Protilátky proti virulentním faktorům Yersinia enterocolitica (IgA) Návod na provedení WESTERNBLOTU Objednací číslo Určení Ig-Třída Substrát Formát DY 2173-1601 A Yersinia enterocolitica (faktory virulence) IgA WESTERNBLOT proužky potažené virulentními faktory kódovanými plasmidem z kmene O:3 (Vnější membránové proteiny Yersinie) 16 x 01 (16) Indikace: Revmatoidní onemocnění (artritida), erythema nodosum Princip testu: Kit WESTERNBLOT test se používá ke kvantitativnímu in-vitro stanovení lidských protilátek proti virulentním faktorům patogenního kmene Yersinia enterocolitica v séru. Testovací kit obsahuje testovací proužky s virulentními faktory Yersinia enterocolitica rozseparovanými elektroforézou. V prvním kroku jsou proužky inkubovány s naředěným sérem pacienta. V případě pozitivního vzorku se specifické protilátky IgA (IgG, IgM) naváží na antigeny. Pro zviditelnění reakce se používá druhé inkubace s enzymové značenými protilátkami proti lidským protilátkám IgA, které slouží poté jako katalyzátor pro vlastní barevnou reakci. Obsah kitu: - Testovací proužky s elektroforeticky separovanými virulentními faktory: 16 testovacích proužků - Kontrolní proužek na vyhodnocovací matrici: 1 testovací proužek inkubovaný s pozitivním kontrolním sérem - Anti-lidský IgA koncentrát značený alkalickou fosfatázou (kozí): 1 x 3 ml 10x koncentrátu, ze kterého vznikne 30 ml enzymového konjugátu. - Koncentrát pufru: 1 x 50 ml 10 x koncentrátu, ze kterého vznikne 500 ml univerzálního pufru připraveného k použití. - Roztok substrátu: 1 x 30 ml, připraveno k použití, Nitroblue tetrazolium chloride/5- bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (NBT/BCIP) - Hodnotící matrice a protokol - Inkubační vanička: 2 x 8 kanálků - Fólie - Návod k použití Uskladnění a stabilita: Diagnostický kit musí být skladován při teplotě mezi +2 o C až +8 o C, nesmí být zmražen. Datum expirace je vytištěno na štítku na kitu. Poznámky km použití: Součásti každé série testovacího kitu si vzájemně odpovídají. Aby byla zaručena správnost kitu používejte pouze součásti z jedné série. Balení obsahuje testovací proužek s dvojmístným číslem navíc k sériovému číslu kitu. Toto je sériové číslo proužku a je rovněž vytištěno na odpovídající hodnotící matrici. K zaručení správného výsledku testu musí obě čísla souhlasit. 1.
Upozornění: U séra použitého pro kontrolní proužek nebyly detekovány ani HBsAg nebo protilátky proti HIV-1 nebo HIV-2. Nicméně, s kontrolní proužkem musí být zacházeno se stejnou opatrností jako s infekčním materiálem. Některé reagencie jsou toxické (pufr, roztok substrátu). Vyvarujte se kontaktu s kůží. V případě kontaktu, omyjte kůži mýdlem a velkým množstvím vody. Příprava reagencií Poznámka: Všechny reagencie se musí nechat před použitím vytemperovat na pokojovou teplotu. Potažené proužky: Připravené k použití. Abyste zabránili zvlhnutí proužků po otevření, neotevírejte balení obsahující proužky, dokud nedosáhne pokojové teploty. Po odebrání příslušného počtu proužku, balení dobře uzavřete a uchovávejte ho při +2 - +8 o C. K zaručení správného výsledku testu, musí sériové číslu vytištěné na balení a testovacích proužcích souhlasit s tím, které je uvedeno na kontrolní matrici. Univerzální pufr: 10 x koncentrát. K vytvoření univerzálního pufru odpipetujte ze zásobní lahve příslušné množství a pomocí destilované nebo deionizované vody je zřeďte v poměru 1:10. Například: na 1 testovací proužek zřeďte 1.5 ml koncentrátu 13.5 ml destilované nebo deionizované vody. Naředěný univerzální pufr může být uchováván maximálně po dobu 1 týdne při při +2 - +8 o C. V koncentrátu se mohou objevit krystaly, proto před naředěním zahřejte pufr na 37 o C a dobře ho promíchejte. Enzymový konjugát: Anti-lidský IgA koncentrát je 10 x koncentrovaný. K vytvoření enzymového konjugátu připraveného k použití odpipetujte potřebné množství z lahve a zřeďte ho v poměru 1:10 univerzálním pufrem. Například: na 1 testovací proužek zřeďte 0.15 ml anti-lidského IgA 1.35 ml univerzálního pufru. Roztok substrátu: Připravený pro užití. Uzavřete láhev ihned po použití, obsah je citlivý na světlo. Ředění séra a vzorků plasmy Vzorky séra a plazmy pro analýzu se ředí 1: 51 univerzálním pufrem. Například, přidejte 30 µl séra k 1.5 ml vzorkového pufru a dobře promíchejte. 2.
Inkubace Blokování: Naplňte příslušný počet kanálků na misce odpovídajících počtu vzorků séra 1.5 ml naředěného univerzálního pufru. Z balení pomocí pinzety odeberte potřebný počet proužků a umístěte je do kanálků. Inkubujte na třepačce po dobu 15 minut. Poté veškerou kapalinu vylijte. Inkubace se sérem: Naplňte každý kanálek 1.5 ml naředěného vzorku séra a (1. krok) inkubujte při pokojové teplotě na třepačce 30 minut. Promytí: Odsajte veškerou kapalinu z kanálků a každý kanálek promyjte na třepačce 3 x 5 minut naředěným univerzálním pufrem. Inkubace s konjugátem: Do každého kanálku pipetujte 1.5 ml naředěného enzymového (2. krok) konjugátu a inkubujte po dobu 30 minut při pokojové teplotě na třepačce. Promytí: Odsajte veškerou kapalinu z kanálků a každý kanálek promyjte na třepačce 3 x 5 minut naředěným univerzálním pufrem. Inkubace se substrátem: Pipetujte do každého kanálku 1.5 ml roztoku substrátu. (3. krok) Inkubujte na třepačce při pokojové teplotě 10 minut. Zastavení: Odsajte kapalinu ze všech kanálků a promyjte každý proužek 3x destilovanou nebo deionizovanou vodou. 3.
Anti-virulentní faktory Yersinia enterocolitica WESTERNBLOT Inkubační protokol Příprava: Pipetujte 1.5 ml univerzálního pufru do inkubačních kanálků obsahujících proužky 15min Třepat 1. Inkubace se vzorkem Odsajte kapalinu, do inkubačních kanálků pipetujte 1.5 ml naředěného vzorku séra (1:51). 30min Promytí: 3x5 min 2. Inkubace s konjugátem: Odsajte kapalinu, pipetujte 1.5 ml naředěného enzymového konjugátu (1:10) do inkubačních kanálků. 30min Promytí: 3x5 min 3. Inkubace se substrátem Odsajte kapalinu, pipetujte 1.5 ml roztoku substrátu do inkubačních kanálků 10min Třepat Třepat Třepat Zastavení: Odsajte kapalinu a propláchněte vodou Visuální hodnocení 4.
Hodnocení testu a interpretace výsledků anti-virulentních faktorů Yersinia enterocolitica WESTERNBLOT (IgA) Zacházení: Položte proužek na filtrační papír, opatrně ho otřete pomocí savého papíru a za použití průhledné adhesivní pásky ho přilepte na dodaný plastický film. Poté přiložte plastický film obsahující proužek na vyhodnocovací protokol. Držte hodnotící matrici proti testovacímu proužku a umístěte ji tak, že černá čárka nad testovacím proužkem bude v přímce se srovnávací čárou na vyhodnocovací matrici. Sériové číslo na matrici se musí shodovat s číslem na balení, ze kterého byl proužek vzat. Pruhy na testovacím proužku, které se shodují s testovacím proužkem zapište do vyhodnocovacího protokolu. Pod číslem na proužku je kontrolní pruh. Inkubace byla provedena správně pouze tehdy, když je tento kontrolní proužek silně zabarven. Antigeny: Lidský patogenní kmen Yersinia enterocolitica obsahuje plasmid o velikosti přibližně 70 kilo bazí. V tomto plasmidu jsou zakódovány důležité virulentní nebo patogenní faktory. Za podmínek nedostatku vápníku jsou některé z těchto virulentních faktorů sekretovány do růstového média (1,2). Tyto virulentní faktory jsou popisovány jako Yersinia outer membrane proteins (YOP) nebo také jako release proteins (RP). Charakteristikou těchto virulentních faktorů je fakt, že jsou specifické pro Yersinia enterocolitica a nebyly nalezeny u žádných jiných baktérií. Lidské patogenní kmeny Yersinia enterocolitica (O:3, O:9, O:8, O:5.27, atd.) vždy nesou tento virulentní plasmid. Virulentní faktory kódované v tomto plasmidu se mírně liší v molekulových vahách, které závisí na daných kmenech Yersinia enterocolitica. Charakteristikou je vysoký stupeň zkřížené reaktivity virulentních faktorů v rámci jedné skupiny lidských patogenních kmenů. V tomto případě, použijete-li virulentní faktory jednoho patogenního kmene, je zaručena specifita a citlivost u protilátek i proti jiným patogenním kmenům. Zdroj antigenu u EUROIMMUN WESTERN BLOT testů pro určení protilátek proti virulentním faktorům Yersinia enterocolitica jsou purifikované virulentní faktory z kmene Yersinia entorecolitica O:3. Yersinia entorecolitica O:3 byla kultivována za podmínek nedostatku vápníku a virulentní faktory byly izolované ze supernatantu kultury. Purifikované virulentní faktory byly solubilizovány za použití dodecyl sulfátu sodného. Solubilizované proteiny byly separovány pomocí diskontinuální polyakrylamidové elektroforézy podle molekulových hmotností a takto separované proteiny byly přeneseny na membránu. Z každého kitu byly odebrány dva proužky a pro kontrolu inkubovány s referenčním sérem. Jeden z těchto nabarvených proužků byl vrácen do kitu. Charakteristiky antigenů obsažených na testovacím proužku: (3) Antigen (mol. hmot., Nomenklaturní Funkce zkratka) alternativní název) 46 kda (p46) YopM (Yop2a) Inhibice agregace destiček 44 kda (p44) YopH (Yop2b) Prevence fagocytózy makrofágy 38 kda (p38) LorV (V antigen) 36 kda (p36) YopD (Yop4a) Zesílení cytotoxického efektu YopE nebo translokace YopE u Eukaryotické buněčné stěny. 34 kda (p34) YopN (Yop4b) 30 kda (p30) YopP (Yop30) 25 kda (p25) YopE (Yop5) Cytotoxický efekt na HeLa buňky, pokles 5.
fagocytózy makrofágy. IgA a IgG třída protilátek proti virulentním faktorům Yersinia enterocolitica Protilátky IgA, IgG a IgM mohou být detekovány v počáteční fázi následující po kontaktu s virulentními faktory Yersinia enterocolitica. IgA a IgM titry po několika měsících klesnou. Protilátky třídy IgG zůstávají déle a ohou být v séru detekovány po 12 měsíců a déle a pérvotním kontaktu. U chronických forem onemocnění a imunopatologických komlikací mohou být IgG a i IgA protilátky detekovány i po delší době 4. V zásadě může být použito následující vyhodnocovací schéma. Uzavřený kontrolní proužek je použit ke srovnání intenzit pruhů. Pruh p46 (YopM nebo Yop2a) je jako příklad zřetelného proužku s vysokou intenzitou. Ostatní pruhy na proužku jsou střední (viz. pruh p25) a velmi slabé (viz. pruh p38) intenzity. Intenzita pruhu p25 přísluší hraniční intenzitě. Pruhy o slabší intenzitě musí být brány jako negativní. IgA třída protilátek Výsledek Negativní Hraniční Pozitivní Charakteristika Žádný pruh. Alespoň jeden pruh. Praxe ukazuje, že hlavní imunitní odpověď u IgA testu je namířena proti pruhu p36. Alespoň jeden silný výrazný pruh. IgG třída protilátek Výsledek Negativní Hraniční Pozitivní Charakteristika Žádný pruh nebo jeden pruh střední intenzity. Jeden silný zřetelný pruh nebo alespoň dva pruhy střední intenzity. Alespoň dva silné výrazné pruh. 6.
Klinické symptomy infekce Yersinia enterocolitica Kmen Yersinia z rodu Enterobactoriceae zahrnuje tři typy: Y. pestis, Y. pseudotuberculosis a Y. enterocolitica. Je známo více než 60 rozdílných serovarů typu Yersinia enterocolitica. Patogenní serovary nesou virulentní plasmid s asi 70 páry kilo-bazí. Hlavní kauzativní zástupci infekcí u Yersinia enterocolitica jsou serovary O:3, O:9, O5.27 a O:8 (vyskytující se převážně v USA). Za infekce Yersinia enterocolitica v Evropě je asi ze 75% odpovědný kmen O:3 a asi z 20% kmen O:9. Klinické symptom infekce mohou být rozděleny do enteritických a extramesenteriálních forem (4). Nejrozšířenější forma infekce Yersinia enterocolitica u dětí a dospívajících je enteritida dohromady s mesenterickou adenitis, vyjímečnou bolestí, horečkou a průjmem, stejně jako pseudoapendicitidou. U dospělých se navíc může objevit infekce v tenkém a tlustém střevě. U asi 20 25% hlavně dospělých pacientů a objeví extramesenteriální infekce s nebo bez předcházející enteritidy. Hlavní charakteristiky těchto infekcí jsou septická forma, vyznačující se peritonitidou, mnohonásobné orgánové abscesy, vaskulitida, průjem, hepatitida a lymfadenopatie s průjmem, splenomegalií a ztrátou váhy. Mezi nefrekventovanější imunopatologické symptomy infekce Yersinia enterocolitica patří reaktivní artritida a erythema nodosum. Reaktivní artritidy jsou spojeny v mnoha případech s dolními končetinami. Artiritida může být v některých případech zcela vyléčena za 3-12 měsíců, ale může se rozvinout také chronická a nevyléčitelná artritida. V některých případech může Yersinia enterocolitica přetrvat roky v intestinální sliznici a v lymfatických tkáních. Persistence může být spojena s přítomností specifických sérových protilátek třídy IgA. U 60-80% pacientu s reaktivní artritidou může být detekován HLA-B27 histokompatibilitní antigen. Reaktivní artritida je často spojena s erythema nodosum, obzvláště u žen. Symptomy na kůži se objeví asi 1 6 týdnů po infekci. 7.
Literatura 1. Heesemann, J., Gross, U.. Schmidt, N., Laufs, R.: lmmunochemical Analysis of Plasmid-Encoded Proteins Released by Enteropathogenic Yersinia sp. Grown in Calcium-Deficient Media. Infect. Immun. 54(2): 561-567 (1986). 2. Heesemann, J.: Enteropathogene Yersinien: Pathogenitatsfaktoren und neue diagnostische Methoden. lmmun. lnfekt. 18: 186-191. 3. Paerregard, A.: Interactions between Yersinia enterocolitica and the host with special refe- rence to virulence plasmid encoded adhesion and humoral immunitiy. Dan. Med. Bull 39 (2): 155-172 (1992). 4. Hoogkamp-Korstanje, J. A. A., de Koning, J.: Klinik, Diagnostik und Therapie von Yersinia- enterocolitica-infektionen. Irnmun. lnfekt. 18: 192-197 (1990). 5. Burkhardt, F.: Mikrobiologische Diagnostik: 141-145, Thieme Veriag Stuttgart (1992). 6. Nesbakken, T., Kapperud, G., Lassen, J., Skjerve, E.: Yersinia enterocolitica 0:3 Antibodies in Slaughterhouse Employees, Veterinarians, and Military Recruits. Contrib. Microbiol. Immunol. 12: 32-39 (1991). 8.