Základy hmotnostní spektrometrie
Hmotnostní spektrometrie Spektrometrické metody metody založen ené na interakci hmoty a záenz ení Hmotnostní spektrometrie je fyzikáln ln chemická metoda, která využívá elektrické a magnetické pole k separaci nabitých týchástic s cílem c urit jejich hmotnost (pomr r m/z)
Kvalitativní Organická hmotnostní spektrometrie k charakterizaci (identifikaci) organických slouenin na základz klad hmotnosti molekulárn rních iont, adukt a fragment ke studiu reakcí iont v plynné fázi Kvantitativní pro kvantifikaci organických slouenin ve vzorku na základz klad intenzity odezvy detektoru pro vybraný ion nebo skupinu iont
Základní pojmy Hmotnost (m) Da (Dalton), u poet atomových hmotnostních jednotek, íseln rovný molárn rní hmotnosti m/z úinná hmotnost Poet nábojn boj (z) z - poet elementárn rních nábojn boj (vtšinou 1) Ionty pozitivní a negativní NE kationty a anionty Hmotnostní spektrometrie NE spektroskopie
Hmotnostní spektrometr Iontový zdroj - pevod neutráln lních (i nabitých tých) ) látek l na ionty v plynné fázi Hmotnostní analyzátor separace iont podle pomru m/z Detektor detekce iont
Iontové zdroje Iontový zdroj - pevod neutráln lních (i nabitých tých) ) látek l na ionty v plynné fázi Neexistuje univerzáln lní ionizaní technika pro všechny molekuly, pro rznr zné typy slouenin jsou vhodné rzné ionizaní techniky Rozdlen lení ionizaních technik Tvrdé Mkké Ionty M + e - M + + 2 e - M + HA [M+H] + + A - M + B - [M-H] - + HB (Viz. následujn sledující pednáška M. Šandy)
Hmotnostní analyzátory Hmotnostní analyzátor separace iont v plynné fázi podle pomru m/z (využívá princip pohybu nabitých týchástic v elektrickém m nebo magnetickém m poli) Hmotnostní analyzátory Skenující - postupn propouští ionty rzných r hmotností (sektor, kvadrupól) Zadržuj ující ionty zachytí ionty, pak je analyzuje (iontová past, orbitrap, ICR) Prletový mías, který potebuj ebují ionty k pekonání dané vzdálenosti (TOF) Viz. pednp ednáška v 11:00 h
Detektory, vakuová technika Detektor - zaízen zení pevádjící menou veliinu inu na elektrický proud MS pevádí proud nabitých týchástic na elektrický proud ICR a ORBITRAP výjimka nepotebuj ebují detektor signálem je proud indukovaný ve stn analyzátoru Vakuováerpadla Pro vakuum? Ve vakuu nedochází ke srážkám m iont s neutráln lními ásticemi zvýší se stedn ední volná dráha letu Dvojstupov ová evakuace 1. pedvakuum (100 0,1 Pa), rotaní olejová pumpa 2. vysoké vakuum (0,1-10 10-6 Pa), difuzní pumpa, turbomolekulárn rní pumpa
Vakuová technika difuzní pumpa turbomolekulárn rní pumpa
Hmotnostní spektrum
Hmotnostní spektrum Hmotnostní spektrum grafické znázorn zornní závislosti intenzity iont na jejich pomru hmotnosti ku náboji n (m/z) Kontinuáln lní (profilové) záznam znam detektoru umož žuje odeíst šíku píku Centroidové (histogram) pevedeno na sloupcový graf pehlednjší poloha = tžt žišt píku, intenzita = výška nebo plocha píkup Spektra normalizována na rozsah osy y 0-100% spektrum profilové histogram
Izotopové klastry Izotopy - atomy chemického ho prvku, které mají stejný poet proton, ale rozdílný poet neutron,, tedy stejné atomovéíslo a rozdílnou atomovou hmotnost Pírodní smsi si izotop - zastoupení izotop jednotlivých prvk je konstantní Prvky X (monoizotopické): 19F, 23Na, 31P, 127I X+1: vodík (1H, 2H), uhlík (12C, 13C), dusík k (14N, 15N) X+2: chlor (35Cl, 37Cl), brom (79Br, 81Br) kyslík (16O, 18O)
Izotopové klastry Izotopové složen ení víceatomového iontu je dáno d kombinací izotopového složen ení atom,, které jej tvoí
Izotopové klastry alkoholdehydrogenáza C 1764 H 2859 N 469 O 516 S 26
Hmotnost iontu v MS Nominální hmotnost: z celoíselných hmotností prvk (p.. CO 2 : 12u + 2 x 16u = 44 u) Monoizotopická hmotnost: z pesných p hmotnostní prvk nejvíce zastoupených izotop (p.. CO 2 : 12.0000 + 2 x 15.9949 = 43.9898) Prmrn rná hmotnost: vážený prmr r hmotností jednotlivých izotop podle jejich zastoupení (p.. CO 2 : 12.01 + 2 x 16.00 = 44.01) P.: inzulín C 257 H 383 N 65 O 77 S 6
Vícenásobn nabité ionty [M M + 3H] 3+ [M M + 2H] 2+ [M M + H] H + [M + H] + [M + 2H] 2+ [M + 3H] 3+
Dimery, multimery [2M + H] + [M + H] + i trimery, tetramery, diference o m
Rozlišen ení Míra separace dvou pilehlých p pík Rozlišen ení 10% údolí nejmenší rozdíl l hmotností mezi stejn vysokými píky, p u nichž je výška údolí rovna definovanému zlomku výšky pík (nap. 10% údolí) pro sektorové pístroje (konstantní rozlišen ení pro celý hmotnostní rozsah) Rozlišen ení FWHM (full( width at half maximum) pomr r hmotnosti iontu a šíky jeho píku p v polovin výšky pro kvadrupóly ly,, iontové pasti, prletov letové analyzátory (konstantní šíka píkup ku) 10% údolí FWHM R = m/ m
Pesnost uren ení hmotnosti vyjáden ení schopnosti hmotnostního ho analyzátoru urit správnou hodnotu m/z Nomináln lní hmotnost zm ena na pístroji p s jednotkovým (nízkým) rozlišen ením nap.. odliší šíme od sebe ionty m/z 500 od 501 Pesná hmotnost zm ena na pístroji p s vysokým rozlišen ením, pesnost se vyjaduje v ppm ( pesná hmotnost < 5 ppm) nap.. rozliší šíme m/z m 500 od 500.001 lepší pesnost uren ení elementárn rního složen ení Kalibrace seízen zení iontové optiky tak, aby nam ené spektrum smsi si látek l se známými pomry m/zm odpovídalo dalo jejich teoretickým hodnotám Kalibraní smsi: si: polyethylenglykoly, klastry NaI, CsI, smsi si peptid, UltramarkTM (fluor luorované fosfazeny), komerní smsi si
Praktické dsledky Nízké rozlišen ení vysoké rozlišen ení
MS/MS, MS n Tandemová hmotnostní spektrometrie 1. separace iontu 2. fragmentace vybraného iontu 3. detekce fragment CID - procesy v kolizní cele urychlení iont elektrickým polem srážky iont s neutráln lními molekulami (N 2, Ar, He) v kolizní cele zvyšov ování energie ion rozpad iont urov ování struktury, specifická detekce
MS jako detektor v separaních On-line spojení s metodách plynovou chromatografií (GC/MS) kapalinovou chromatografií (HPLC/MS) kapilárn rní zónovou elektroforézou (CZE/MS) Výhody vysoká citlivost vysoká selektivita univerzálnost kvantitativní i kvalitativní analýza Nevýhody vyšší cena pístrojep vyšší odborné nároky na operátora
GC/MS První chromatografická metoda spojená s MS malý prtok nosného plynu kompatibilní s MS Instrumentace Analyty: iontové zdroje: EI, CI analyzátory: Q, IT mén polárn rní,, termáln ln stabilní,, s nízkou n molekulovou hmotností Široce využívan vaná technika analýza složitých smsí (nap. environmentáln lní a forenzní analýzy) možnost prohledávat databáze MS spekter rychlá identifikace látek
GC/MS záznamz znam
Spojení HPLC pozdji HPLC/MS odpaen ení velký objem plynu = technický problém ešení API zdroje (APCI, APPI, ESI) Instrumentace iontové zdroje: APCI, APPI, ESI analyzátory: Q, IT, orbitrap,, TOF Analyty: od malých molekul po biopolymery od málo m polárn rních po iontové omezen kompatibilní MF s pufry a iont-párovými inidly analýza potravin, léiv, l proteomika,, atd. Rychle se rozšiuj ující oblast MS
Zatím m málo m rozší šíená Výhody CZE/MS velmi vysoká separaní úinnost analýza iont nízká spoteba vzorku Technické problémy ovlivov ování separaního naptí a naptí zdroje malá kompatibilita separaních pufr s MS Analyty analýza peptid,, identifikace protein
Historie MS v R R (SSR)( Konstrukce prvního hmotnostního ho spektrometru (1953) V. ermák, V. Hanuš,.. Jech, J. Cabicar Ústav fyzikáln lní chemie a elektrochemie SAV První komerní MS instrumenty MCH-1303 (poátek 60.let) Ústav fyzikáln lní chemie SAV Ústav organické chemie a biochemie
Dkuji za pozornost