. (př. signal. brassinosteroidy BRI1).
Při endocytóze PM velmi pravděpodobně může také docházet k internalizaci (modifikaci a posléze recyklaci) části pektinů a xyloglukanů buněčné stěny. Internalizace AGP, které silně interagují s pektiny.
Po přidání BFA (B) jsou téměř všechny xyloglukany internalizovány do BFA kompartmentu.
U rostlin řada otazníků!
Endosomy
Příklad z živočišné buňky. Odlišný osud obsazených/aktivovaných transferrinových a opioidních receptorů z časného endosomu jdou transferrinové rec. přes recyklující endosom zpět do PM, zatímco opioidní rec. putují do lysosomu /vakuoly přes late endosom.
Nějak podobně je pravděpodobně regulována lokalizace PIN auxinových přenašečových komplexů. Auxin také blokuje endocytózu a tak automaticky zvyšuje výskyt výtokových přenašečů na PM To je pravděpodobně klíčovou součástí procesu kdy auxin reguluje svůj vlastní transport.
Homolog RabF/Rab5 Ara6 je lokalizován v časném endosomu.
GTPázy-lipidy : zákl. regul. smyčka endomembránového systému Lokální specifické domény membránových fosfolipidů jsou klíčovou součástí udržování identity nejen organel, ale také sub- domén na organelách. Proto zvl. Arf, ale i Rho a Rab GTPázy regulují některé aktivity - kinázy, fosfolipázy, flipázy! které vytvářejí lokalizované membránové domény.
Distribution of phosphatidylinositides in cells: PI(4)P (blue) - concentrated on Golgi PI(3)P (green) - early endosomes PI(4,5)P 2 -plasma membrane PI(3,5)P 2 - multivesicular endosomes Roth 2004
Structures of PI(3)P-binding Modules Lemmon 2003
Two RabA of pea have different subcellular localization (detail) toto pozorování ukazuje na různorodost endosomů v jedné buňce.
GTPázy-lipidy : zákl. regul. smyčka endomembránového systému Lokální specifické domény membránových fosfolipidů jsou klíčovou součástí udržování identity nejen organel, ale také sub- domén na organelách. Proto zvl. Arf, ale i Rho a Rab GTPázy regulují některé aktivity - kinázy, fosfolipázy, flipázy! které vytvářejí lokalizované membránové domény.
Endosomy se mohou pohybovat také mechanismem aktinové komety. Pohyb je závislý na polymeraci aktinu a nezávislý na myosinu.
Důležitým nástrojem studia sekreční dráhy je brefeldin A BFA
Obsah BFA kompartmentu odhaluje bílkoviny PM, které cyklují mezi PM a recyklujícím endosomem.
Research tool for membrane trafficking: BFA GDP ARF-GEF GTP Vesicle budding in Golgi is ARF1-dependent; ARF1 undergoes recruitment to Golgi membrane by ARF-GEF-promoted GTP for GDP exchange; ARF1 recruits protein coats (green) needed for vesicle budding; brefeldin A binds at ARF1-GDP /ARF1-GEF interface and inhibits GTP exchange/ membrane recruitment of ARF1 and coats; Golgi stack is disrupted and protein trafficking through the Golgi is inhibited, ALE I DALŠÍ KOMP. Arf-GEFy působí na několika stanicích endom. Syst.
NE KAŽDÝ ARF GEF JE CITLIVÝ K BFA!!
BFA on GA
V rostlinných buňkách se po působení BFA objevují min.dva nové kompartmenty (v různých buňkách různě): 1. Hybridní cisga-er (podobně jako u živočichů). 2. Tzv. BFA- compartment transgaendosom.
Problém interpretace vlivu BFA 1. V buňce je (podle stavu diferenciace) několik GEFů (8x u At) pro několik ARFů(12x u At), různě silně exprimovaných a různě lokalizovaných. 2. Některé ARF-GEFy (u At 3x) nejsou!!! inhibovány BFA.
C, F, I linie odolná k BFA
Polární transport IAA je závislý na polární lokalizaci PIN auxinových výtokových přenašečů. Jejich lokalizace je závislá na polarizované sekreci a aktinovém cytoskeletu.
Recyklace PIN1 je závislá na aktinu
Recyklace IAA přenašeče PIN2 je závislá na jiném typu endosomu obsahujícím sorting nexin 1, který je citlivý k wortmanninu (inhibitor PI-3-Kin, PI3kin)
Cytokinese a endocytóza
Uspořádání Uspořádání MT MT během během buněčného buněčného cyklu cyklu rostlinné rostlinné buňky buňky Po PPB zbývá actin depleted zone a bílkovina TANGLED.
Před nástupem mitózy se tvoří v místě zaostřujícícho se PPB pás zvýšené endocytózy.
F až K EMTs (endplasmic MTs) Dorustají do oblasti předchozího PPB a tak se setkávají s endosomy, které po nich putují v minus-směru.
Inhibitor transportu auxinu NPA (naphthylphthalamic acid) narušuje tvorbu PPB a orientaci buněčné přepážky. (viz. také video)
Endocytóza je intenzivní v místech kde se endoplasmatické MTs setkávají s PPB. Pás endosomů proto leží v těsné blízkosti PPB a je zachován i po rozpadu PPB při tvorbě mitotického vřeténka. Kyselina naftylftalamová (NPA) inhibitor polárního výtoku auxinu - působí anomální PPBs a následně posuny v rovině buněčného dělení.
Dynamiky cytoskeletu a endomembránového systému jsou neoddělitelně recipročně provázány.
či spíše vakuoly
Protoplast aleuronu kukuřice V1=PSV V2=LV
Topologicky je to extracytoplasmatický kompartment a také se velmi rychle vyrovnává se změnami osmotických poměrů v apoplastu.
Prevacuol. comp. Multi Vesicular Body ESCRT complex
Sort. rec. BP-80
Vakuolární lokalizační signály NPIR NPIR
Třídění do lytické vakuoly přes BP-80/ELP receptory.
Prolaminy Agregace jako třídící mechanismus v ER - PB. Lokalizovaná translace na spec. doménách ER.
Od ER odvozená PB jsou obklopována a pohlcována vakuolami. PROBLÉM HOMOTYPICKÉ FÚZE.
PEP12 je prevakuolární t-snare u Arabidopsis
Podstatnou součástí třídění leguminů je jejich postupná agregace v periferních oblastech GA.
CVV, které vznikají na PB dom. GA pravděpodobně odtřiďují složky, které do PSV nepatří.
Tvorba MVB
Třídění bílkovin z MVB do vakuoly je řízeno třemi komplexy ESCRT - u Arabidopsis jsou některé podjednotky známy díky analýze mutantů hyade.
Vesicular traffic and the role of Golgi apparatus (body) as a traffic controller. Protein modifications take place in the Golgi, which result in acquisition of appropriate signals, and hence packaging into correct vesicles. Hydrolytic enzymes are sent to lysosome, export vesicles to plasmalemma and ER membranes and proteins are recycled back to ER (Fig 13-21). Retromer pomáhá recyklovat z PVC do TGN
Homology jsou také u rostlin a je pravděpodobné, že funguje podobně.
Rostliny jsou schopny přežívat fáze nedostatku živin mj. také díky bohatě rozvinuté schopnosti autofagie - degradace cytoplasmatickýchčástí ve speciální vakuole.
Autofagická vakuola 4 dráhy
Bílkoviny řídící tvorbu autofagických vakuol jsou dobře evolučně konzervovány. Celá dráha je aktivována TOR kinázou a pak procesem podobným ubiquitinaci. Důležitou roli hraje PI3K - VPS34, která je inhibována wortmanninem.
Distribution of phosphatidylinositides in cells: PI(4)P (blue) - concentrated on Golgi PI(3)P (green) - early endosomes PI(4,5)P 2 -plasma membrane PI(3,5)P 2 - multivesicular endosomes Roth 2004
Ve vakuole dochází k nespecifické degradaci řady substrátů včetně lipidů, polysacharidů a bílkovin.
Arabidopsis s postiženou tvorbou autofágních vakuol rychleji stárne a hůře odolává hladovění.
Vakuoly jsou centrální pro pochopení života rostlinné buňky.
Robinsonovy shrnující modely 2005