Mikrobiologické aspekty farmaceutické výroby Igor Hochel & Kateřina Demnerová
Dva pohledy na mikroorganismy člověkem využitelné mikroorganismy výroba organických kyselin (kys. citronová, glukonová, itakonová, giberelová, mléčná, lysin, kys. glutamová), enzymů (proteasy, amylasy, glukosaisomerasy, chymosin, glukosaoxidasa), léčiv (antibiotika, insulin, interferon, somatostatin), biomasy, paliv (ethanol, methan, vodík) rozpouštědel (aceton, butanol, glycerol) vitaminů (riboflavin, vitamin B 12 ) výroba potravin bioloužení kovů a minerálů (měď, uran) odstraňování ekologických havárií, biodegradace pululantů mikroorganismy škodící člověku parazitické (pathogenní) mikroorganismy) mikroorganismy atakující produkty vyráběné člověkem
Vliv mikroorganismů na farmaceutický průmysl mikrobiologická kvalita farmaceutických výrobků je ovlivněna prostředím, ve kterém jsou vyráběny minimální kontaminace produktů postupy odpovídající Správné výrobní praxi (Good Manufacturing Practice) důsledky mikrobiální kontaminace: degradace kvality výrobku finanční ztráty výrobce (soudní spory, poškozená důvěra spotřebitelů) zdravotní rizika způsobená přítomností pathogenních mikroorganismů nebo mikrobiálních toxinů výrobku finanční ztráty výrobce (soudní spory, poškozená důvěra spotřebitelů)
Zdroje kontaminace ve farmaceutické výrobě vzduch voda člověk vstupní suroviny a obaly výrobků vnitřní prostory budov, výrobní zařízení, čistící zařízení, atd.
Mikroflora vzduchu vzduch představuje poměrně nepřátelské prostředí pro řadu mikroorganismů nepřítomnost živin nedostatek vody sluneční záření působení vzdušného kyslíku šíření mikroorganismů v atmosféře: prachové částice, aerosol, kapénky
Mikroflora vzduchu mikroorganismy odolávající vysušení, tvořící spory, produkující pigmenty sporotvorné G + bakterie: Bacillus sp., Clostridium sp. G + bakterie netvořící spory: Staphylococcus sp., Streptococcus sp., Corynebacterium sp. kvasinky: Rhodotorula sp. plísně: Alternaria sp., Aspergillus sp., Cladosporium sp., Fusarium sp., Mucor sp., Penicillium sp. pasivní šíření vzduchem (turbulence) aktivní šíření vzduchem (balistospory, basidiospory)
Mikroflora vzduchu množství mikroorganismů ve vzduchu závisí na: velikosti a počtu prachových a aerosolových částic (čistota daného prostředí) vlhkosti vzduchu teplotě (suché léto vlhká zima) aktivitě v daném prostředí turbulence vzduchu technologické procesy - dispergace, míchání, dávkování kapalných a práškových substanci, atd. manipulace se škrobem a cukry (snadno využitelné živiny) balení výrobků (kartonové a papírové obaly) činnost výrobního zařízení pohyb personálu a zboží
Metody pro sledování kvality vzduchu sedimentační (spadová metoda) sedimentace mikroorganismů na agarová média jednoduchá, nenáročná metoda nepřesná metoda (závislá na velikosti sedimentujících částic a turbulenci vzduchu, nepoužitelná v klimatisovaných místnostech) aktivní nasávání vduchu impakční metody záchyt mikroorganismů na agarové půdy filtrační metody záchyt mikroorganismů na filtry impigement metody záchyt mikroorganismů do kapalných médií vyšší vypovídací hodnotu mají výsledky získané při odebírání vzduchu za delší časový úsek (nižší objemový průtok, několik odběrů na více misek)
Redukce počtu mikroorganismů ve vzduchu filtrace nejběžnější metoda filtry z různých materiálů jako je celulosa, skelná vata, skleněná vlákna, polytetrafluorethylen PTFE) boxy s laminárním prouděním (vertikální, horizontální) pravidelná inspekce (mechanické poškození, vlhkost), výměna filtrů UV záření (λ=240-280 mn) účinná metoda na krátké vzdálenosti od zdroje málo účnné proti bakteriálním spórám a pigmentovaným sporám plísní dezinfekce chemickými prostředky propylenglykol, kvarterní ammonné sloučeniny, formaldehyd omezené použití pro dráždivé účinky při rozprášení
Tlakový vzduch použití doprava surovin a ingrediencí aerace fermentačních procesů sprejové sušení, atd. redukce počtu mikroorganismů filtrace filtrace a tepelná sterilizace stanovení počtu mikroorganismů probublávání známého objemu vzduchu kapalným médiem membránová filtrace s následnou kultivací na agarovém médiu
Mikroflora vody vodní prostředí představuje svou plochou a objemem největší část biosféry a obsahuje řadu druhů mikroorganismů, které jsou adaptovány na toto určité prostředí voda je nejdůležitější komponentou ve výrobě léčiv; uplatňuje se jako roapouštědlo, účastní se řady procesů jako je chlazení, používá se při čištění výrobního zařízení i přilehlých prostor atd. mikrobiologické aspekty: kvalita nezpracované vody vliv postupů při získávání (a skladování) vody na její kvalitu kvalita distribučního sytému
Mikroflora vody mikroorganismy adaptované na růst při relativně nízkých koncentracích uhlíkatých a dusíkatých látek a při nízkých teplotách (oligotrofní psychrofily) teplota růstu 0-7 C (doba zdvojení 10 h) schopnost štěpit makromolekulární látky jako jsou proteiny, polysacharidy a lipidy Alcaligenes sp., Flavobacterium sp., Chromobacter sp., Pseudomonas sp., Serratia sp., Plesiomonas shigelloides, cyanobakterie půdní bakterie, bakterie rozkládající rostlinnou hmotu, bakterie související s činností člověka (průmyslové znečištění, zemědělská výroba, komunální odpadní vody): Bacillus subtillis, B. megaterium, Enterobacter aerogenes, E. cloacae, Proteus sp., Vibrio sp., Escherichia coli, Streptococcus faecalis, Clostridium sp., Micrococcus sp., Cytophaga sp. terestriální plísně: ascomycety, zygomycety, deuteromycety
Povrchová a studniční voda kvalitu vody ovlivňuje mikrobiální čistota zdroje vody (voda artézských studní povrchová voda) splachy půdy a mikroorganismů z okolní krajiny, mikroorganismy transportované do vodních toků deštěm, činnost člověka skladování vody sedimentace mikroorganismů zdroj kontaminace (10 5-10 6 cfu ml -1 v letních měsících)
Upravená voda destilovaná voda sterilní na výstupu z destilačního zařízení kontaminace jako důsledek selhání chladícího systému, nesterilních skladovacích zásobníků, nesterilního distribučního systému skleněné destilační přístroje post-destilační tepelná sterilace, skladování při teplotě 80 C demineralisovaná nebo deionisovaná voda výroba iontoměniče (potenciální zdroj kontaminace) deionisovaná voda připravená reversní osmosou sterilní bez bakteriálních toxinů a pyrogenů
Člověk jako zdroj mikrobiální kontaminace mikroflora kůže přenos dotykem drobné fragmenty, lupy mikroflora sliznic horních cest dýchacích kapénkový přenos (dýchání, kýchání, kašlaní, hovor) mikroflora zachycená na oděvu člověka
Mikroflora kůže kůže představuje první ochrannou barieru před bakteriemi a cizorodými částicemi a to jak mechanickou (keratin), tak chemickou: ph 4,2-5,5 antibakteriální složky (kyselina laurová, linolová, linolenová) lysozym (keratinocyty, stafylokoky) vysoká koncentrace NaCl relativní nedostatek vody adaptovaná mikroflora (2 000-80 000 aerobních bakterií na 1 cm 2 ) anaerobní bakterie povrchový biofilm, vlasové folikuly, mazové a potní žlázy živiny: složky potu, keratinisované buňky stratum corneum, výměšky mazových žláz, lipidové složky (triacylglyceroly,volné mastné kyseliny, vosky, steroly, atd.)
Mikroorganismy osidlující kůži člověka Rod Obvyklé druhy Aerobní, fakultativně anaerobní bakterie Gram-positivní koky Kokuria K. varians Micrococcus M. luteus Sarcina S. flava, S. lutea Staphylococcus S. aureus, S. capitis, S. cohnii, S. epidermis, S. hominis, S. saprophyticus Streptococcus S. viridans Gram-positivní tyčinky Brevibacterium B. epidermis Corynebacterium C. amycolatum, C. jeikeium, C. striatum, C. urealyticum Dermabacter D. hominis Gram-negativní tyčinky Acinetobacter A. calcoaceticus, A. lwofii Alcaligenes A. faecalis Escherichia E. coli
Mikroorganismy osidlující kůži člověka Rod Anaerobní bakterie Gram-positivní koky Peptococcus Peptostreptococcus Gram-positivní tyčinky Propionibacterium Kvasinky a plísně Aspergillus Candida Pityrosporum Torulopsis Obvyklé druhy P. niger P. anaerobious, P. assaccharolyticus, P. prevotii, P. productus P. acnes, P. avidum, P. granulosum, P. propionicum A. fumigatus C. albicans, C. krusei, C. tropicalis P. orbiculare, P. ovale T. glabrata Infikovaná povrchová zranění: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, enterokoky, koliformní bakterie, Proteus sp., Pseudomonas aeruginosa Kožní onemocnění: Staphylococcus aureus (folikulitida, furunkl, karbunkl, impetigo), Propionibacterium acnes (akné)
Mikroflora horních cest dýchacích nosni dutina Staphylococcus epidermidis, S. aureus (častý výskyt), S. albus (omezené množství), koryneformní bakterie tonsily mikroflora ústní dutiny: Streptococcus salivarus, Staphylococcus sp., Neisseria pharynges potenciální pathogeny Staphylococcus aureus, Haemophylus influenzae, Neisseria meningitis (infekce při oslabení hostitele), Streptococcus agalactiae, S. pneumoniae, S. pyogenes (patologický stav - streptokoková angina) příležitostný výskyt (nefysiologická funkce sliznic) Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa
Omezení rizika přenosu mikroorganismů člověkem pravidelné lékařské prohlídky personálu (bacilonosiči) školení personálu hygiena na pracovišti sterilizované pracovní oblečení (pláště, obuv, pokrývky hlavy, roušky a respirátory, rukavice)
Mikroflora farmaceutických surovin suroviny živočišného původu: želatina, sušený pankreas, sušená štítná žláza, karmín materiál živočišného původu může obsahovat živočišné pathogeny požadavek na nepřítomnost Escherichia coli a Salmonella sp. suroviny rostlinného původu: agar, klovatina, škrob, rostlinná guma (akácia) Erwinia sp., Pseudomonas sp., Lactobacillus sp., Bacillus sp., Streptococcus sp., Cladosporium sp., Alternaria sp., Fusarium sp. pathogenní mikroorganismy: Salmonella sp., Escherichia sp. některé technol. procesy (sušení) zvyšují koncentraci sporotvorných bakterií
Skladování surovin meziproduktů a finálních výrobků skladovací podmínky: aktivita vody osmofilní plísně minimální A w =0,70 kvasinky minimální A w =0,80 bakterie minimální A w =0,91 papírové obaly sorpce vody, atak mikroorganismů konstantní teplota sterilace produktu před použitím (tepelná sterilace, filtrace, ozařování, rekrystalisace z baktericidních rozpouštědel např. alkoholu, aplikace ethylenoxidu na práškové materiály) mikrobiologická kontrola surovin, meziproduktů a finálních výrobků
Balení farmaceutických výrobků funkce obalu: umožňuje transport a uchovávání produktu chrání obsah před nepříznivými vlivy (vlhkost, sluneční záření, znečištění prachem) a nežádoucími mikroorganismy mikroflora obalového materiálu závisí na jeho složení a způsobu skladování požadavky na obalový materiál: hladký odolný povrch bez trhlin a skulin (acetát celulosy, polyethylen, polypropylen, polyvinychlorid, kovová fólie, sklo)
Mikroflora obalů a obalových materiálů skleněné nádoby, lahvičky, ampulky sterilní z výr. procesu skladování v prašném prostředí Penicillium sp., Aspergillus sp., Bacillus sp. sterilace suchým teplem (170 C) papírové a kartonové obaly - Penicillium sp., Aspergillus sp., Cladosporium sp., Bacillus sp., Micrococcus sp. plastové obaly nízké počty mikroorganismů uzávěry a zátky nechráněné fólií nebo voskovou vrstvou zdroj plísní sterilace teplem, ozařováním, chemickými prostředky (formaldehyd nebo ethylenoxid) oční kapky, nitrožilní roztoky se sterilizují ve finálním obalu mikrobiologická kontrola (nepřítomnost živých mikroorganismů a jejich toxinů)
Budovy, haly, výrobní prostory stěny a stropy místností: Aspergillus flavus, A. niger, Cladosporium sp., Penicillium sp., Aureobasidium sp. (málo větrané místnosti) živiny: omítka a nátěry zdí omezení mikrobiální kontaminace hladké, nepropustné, omyvatelné mechanicky odolné omítky a nátěry, s přidavkem fungicidních/fungistatických látek (pentachlorfenol, salicilanilid, 8-hydroxychinolin), lamináty prostory s vysokou vlhkostí: glazované cihly a dlaždice elektrické rozvody, instalace, potrubí utěsněné spáry, žlaby, lišty
Budovy, haly, výrobní prostory podlahy snadno omyvatelné, s hladkým povrchem, neporézní a vodovzdorné materiál podlah - podle charakteru technologických procesů (kyselé, alkalické chemikálie, zvýšená vlhkost) otevřené odtokové kanály mělké, snadno přístupné a čistitelné nepřijatelné v prostorách, kde je nutné pracovat v aseptických podminkách dveře a okna všechny dveře a okna musí dokonale těsnit přetlak vzduchu v místnostech okna pouze pro osvětlení vnitřních prostor nikoli k ventilaci potrubí nesmí být vedeno nad výrobním zařízením (kondenzace vody na povrchu) zanedbávané nerezové potrubí a potrubí obalené isolací mikrobiální kontaminace technologické zařízení
Mikrobiologická kontrola stěry (vatové tampony) hodnocení mikrobiologického znečištění pracovních ploch, stěn, podlah, potrubí, ústí odpadů, ventilů, atd. otisková metoda na otisknuté ploše zůstávají residua média opětovné čištění a sterilace pouze rovné plochy nepřímé metody (měření ATP)
Důsledky mikrobiální kontaminace farmaceutických přípravků riziko infekce nízká pravděpodobnost Pseudomonas aeruginosa (nejnebezpečnější kontaminant nízké nároky na živiny), respirační infekce kojenců, septikémie, kožní infekce mikrobiální degradace preparátů změna organoleptických vlastností = zákal, zápach, změna barvy a chutě změna konsistence = rozpad emulse, slizovatění, změna viskozity degradace účinných látek = ztráta aktivity
Kontaminanty nalezené ve farmaceutických výrobcích Produkt Kontaminant vakcína Clostridium tetanii, Staphylococcus aureus oční kapky Pseudomonas aeruginosa mastek Clostridium tetanii pepermintová voda Pseudomonas aeruginosa intravenosní roztoky Pseudomonas, Erwinia, Eterobacter sp. roztok na kontaktní čočky Serratia a Enterobacter sp. fysiologický roztok Serratia marcescens desinfekční prostředky (chlorxylenol) Pseudomonas aeruginosa krém na ruce Klebsiella pneumoniae
Prevence mikrobiální degradace farmaceutických produktů používání mikrobiologicky nezávadných surovin způsob práce personálu, hygienické návyky, úroveň proškolení, lékařské prohlídky způsob skladování surovin, meziproduktů i finálních výrobků úroveň desinfekce výrobních prostor a výrobního zařízení soustavná mikrobiologická kontrola důsledná evidence technologických procesů a pohybu materiálu
Mikrobiologická nezávadnost farmaceutických produktů léčiva s povoleným obsahem nepathogenních mikrorganismů sterilní léčiva a přípravky
Léčiva podle požadavků na mikrobiologickou čistotu Kategorie Mikroorganismus 2 3A 3B 4A 4B aerob. bakterie 10 2 v 1g/1 ml 10 3 v 1g/1 ml 10 4 v 1g/1 ml 10 7 v 1g/1 ml 10 5 v 1g/1 ml houby 10 2 v 1g/1 ml 10 2 v 1g/1 ml 10 2 v 1g/1 ml 10 5 v 1g/1 ml 10 4 v 1g/1 ml enterobakterie 10 1 v 1g/1 ml NU 10 2 v 1g/1 ml NU 10 3 v 1g/1 ml P. aeruginosa žádné NU NU NU NU E. coli NU žádné žádné 10 2 v 1g/1 ml žádné S. aureus žádné NU žádné NU NU Salmonella sp. NU NU žádné NU žádné NU - neurčuje se Kat. 2 - přípravky k místnímu použitínebo použití v dýchacím ústrojí Kat. 3A - přípravky k perorálnímu a rektálnímu použití Kat. 3B - přípravky k perorálnímu podávání obsahuící suroviny přírodního, rostlinného nebo nerostného původu u nichž je přípustné mikrobiologické zbečištění Kat. 4A - přípravky z rostlin, k nimž se před použitím přidává vroucí voda Kat. 4B - přípravky z rostlin, k nimž se před použitím nepřidává vroucí voda
Sterilní léčiva, farmaceutické přípravky, jednorázové pomůcky, nástroje a implantáty infusní roztoky (NaCl, glukosa) 500 ml a více krev, krevní deriváty a krevní náhražky (dextran) úplná parenterální výživa (aminokyseliny, vitamíny, glukosa, tuky) nitrožilně podávané roztoky (1-50 ml) insulin vakcíny, hormony, antibiotika sterilní voda na omývání nebo zvlčování tkáně atd. dialysační roztoky oční kapky roztoky na kontaktní čočky chirurgické nitě, obvazové materiály, vata drobné nástroje a jednorázové pomůcky (jehly, stříkačky, rukavice, katetry, skalpely, chirurgické nůžky, kleště atd.) kardiostimulátory, umělé chlopně, kloubní náhrady, atd.
Sterilita ve farmaceutické výrobě lékopis ČSL4: sterilní přípravek je definován jako produkt, který absolutně neobsahuje životaschopné zárodky Evropský lékopis Ph.Eur.3: sterilní přípravek je definován jako produkt, který byl lege artis sterilizován, definovaným a validovaným způsobem