Objednací číslo Protilátky proti Třída Ig Substrát Formát DY M DY M. Ag-potažené proužky membrány

Transkript

1 Protilátky třídy IgM proti Borrelia afzelii Návod na použití WESTERNBLOT testu Objednací číslo Protilátky proti Třída Ig Substrát Formát DY M IgM DY M Borrelia afzelii (kompletní antigeny) Ag-potažené proužky membrány 16 x 01 (16) 30 x 01 (30) Indikace: Lymská borelioza. Přidružené nemoci: erythema chronicum migrans, lymphadenosis cutis benigna, acrodermatitits chronica, arthritis, carditis, neuroborreliosis. Princip testu: WESTERNBLOT test umožňuje kvalitativní in-vitro stanovení lidských protilátek proti Borrelia afzelii. Test obsahuje proužky s elektroforeticky rozdělenými extrakty antigenů z Borrelia afzelii. Proužky blotu jsou blokovány a v prvním reakčním kroku se inkubují s ředěnými vzorky (sérum, plasma) pacientů. V případě pozitivních vzorků, se specifické protilátky třídy IgM (také IgA a IgG) navážou na antigeny. K detekci navázaných protilátek slouží druhá inkubace provedená s protilátkou proti lidským IgM značenou enzymem (enzymový konjugát), která je schopna vyvolat barevnou reakci. Obsah kitu: Součást Formát Formát Symbol 1. Testovací pružky 16 x1 30 x 1 PROUŽKY S elektroforeticky rozdělenými antigeny (STRIPS) Borrelia afzelii 2.Vyhodnocovací matrice s kontrolními 1 vzorek 1 vzorek proužky 1 testovací proužek inkubovaný s kontrolním pozitivním sérem 3.Enzymový konjugát Koncentrované alkalickou fosfatasou značené kozí anti-lidské IgM protilátky, 10 x koncentrované 1 x 3 ml 2 x 3 ml KONJUGÁT 10X (CONJUGATE 10X) 4. Univerzální pufr 10 x koncentrovaný 1 x 50 ml 1 x 100 ml PUFR 10 X (Buffer 10 x) 5. Substrátový roztok NBT/BCIP, připravený k použití 1 x 30 ml 1 x 50 ml SUBSTRÁT (SUBSTRATE) 6. Vyhodnocovací protokol 1 list 2 listy Inkubační komůrka 2 x 8 -- KOMŮRKA žlábků (TRAY) 8. Plastová folie 1 folie 2 folie 9. Návod k použití testu 1 brožura 1 brožura LOT Lot Skladovací teplota IVD In-vitro určení Neotevřený kit je upotřebitelný do: Uskladnění a stabilita: Diagnostický kit musí být skladován při teplotě mezi +2 o C až + 8 o C, nesmí být zmražen. Souprava, obsahuje-li všechny součásti neotevřené, vydrží až do vyznačeného data expirace. 1

2 Nakládání s odpadem: Neředěná séra pacientů a inkubované proužky blotu jsou potenciálně infekční materiál a jako s takovým se s ním musí zacházet. Pro ostatní reagencie neplatí zvláštní pravidla a zachází se s nimi podle platných předpisů. Příprava a stabilita reagencií Poznámka: Jednotlivé součásti testovací soupravy jsou připraveny tak, že jsou optimalizovány k použití v dané soupravě. Pro správné provedení testu je tedy nutné používat jen součásti se stejným číslem šarže (lot). Sáček obsahující testovací proužky je vedle čísla lot označen dvouciferným číslem. Toto číslo označuje sérii proužků a je také vyznačeno na odpovídajícím vyhodnocovacím templátu. Tato dvě čísla musí souhlasit, aby mohl být test správně proveden. Všechny reagencie se musí nechat před použitím vytemperovat na pokojovou (+18 C až 25 C) teplotu. Potažené testovací proužky: Neotvírejte balení s proužky dříve, než jsou pružky membrány vytemperované na pokojovou teplotu, zabráníte tím zvlhnutí jednotlivých proužků. Ihned po vyndání proužků, které budete užívat, přemístěte zbylé proužky zpět do ochranného zalepovacího obalu a obal stiskem lepícího švu uzavřete. Zbylé proužky v již jednou otevřeném ochranném obalu se musí skladovat na suchém místě v rozmezí teplot +2 o C až + 8 o C, lze je použít po dobu nejméně dvou měsíců. K získání správných výsledků je nutné, aby se shodovalo číslo série na sáčku a na vyhodnocovacím templátu. Lot číslo na testovacích proužcích musí být identické s lot číslem na vyhodnocovací matrici. Universální pufr (10 x koncentrovaný): Pro přípravu universálního pufru pro použití odebereme z lahvičky potřebné množství koncentrovaného pufru čistou pipetou a zředíme je 1:10 deionizovanou, nebo destilovanou vodou. Na inkubaci jednoho proužku je potřeba 1,5 ml koncentrovaného pufru, který se naředí 13,5 ml deionizované nebo destilované vody.naředěný pufr se musí použít v den ředění. Enzymový konjugát: Anti-lidské IgM jsou 10 x koncentrované. Pro přípravu enzymového konjugátu pro užití v testu odebereme z lahvičky potřebné množství konjugátu čistou pipetou a zředíme je 1:10 univerzálním pufrem. Na otestování jednoho proužku je potřeba 0,15 ml koncentrátu anti-lidského IgM konjugovaného s alkalickou fosfatázou, který se naředí 1,35 ml universálního pufru. Naředěný enzymový konjugát se musí použít v den ředění. Substrátový roztok: Připravený pro užití. Uzavřete láhev ihned po použití, obsah je citlivý na světlo. Upozornění: Kontrolní séra užitá pro vyhodnocovací matrici jsou testována na nepřítomnost HBsAG, anti-hcv, anti- HIV-1 a anti-hiv-2 pomocí enzymoimunologických testů a nepřímých imunofluorescenčních metod. Nicméně, se vším uvedeným materiálem se musí zacházet jako s potenciálně infekčně nebezpečným a musí se s ním pracovat velmi opatrně. Vyvarujte se kontaktu s kůží. Příprava a stabilita vzorků séra a plasmy Materiál vzorků: Lidská séra, nebo EDTA, heparinovaná plasma, či plasma v citrátu. Stabilita: Vzorky sér pacientů, které mají být testovány lze skladovat většinou při teplotě + 2 C až + 8 C po dobu 14 dnů. Ředěné vzorky by se měly zpracovat v den ředění. Ředění vzorků: Vzorky séra a plazmy pro analýzu se ředí 1: 51 universálním pufrem. Například, přidejte 30 µl séra k 1,5 ml naředěného universálního pufru a dobře promíchejte (vortexem). Pipety nejsou na promíchání vhodné! 2

3 Inkubace Blokování: Naplňte žlábky v inkubační komůrce podle počtu vzorků séra, které mají být testovány, a to tak, že do každého žlábku napipetujte 1,5 ml universálního pufru. Vyjměte potřebný počet testovacích proužků ze sáčku a vložte po jednom do žlábků. Číslo na proužku musí být dobře viditelné. Inkubujte 15 minut při pokojové teplotě na třepačce. Poté odsajte ze žlábků veškerou kapalinu. Inkubace vzorků: (1.krok) Promývání: Naplňte každý žlábek naředěným vzorkem séra a inkubujte při pokojové teplotě po dobu 30 minut na třepačce. Odsajte veškerou kapalinu z každého žlábku a promyjte 3 x 5 minut každý žlábek 1,5 ml universálního pufru za stálého třepání. Inkubace konjugátu: Napipetujte 1,5 ml ředěného enzymového konjugátu ( anti-lidské IgM (2. krok) kojugované s alkalickou fosfatázou) do každého žlábku a inkubujte při pokojové teplotě po dobu 30 minut na třepačce. Promývání: Odsajte veškerou kapalinu z každého žlábku a promyjte 3 x 5 minut každý žlábek 1,5 ml universálního pufru za stálého třepání. Inkubace substrátu: Napipetujte 1,5 ml roztoku substrátu do každého žlábku a (3. krok) inkubujte při pokojové teplotě po dobu 10 minut na třepačce. Zastavení: Odsajte veškerou kapalinu z každého žlábku a promyjte každý žlábek 3 x deionizovanou nebo destilovanou vodou. 3

4 Vyhodnocení a interpretace výsledků testu Anti-Borrelia afzelii-westernblot (IgM) Postup zpracování výsledků: Po zastavení reakce pomocí deionizované, či destilované vody, vložte pomocí páru pinzet inkubovaný proužek blotu na odpovídající políčko vyhodnocovacího protokolu. Polohu proužku lze upravit pouze tehdy, je-li proužek vlhký. Po vyschnutí zůstanou proužky přilepeny na folii. Jakmile se do vyhodnocovacího protokolu přenesou všechny proužky, vysuší se přiložením a silným přitlačením filtračního papíru. Jestliže se vyhodnocení provádí digitálně pomocí Euroscanu, proužky blotu by se měly přenést na odpovídající pracovní listy, a to způsobem popsaným výše. Po vyschnutí proužků blotu se proužky oskenují a pro uchování se překryjí adhesivní folií. Přiložte vyhodnocovací matrici k nalepeným proužkům tak, že černý proužek nad čísly proužků s bloty je v jedné linii se značením na vyhodnocovací matrici. Lot číslo matrice musí odpovídat lot číslu proužků blotu! Jasně rozpoznatelné proužky na blotu, které zaujímají stejnou pozici jako vyznačené proužky na vyhodnocovací matrici, se zaznamenají do vyhodnocovacího protokolu. Poznámka: Pod číslem na proužku blotu je kontrolní proužek. Správné provedení inkubace je potvrzeno intenzivním vybarvením kontrolního proužku. Antigeny: Zdrojem antigenů pro EUROIMMUN Anti borrelia afzelii WESTERNBLOT je zvláště vhodný kmen Borrelia afzelii (1,2). Napěstovaná kultura borrelie se solubilizuje pomocí dodecylsulfátu, poté následuje rozdělení solubilizovaných proteinů podle molekulární hmotnosti pomocí diskontinuální elektroforezy na polyakrylamidovém gelu a přenos rozdělených proteinů na nitrocelulosovou membránu. Z každé soupravy (kitu), se odeberou dva proužky a inkubují se s referenčním sérem Jeden z těchto proužků je součástí testu, druhý zůstává u EUROIMMUN pro potřeby dokumentace. Diagnosticky významné antigeny jsou charakterizovány pomocí monoklonální referenční protilátky dodávané německou Národní referenční laboratoří pro Borreliae. (10). Specifikace antigenů na testovacích proužcích: (3,4,5) Proužek Antigen Specifičnost 83 kda Membránový vesikulární Degradační produkt p100, vysoká specificita protein, p83 75 kda Heat-shock protein, p75 Nespec. 62 kda Heat-shock protein, p62 Nespec. 60 kda Heat-shock protein, p60 Nespec. 50 kda p 50 Nespec. 43 kda p 43 Nespec. 41 kda Flagelin, p 41 Rodově specifický, křížová reaktivita s dalšími spirochaetaceae a bakteriemi majícími bičík 39 kda Bmp A, p 39 Vysoká specificita 35 kda p 35 Specifita nejasná 31 kda Osp A, p 31 Protein A vnějšího povrchu, vysoká specificita 30 kda p 30 specifický 4

5 28 kda p 28 Specificita nejasná 25 kda Osp C, p 25 Protein C vnějšího povrchu, vysoká specificita 21 kda p 21 specifický 19 kda p 19 specifický 17 kda p 17 specifický p 19 Specifita nejasná Třída protilátek IgG proti Borrelia afzelii Mají-li být správně vyhodnoceny získané signály, je nutné vzít do úvahy jednak pozici proužků a jednak intenzitu zabarvení. Negativní séra někdy dávají v jednotlivých proužcích na blotu slabé signály. Antigeny Borrelia afzelii lze obecně rozdělit do tří kategorií (6). kategorie antigeny 1 Křížově reagující a nedefinované antigeny s molekulovou hmotností 16 kda, 28 kda, 35 kda, 43 kda, 50 kda, 60 kda, 62 kda a 75 kda. 2 Rodově specifický antigen s molekulovou hmotností 41 kda (flagelin) 3 Druhově specifické antigeny a vysoce specifické antigeny s molekulovou hmotností 17 kda, 19 kda, 21 kda, 25 kda, 30 kda, 31 kda, 39 kda a 83 kda. Interpretace výsledků. Ze zkušenosti víme, že výsledky Borrelia afzelii-westernblot testu lze rozdělit do tří kategorií: negativní, nerozhodné a pozitivní výsledky. výsledky charakteristika negativní Žádné proužky, nebo slabá intenzita některých antigenů z kategorie 1 a 2. nerozhodné Charakteristický proužek z kategorie 3 (antigeny v kategorii 3 jsou ve vyhodnocovacím protokolu vystínované šedě!) a několik charakteristických proužků z kategorie 1 a 2. Doporučujeme odebrat nový vzorek a test zopakovat po několika týdnech. pozitivní Více než jeden charakteristický proužek z kategorie 3 (antigeny v kategorii 3 jsou ve vyhodnocovacím protokolu vystínované šedě!). Kromě toho lze nalézt, zvláště potom u pacientů v pozdním stadiu, četné proužky z kategorie 1 a 2. Třída protilátek IgM proti Borrelia afzelii Interpretace výsledků: Pro detekci protilátek třídy IgM jsou kategorie antigenů stejné, jako pro třídu protilátek IgG. V raných stádiích infekce Borrelií jsou IgM protilátky typicky zaměřeny proti Osp C (p 25). Protilátky IgM proti dalším specifickým antigenům z Borrelie nepředstavují přesné indikátory čerstvé infekce Borrelií. Protilátky třídy IgM proti flagelinu (p 41) reprezentují počáteční odpověď těla na infekci Borrelia afzelii. Avšak nelze vyloučit ani nespecifickou reakci, protože je známo, že i protilátky proti jiným mikroorganismům mohou křížově reagovat s flagelinem Borrelie afzelii (p 41). Z tohoto důvodu se jednoduchý proužek na místě odpovídajícím flagelinu (p 41) při IgM detekci nepovažuje za důkaz čerstvé infekce Borrelia afzelii. Jestliže se zjistí pozitivní reakce pouze s proužkem odpovídajícím flagelinu (p 41), musí se test opakovat po několika týdnech s čerstvým vzorkem krve. 5

6 Při sérologické detekci infekce Borrelií je velmi často určení protilátek třídy IgM nejasné. Protilátky třídy IgM lze někdy v krvi nalézt i léta po infekci, či po léčbě antibiotiky. Z tohoto důvodu nemusí být protilátky třídy IgM důkazem pro čerstvou infekci. Ani negativní hodnota protilátek třídy IgM nemusí vyloučit čerstvou infekci. Při druhé infekci se tvoří pouze protilátky třídy IgG a nikoli IgM. Ani v pozdním stádiu borelliosy pozitivní výsledky na IgM nepodávají žádnou informaci o infekci díky persistenci na antibiotika, jak jsme uvedli výše. Příčina zjištěné falešné pozitivity na IgM je často nejasná.tato falešná pozitivita se projevuje například při infekční mononukleose, infekcích herpes virem a při různých autoimunitních nemocech (10). Pro diagnosu čerstvé infekce Borrelií by měly být pozitivní výsledky na IgM potvrzeny pozitivními výsledky na IgG, které by se měly získat z čerstvých vzorků krve o 3 až 6 týdnů déle. Výsledek Negativní Nejsou rozpoznatelné žádné proužky, nebo jen slabá reakce s proužky antigenů kategorie 1 Nerozhodný Jeden antigen kategorie 2 (flagelin, p 41) nebo slabý proužek z kategorie 3 Doporučujeme odebrat nový vzorek a test zopakovat po několika týdnech. Pro čerstvou infekci jsou charakteristické protilátky proti Osp C. Pozitivní Alespoň jeden charakteristický proužek z kategorie 3 (antigeny v kategorii 3 jsou ve vyhodnocovacím protokolu vystínované šedě!). Pro čerstvou infekci jsou charakteristické protilátky proti Osp C. Klinický význam Lidské patogenní druhy Borrelia afzelii a Borrelia garonii a Borrelia burgdorferi sensu stricto jsou zahrnovány do šířeji chápaného druhu Borrelia burgdorferi sensu lato. Borrelia patří do rodiny Spirochaetaceae, která obsahuje následující rody: Borrelia, Spirochaeta, Cristispira a Treponema. Lidská patogenní Borrelia je patogenním činidlem nemoci přenášené klíšťaty nazvané Lymská borreliosa (8,9,).V USA byla ze vzorků pacientů izolována pouze Borrelia burgdorferi, zatímco v Evropě byly v sérech pacientů detekovány všechny tři druhy lidských patogenních Borrelií (2). U většiny lidí infikovaných Borrelií se v séru nalézá velké množství protilátek proti Borrelii. Obecné rozšíření těchto protilátek v normální lidské populaci v Německu je v průměru méně než 15 %, pokud se nezahrnují endemické oblasti. Osoby pracující v lesnictví vykazují protilátky proti Borrelii ve 40 % případů. Infekce Borrelií se projevuje v oblasti dermatologie, neurologie, oftalmologie a interní medicíny. Stádium 1: Typickým prvotním projevem infekce Borrelií je erythema chronicum migrans, projevující se zarudnutím kůže okolo místa zakousnutí klíštěte a šířící se v kruhu. Erythema je doprovázena obecnými příznaky podobnými chřipce, teplotou, zimnicí, bolestmi hlavy a zvracením. U některých případů se projeví lymfadenopatie (lymphadenosis cutis benigna). Stádium jedna může přejít ve spontánní vyléčení, nebo se může vyvinout ve všeobecnou borreliosu.přechodné stádium se nevyznačuje žádnými příznaky: protilátky třídy IgM jsou detekovány u 50 % až 90 % pacientů ve stádiu 1. 6

7 Obecný výskyt protilátek třídy IgG je nízký. V tomto stádiu nemoci sérologické testy velmi často dávají negativní výsledky. Jsou-li přítomné odpovídající symptomy, doporučuje se, aby byl pacient znovu vyšetřen v následujících několika týdnech. Stádium 2: Po uplynutí několika týdnů, až měsíců po kousnutí klíštětem se mohou projevit další symptomy. V popředí těchto příznaků stojí příznaky neurologické: meningitida, encefalitida, asymetrická polyneuritida, paréza kraniálního nervu, Bannwarthova lymfocytická meningoradikuloneuritida. Velmi často se vyskytuje také artritida, zvláště potom kolenního kloubu a nelokalisované bolesti kostí, kloubů a svalů. Méně často se vyskytují kardiologické projevy, jako je myokarditida a perikarditida. Ve druhém stádiu lze protilátky proti Borrelii prokázat u 50 % až 90 % pacientů. V ranné fázi tohoto stádia se nalézají IgM, v pozdní fázi často jen IgG protilátky. Avšak hladina protilátek IgM může přetrvávat po dlouhou dobu. Stádium 3: Typickým příznakem infekce Borrelií ve třetím stádiu jsou chronické recidivy artritidy, acrodermatitis chronica atrophicans a progresivní encefalomyelitidy, která se může vyvíjet podobně jako roztroušená sklerosa. Bez léčení přechází nemoc do třetího stádia během let až desetiletí po primární infekci. V tomto stádiu jsou hladiny IgG významně zvýšeny u 90 % až 100 % pacientů. Hladiny IgM jsou detekovány jen zřídka. Infekce Borrelia burgdorferii může být sérologicky detekována u mnoha pacientů s různými příznaky ( například, s extensivními artritickými stížnostmi, či u vážných neurologických symptomů), jejichž příčina nebyla předtím jasná. Pro diagnostiku neuroboreliosy je rozhodující určení protilátek v mozkomíšním moku, což má tu výhodu, že v mozkomíšním moku se oproti séru velmi zřídka vyskytují křížově reagující protilátky, které by mohly interferovat s testem. Proto lze v mozkomíšním moku detekovat neuroboreliosu s největší přesností. Pro určení infekce protilátek proti Borrelia burdorferi se užívá mnoho metod: ELISA, imunofluorescence, pasivní hemaglutinace a WESTERNBLOT. Mnoho pracovišť provádí pro primární charakterizaci vzorku séra ELISA test paralelně s nepřímým imunofluorescenčním testem. Substráty užité v EUROIMMUN Anti-Borreelia-burgdorferiimmunofluorescence test, objednací číslo: F a kitů EUROIMMUN Anti-Borreeliaburgdorferi ELISA, objednací číslo:ei 2132 kitech pokrývají celé spektrum antigenů těchto bakterií.obecně se má za to, že užití přípravků tohoto typu umožňuje vyšší hladinu diagnostické spolehlivosti, než je tomu u kitů užívajících pouze jeden antigen. Potvrzení pozitivní reakce vzorku lze získat zvláště užitím kitu EUROIMMUN Anti-Borreelia-afzelii- WESTERNBLOT, objednací číslo: DY 2131, EUROIMMUN Anti-Borreeliaburgdorferi-WESTERNBLOT, objednací číslo: DY 2132 a EUROIMMUN Anti- Borreelia-garinii-WESTERNBLOT, objednací číslo: DY Literatura: 1. Johnson, R., Schmid, G. P., Hyde, F. W., Steigerwalt, A. G., Brenner, D. J.: Borrelia burgdorferi sp. nov.: Etiologic agent of lyme disease. Int. J. Syst. Bacteriol. 34: (1984). 2. Burgdorfer, W., Barbour, A. G., Hayes, S. F., Benach, J. L., Grunwaldt, E., Davis, J. P.: Lyme disease - A Tick - Borne Spirochetosis? Science 216: (1982). 7

8 3. Ma, B., Christen, B., Leung, D., Vigo-Pelfrey, C.: Serodiagnosis of Lyme Borreliosis by Western Immunoblot: Reactivity of varius significant antibodies against Borrelia burgdorferi. J. Clin. Microbiol. Feb./1992: Zöller, L., Burkard, S., Schäfer, H.: Validity of Western Immunoblot band patterns in the serodiagnosis of Lyme Borreliosis. J. Clin. Microbiol. Jan./1991: Moskophidis, M., Luther, B.: Wertigkeit des Immunoblots in der Serodiagnostik der Lyme-Borreliose. LAB-med 19: (1995). 6. Tilton, R. C., Ryan, R. W.: The laboratory diagnosis of Lyme disease. J. Clin. Immunoassay. 16: (1993). 7. Horst, H.: Einheimische Zeckenborreliose (Lyme-Krankheit) bei Mensch und Tier. 2. Auflage. PERIMED-spitta Med. Verl.-Ges., Nürnberg (1993). 8. Kienholz, S., Ohly, C., Kienholz, M.: Zecken: Infektionen mit Borrelia burgdorferi. Diagnose und Labor 42: (1992). 9. Hauser, U., Lehnert, G., Lobentanzer, R., Wilske, B.: Interpretation Criteria for Standardized Western Blots for Three European Species of Borrelia burgdorferi Sensu Lato. J. Clin. Microbiol. June/1997: Wilske, B., Zöller, L., Brade, V., Eiffert, H., Göbel, U.B., Stanek, G., Pfister, H.W.: MiQ 12/2000 Qualitätsstandards in der mikrobiologisch-infektiologischen Diagnostik: Lyme-Borreliose. Urban & Fischer Verlag. München, Jena. (2000). 8

9

10 EUROIMMUN - Protilátky proti Borrelia afzelii Návod na použití WESTERNBLOT testu PROTOKOL PRO INKUBACE Před upotřebením: vložte proužek blotu do inkubačního kanálku obsahujícího 1,5 ml univerzálního pufru 15 min, třepat 1. Inkubace vzorku Odsajte všechnu kapalinu, do inkubačního žlábku napipetujte 1,5 ml vzorku séra (1:51) 30 min, třepat Promývání: 3 x 5 min 2. Inkubace s konjugátem: Odsajte všechnu kapalinu, do inkubačního žlábku napipetujte 1,5 ml enzymového konjugátu (1:10) 30 min, třepat Promývání: 3 x 5 min 2. Inkubace se substrátem: Odsajte všechnu kapalinu, do inkubačního žlábku napipetujte 1,5 ml roztoku substrátu 10 min, třepat Zastavení: Odsajte všechnu kapalinu, promyjte vodou Vizuální hodnocení 10