Analytické možnosti zjišťování reziduí POR a falšování přípravků

Analytické možnosti zjišťování reziduí PR a falšování přípravků Ing. ndřej Lacina, Ph.D. Aplikační specialista pro LC/MS

Přehled prezentace Instrumentace pro analýzu pesticidů Cílová analýza ecílová analýza/screening Využití MS/MS spekter All Ion MS/MS Analýza neznámých látek Analýza metabolitů/degradačních produktů ecílová diferenční analýza 2/18/2015 2

Instrumentace pro analýzu pesticidů Guidance document on analytical uality control and validation procedures for pe residues analysis in food and feed SAC/12571/2013 ec.europa.eu/food/plant/pesticides/guidance_documents/docs/ualcontrol_en.pdf 3

Instrumentace pro analýzu pesticidů Požadavky na identifikaci analytů: 4

Instrumentace pro analýzu pesticidů Trojitý kvadrupól: Selected Reaction Monitoring (SRM) Q1 Kolizní cela Q2 Výběr prekurzoru CID Výběr produktového iontu Chromatogram C H 3 H + CH 3 CH 2 + Cl Acetamiprid m/z = 223 Cl m/z = 112 5

Instrumentace pro analýzu pesticidů Trojitý kvadrupól: Selected Reaction Monitoring (SRM) Q1 Kolizní cela Q2 Výběr prekurzoru CID Výběr produktového iontu Chromatogram Intenzita Signál Šum S/ Tandemová MS (detekce produktových iontů) zlepšuje poměr signálu k šumu. Signál klesá, ale šum klesá rychleji. 1 2 3 4 Stupeň MS 6

Instrumentace pro analýzu pesticidů HRMS: Q-TF 1. Měření spekter bez fragmentace (MS) Q1 Kolizní cela HRMS Detekce všech iontů! Hmotnostní spektrum 7

Instrumentace pro analýzu pesticidů HRMS: Q-TF 1. Měření spekter bez fragmentace (MS) 2. Měření produktových spekter (MS/MS) Q1 Kolizní cela HRMS Produktové spektrum Hmotnostní spektrum 8

Instrumentace pro analýzu pesticidů HRMS: Q-TF 1. Měření spekter bez fragmentace (MS) 2. Měření produktových spekter (MS/MS) 3. All Ion MS (MS E...) produktové ionty bez výběru prekurzoru Q1 Kolizní cela HRMS Detekce všech prekurzorů i fragmentů Hmotnostní spektrum 9

Instrumentace pro analýzu pesticidů HRMS: Selektivita x10 4 8 6 4 +ESI EIC:1 (253.0309, 255.0280) Scan Frag=400.0V STD 0.10 ES 1 1 m/z 253.0309 +/- 0,25 x10 3 3 2 +ESI Scan:1 (rt: 2.729-2.803 min, 8 scans) Frag=400.0V STD 0.1 0,5 Da 253.0310 2 1 x10 4 4 3 2 1 +ESI EIC:1 (253.0309, 255.0280) Scan Frag=400.0V STD 0.10 ES 1 1 m/z 253.0309 +/- 0,025 0 x10 3 2 1 +ESI Scan:1 (rt: 2.729-2.824 min, 10 scans) Frag=400.0V STD 0. 0,05 Da 253.0309 0 x10 4 1.5 1 0.5 +ESI EIC:1 (253.0309, 255.0280) Scan Frag=400.0V STD 0.10 ES 1 1 m/z 253.0309 +/- 0,0025 0 x10 3 3 2 1 +ESI Scan:1 (rt: 2.729-2.813 min, 9 scans) Frag=400.0V STD 0.1 0,005 Da 253.0310 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 Counts vs. Acuisition Time (min) 0 252.8 252.9 253 253.1 253.2 253.3 Counts vs. Mass-to-Charge (m/z) 10

Instrumentace pro analýzu pesticidů HRMS: Výpočet sumárního zvorce Monoizotopická hmota Shoda přesné monoizotopické hmoty Poměry izotopů Vzdálenosti izotopů Shoda poměru izotopů Shoda vzdálenosti izotopů Celkové skóre

Instrumentace pro analýzu pesticidů Hmotnostní spektrometrie: Kvalitativní i kvantitativní informace během jedné analýzy Jendoznačná identifikace analytu nutné dodržet požadavky SAC/12571/2013. Možnost stanovení stovek látek během jedné analýzy. Vysoká selektivita Produktové spektrum obsahuje strukturní informaci o molekule. Výpočet sumárního vzorce z HRMS spekter. 12

Typy analýz reziduí pesticidů Cílová analýza: Struktura Retenční čas Molekulový iont (m/z) Fragmenty (m/z) Dostupný standard ecílová analýza/screening Struktura Retenční čas Molekulový iont (m/z) Fragmenty (m/z)? Dostupný standard Analýza neznámých látek Struktura Retenční čas Molekulový iont (m/z) Fragmenty (m/z) Dostupný standard Analytický úkol: Sledování legislativních limitů (MRL) Instrumentace: MS/MS (QQQ) HR MS/MS Analytický úkol: Běžně nesledované látky: epovolené, nepoužívané (staré), nově registrované Instrumentace: HR MS(/MS) Analytický úkol: Sledování nečistot ze syntézy (až 15% hm), degradačních produktů nebo metabolitů Instrumentace: HR MS/MS García-Reyes a spol., TrAC 26 (2008) 828 13

Cílová analýza reziduí pesticidů Trojitý kvadrupól: Selected Reaction Monitoring (SRM) Q1 Kolizní cela Q2 Výběr prekurzoru CID Výběr produktového iontu Vysoká selektivita a citlivost (S/) utný standard analytu Rychlé přepínání polarity (5 30 ms) Široký lineární rozsah (kvantifikace) Jednoduché vyhodnocení dat Komplikovaná tvorba metody (MS/MS přechody, retenční časy) mezené množství látek v metodě Detekce PUZE předem nastavených látek 15

Cílová analýza reziduí pesticidů Trojitý kvadrupól (LC): 300 pesticidů, tj. 600 MS/MS přechodů (10 μg/kg) 16

Cílová analýza reziduí pesticidů Trojitý kvadrupól: Selected Reaction Monitoring (SRM) Q1 Kolizní cela Q2 Výběr prekurzoru CID Výběr produktového iontu ejcitlivější mód měření Vysoká selektivita Rychlé přepínání polarity (5 30 ms) Jednoduché vyhodnocení dat utný standard analytu mezené množství látek v metodě Detekce PUZE předem nastavených látek 17

ecílová analýza/screening Dva přístupy k necílovému screeningu: Měření MS/MS spekter Akvizice dat v HRMS Vyhledání látek ze seznamu ve změřeném vzorku Cílové měření produktových spekter pro podezřelé nálezy (2. nástřik) Identifikace na základě porovnání s knihovnou produktových spekter. All Ion MS/MS Akvizice dat v All Ion (MS E ) módu (fragmenty i prekurzory jsou detekovány najednou) Vyhledání látek ze seznamu ve změřeném vzorku Identifikace na základě shody elučního profilu kvazi-molekulárního iontu a fragmentů. Seznam látek pro screening: Regulation (EC) o 1107/2009 19

ecílová analýza/screening Využití MS/MS spekter: 1. analýza HRMS HRMS záznam Seznam podezřelých nálezů Databáze pesticidů ( 1600 záznamů) 2. nástřik pro cílovou akvizici produktových spekter 20

ecílová analýza/screening Využití MS/MS spekter: 2. analýza HRMS/MS - identifikace Extrahovaný chromatogram MS spektrum Změřené MS/MS spektrum Diferenční spektrum MS/MS spektrum MS/MS spektrum z knihovny Databáze (MS) Knihovna MS/MS Shoda MS spektra a sumárního vzorce 21

ecílová analýza/screening Využití MS/MS spekter Co když MS/MS spektrum látky nemáme v knihovně? Software pro korelaci strukturního vzorce s MS/MS spektrem In-silico fragmentace a určení pravděpodobnosti vzniku jednotlivých fragmentů z dané molekuly. utný strukturní vzorec (*.mol, databáze, www.chemspider.com) Příklad: Jedná se o spektrum linuronu? Linuron

ecílová analýza/screening Využití MS/MS spekter Výpočet sumárního vzorce z MS spektra. Hodnocení jednotlivých fragmentů podle počet vazeb a typ vazeb nutných ke vzniku fragmentu ze strukturního vzorce. Může existovat nekolik izomerních kandidátů s vysokým skóre. Celkové skóre (80,46). Výpočet sumárních vzorců pro všechny fragmenty v MS/MS spektru. Pouze kombinace prvků obsažených v molekulovém iontu. ávrhy jedn.otlivých fragmentů 23

ecílová analýza/screening Využití MS/MS spekter Interpretace produktového spektra: 24

ecílová analýza/screening All Ion MS/MS Krok 1: Akvizice dat v All Ion MS režimu Bez fragmentace Fragmentace: 10V Fragmentace: 20V 25

ecílová analýza/screening All Ion MS/MS Krok 2: Identifikace látky Ve spektru bez fragmentace jsou vyhledány prekurzorové ionty. Spektrum bez fragmentace Jaké fragmenty vznikly z konkrétního prekurzoru? Spektrum s fragmentací 26

ecílová analýza/screening All Ion MS/MS Krok 2: Identifikace látky Ve spektru bez fragmentace jsou vyhledány prekurzorové ionty. Spektrum bez fragmentace Knihovna MS/MS spekter Jak identifikovat fragmenty? Spektrum s fragmentací 27

ecílová analýza/screening All Ion MS/MS Krok 2: Identifikace látky Ve spektru bez fragmentace jsou vyhledány prekurzorové ionty. Z dat s kolizní energií jsou vyextrahované přesné hmoty fragmentů je MS/MS knihovna. Koeluce prekurzorů a fragmentů znázorněna jako koeluční skóre: 28

d u a lifie d d n o t u a lifie d n o t u a ifiel d u a lifie d u a lifie d u a lifie d n o t u a lifie d n o t u a lifie d n o t u a ifiel d n o t u a lifie d n o t u a ifiel d u a lifie d u a lifie d u a lifie d u a lifie o t u a lifie d n o t u a lifie d n o t u a ifiel d u a lifie d n o t u a lifie d u a lifie d u a lifie d u a lifie d u a lifie d u a lifie d n o t d n o t u a lifie d n o t u a lifie d n o t d u a lifie o t d n o t u a lifie d n o t u a ifiel d n o t u a lifie d n o t u a lifie o t d n o t u a lifie n o t u a lifie d n o t u a lifie d n o t u a lifie d n o t u a ifiel d u a lifie d u a lifie d u a lifie d u a lifie o t u a lifie d n o t u a lifie d n o t u a lifie d n o t u a lifie d n o t u a lifie o t d n o t u a ifiel d n o t u a lifie d n o t u a lifie o t u a lifie d n o t u a lifie d n o t u a lifie d n o t u a ifiel d u a lifie d u a lifie d u a lifie o t u a lifie d n o t u a lifie d n o t u a lifie d n o t u a ifiel d n o t u a lifie d n o t u a lifie d n o t u a lifie d n o t u a ifiel d u a lifie d n o t u a lifie d n o t u a ifiel d n o t u a lifie d n o t u a lifie d d u a lifie d u a lifie o t u a lifie d n o t u a lifie d n o t d n o t u a lifie d n o t u a lifie o t u a lifie d n o t u a lifie d n o t u a lifie d n o t u a lifie d n o t u a ifiel d n o t u a lifie d n o t u a lifie d n o t u a lifie d n o t u a ifiel d n o t u a lifie d n o t u a ifiel d n o t u a lifie d u a lifie d u a lifie d n o t d n o t u a lifie d n o t u a ifiel d u a lifie o t u a lifie d u a lifie o t u a lifie d n o t u a lifie d n o t u a lifie d n o t u a lifie d n o t u a ifiel d n o t u a lifie d n o t u a lifie d n o t u a lifie d n o t u a ifiel d u a lifie d u a lifie d d d d d d ecílová analýza/screening All Ion MS/MS Validační studie All Ion MS/MS: ecílový screening 190 pesticidů ve třech matricích. Compound Acetamiprid Aldicarb Azoxystrobin Bifenazate (D 2341) Buprofezin Carbaryl Carbendazim (Azole) Chlorfenvinphos(I) Chloroxuron Chlorpyrifos Chlorpyrifos-methyl n Cyprodinil Difenconazole(I) Dimethoate Dimethomorph(E) Dimoxystrobin Dinotefuran Dioxacarb Ethoxyuin Fenamiphos Fenhexamid n Fluuinconazole(I) n Flutriafol Imazalil(II) (Enilconazole) Imidacloprid Metalaxyl Methidathion Myclobutanil n Penconazole(I) n Pendimethalin (Penoxalin) n Phosmet (Imidan) Pirimicarb Propamocarb Propiconazole(II) n Pyraclostrobin Pyridaben Quinalphos (Diethuinalphione) Spinosyn A Spiroxamine Sulfentrazone n Tebuconazole(II) (Terbuconazole) n Tebufenpyrad Thiabendazole Thiacloprid Thiamethoxam Triadimefon Triazophos Trifloxystrobin n Uniconazole-P(I) n Vamidothion Zoxamide Tomato Lemon Avocado Blank 0.005 0.01 0.05 Blank 0.005 0.01 0.05 Blank 0.005 0.01 0.05 Výsledky pro 50 nejčastěji nacházených pesticidů: Zelená = prekurzor + 1 fragment Žlutá = prekurzor Většina látek identifikována (prekurzor + fragment) i na hladině 5 μg/kg. 29

ecílová analýza/screening Měření MS/MS spekter Přesná identifikace na základě porovnání spekter z knihovny. Funkční bez znalosti retenčního času látky. Identifikace látek dosažena obvykle na nižších hladinách než v případě All Ion MS/MS. Alespoň přibližná identifikace i bez spektra analytu v knihovně (pracné). Komplikovaná reanalýza dat, mohou chybět MS/MS spektra. bvykle nutné alespoň dva nástřiky. All Ion MS/MS Jednoduché nastavení metody. Funkční bez znalosti retenčního času látky. Maximálně automatizované zpracování dat (extrakce iontů, koeluční skóre...). Reanalýza dat bez nutnosti nástřiku vzorku. Funguje i s jednoduchým HRMS (TF) epoužitelné bez znalosti přesných hmot produktových iontů (knihovna MS/MS spekter je nezbytná). 30

Analýza neznámých látek 1. Analýza metabolitů/degradačních produktů známé mateřské látky Produkty metabolismu nebo degradace lze vypočítat ze znalosti reakcí (oxidace, acetilace, methylace, hydrolýza, dehydratace, esterifikace...). Podobný izotopový profil jako mateřská látka. Stejné fragmenty nebo neutrální ztráty v MS/MS spektrech, jako ve spektru mateřské látky. 2. ecílová diferenční analýza alezení rozdílů mezi dvěma vzorky nebo dvema skupinami vzorků. Porovnání originálního a falšovaného PR, nebo odhalení neznámé kontaminace vzorku. 32

Analýza neznámých látek Analýza metabolitů: Ethametsulfuron-methyl ve vzorku půdy Relativně nový herbicid (2011), možné použití v několika státech EU (CZ, HU, IE, PL, R, SK), neregistrovaný v EU*. H 3 C H CH 3 H H S H 3 C *) http://ec.europa.eu/sanco_pesticides/public/index.cfm?event=activesubstance.detail&language=e&selectedid=2083 33

Analýza neznámých látek Analýza metabolitů: Ethametsulfuron-methyl ve vzorku půdy Vstupní informace: Vzorec mateřské látky Seznam možných chemických reakcí Data změřená v HRMS režimu H 3 C H CH 3 H H S Specializovaný software pro predikci metabolitů H 3 C Výsledek: Seznam potenciálních metabolitů (sumární vzorec, specifikovaná modifikace, retenční čas) Změření produktových spekter navržených metabolitů. 34

Analýza neznámých látek H CH 3 Analýza metabolitů: Ethametsulfuron-methyl ve vzorku půdy H 3 C H H S H 3 C eexistují MS/MS spektra v knihovně - ruční identifikace látek!? 35

Analýza neznámých látek H CH 3 Analýza metabolitů: Ethametsulfuron-methyl ve vzorku půdy H 3 C H H S Ethametsulfuron-methyl C 2 H 4 H 3 C 1 C H 3 H H H C + H 3 C H H H H S 1 1 2 2 H 3 C 2 H 2 CH 3 H C + H 2 CH 3 H H S H 36

Analýza neznámých látek Analýza metabolitů: Ethametsulfuron-methyl ve vzorku půdy statní identifikované degradační produkty: H 3 C H H S CH 3 CH3 37

Analýza neznámých látek ecílová diferenční analýza Postup: Porovnání referenčního (nekontaminovaného) a potenciálně kontaminovaného vzorku. Extrakce všech chromatografických píků z obou vzorků (skupin vzorků) peak picking. Porovnání vyextrahovaných látek z obou vzorků a nalezení rozdílů (t-test, AVA...). alezeny všechny rozdíly mezi vzorky: biologická variabilita odlišné podmínky při pěstování rozdíly vzniklé při přípravě vzorku... 38

Analýza neznámých látek ecílová diferenční analýza Modelový příklad: Extrakt pomeranče rozdělen na dvě poloviny. Jedna polovina kontaminovaná pesticidem cymoxanil (5 μg/kg). Každý vzorek analyzován třikrát. Reference Kontaminovaný vzorek Cymoxanil m/z 199.0826 Cymoxanil m/z 199.0826 39

Analýza neznámých látek ecílová diferenční analýza 1) HRMS data promítnuta ve třech rozměrech: čas hmota (m/z) intenzita. 2) dstraněny oblasti neobsahující signál. 3) Spojení souvisejících iontů (izotopy, různé adukty, nábojové stavy) do jednotlivých látek. Species RT m/z mass abund. M 8.157 308.0829 M+H 8.157 309.0902 308.0829 13529 M+H+1 8.163 310.0931 2876 M+H+2 8.163 311.0878 115 M+H4 8.163 326.1161 308.0826 6794 M+H4+1 8.163 327.1187 1461 M+a 8.157 331.0723 308.0831 3247 M+a+1 8.157 332.0749 714 2M+a 8.166 639.1550 308.0833 1134 2M+a+1 8.163 640.1581 251

Analýza neznámých látek ecílová diferenční analýza 1) HRMS data promítnuta ve třech rozměrech: čas hmota (m/z) intenzita. 2) dstraněny oblasti neobsahující signál. 3) Spojení souvisejících iontů (izotopy, různé adukty, nábojové stavy) do jednotlivých látek. 4) Extrakce jednotlivých látek. TIC alezené látky

Analýza neznámých látek ecílová diferenční analýza Všechny nalezené látky (3687 látek) 1200 Mass vs. Retention Time Mass (Da) 1000 800 600 400 700 Látky unikátní pro kontaminovaný vzorek (33 látek) 33 Features present only in Experiment 200 0 600 500 0 2 4 6 8 10 12 14 Retention Time (min) Mass (Da) 400 300 200 Přidali jsme pouze JEDE pesticid! 100 0 0 2 4 6 8 10 12 14 Retention Time (min) 42

Analýza neznámých látek ecílová diferenční analýza Problémy při automatické extrakci píků/látek: ekompletní separace látek Špatná chromatografie nepravidelné tvary píků. Málo bodů přes pík. Zvýšení falešně detekovaných píků (jedna látka identifikovaná jako dvě různé). esprávná integrace. Velké množství chybějících hodnot. edetekovaný, případně falešný marker. esprávná identifikace (M+a adukt může být někdy identifikován jako M+H atd.) 43

Analýza neznámých látek ecílová diferenční analýza Hrubá data dstraněný šum Spojování iontů se stejným RT Látky Porovnání látek ve skupinách Cílová extrakce látek Extrakce látek z HRMS dat. Porovnání všech látek přes několik vzorků, spojení látek se stejným RT a hmotou odstranění falešně pozitivních píků, kontrola identifikace jednotlivých iontů. Vytvoření seznamu látek a opětovná (cílová) extrakce ze všech dat odstranění falešně negativních (chybějících) píků.

Analýza neznámých látek ecílová diferenční analýza Všechny nalezené látky (2459) Mass (Da) 1200 1000 800 600 400 Mass vs. Retention Time 204 Látky unikátní pro kontaminovaný vzorek (1) 1 Features present only in Experiment 200 202 0 0 2 4 6 8 10 12 14 200 Retention Time (min) Mass (Da) 198 196 194 Cymoxanil m/z 199.0826 4.10 4.11 4.12 4.13 4.14 4.15 4.16 4.17 Retention Time (min) 45

Analýza neznámých látek ecílová diferenční analýza: Reálný příklad falšování PR Účinná látka Podezřelý přípravek riginální přípravek 46

Analýza neznámých látek ecílová diferenční analýza: Reálný příklad falšování PR Látky unikátní pro podezřelý vzorek Test statistické významnosti: p < 0.01 foldchange log2 = 4.0 (rozdíl intenzit látky mezi skupinami musí být minimálně 16x). Látky unikátní pro originální vzorek Statisticky významně odlišných bylo určeno 1951 látek z původních 2454. 1904 látek unikátních pro podezřelý vzorek! 47

Analýza neznámých látek ecílová diferenční analýza: Reálný příklad falšování PR Látky unikátní pro falšovaný vzorek 1200 1904 Features present only in Experiment 1000 800 Mass (Da) 600 400 200 0 0 2 4 6 8 10 12 Retention Time (min) Falšovaný vzorek obsahoval polymer na bázi ethylenglykolu 48

Závěr Hmotnostní spektrometrie je velmi účinný nástroj pro široké spektrum analytických úkolů, ALE pro dosažení výsledků je potřeba: Software: HRMS analyzátory generují obrovské množství dat kvalitní software, který umožní najít (rychle) v datech potřebné informace je naprosto nezbytný. Knihovny MS/MS spekter: Bez standardu je pro identifikaci analytů nutná knihovna MS/MS spekter. Analytik: musí zvolit vhodnou cestu k dosažení výsledků (MS/MS nebo All Ion, apod.), musí správně vyhodnotit a interpretovat data. 49

ndřej Lacina ondrej.lacina@hpst.cz