VYUÎITÍ BIOâIPOV CH TECHNOLOGIÍ V ONKOLOGII MICROARRAY TECHNOLOGY APPLICATION IN ONCOLOGY

VYUÎITÍ BIOâIPOV CH TECHNOLOGIÍ V ONKOLOGII MICROARRAY TECHNOLOGY APPLICATION IN ONCOLOGY MERKEROVÁ M., KRÁâMAROVÁ A., BRUCHOVÁ H., BRDIâKA R. ODDùLENÍ MOLEKULÁRNÍ GENETIKY, ÚSTAV HEMATOLOGIE A KREVNÍ TRANSFUZE, PRAHA Souhrn Prudk rozvoj ãipov ch technologií v posledních letech umoïnil sériové anal zy exprese nûkolika tisíc genû zároveà v jediném experimentu a tím urychlil na e porozumûní komplexnosti bunûãn ch procesû. Pomocí mikroãipového v zkumu lidského transkriptomu byly odhaleny nové, dfiíve nerozeznatelné subtypy tumorû, nové diagnostické a prognostické markery nebo potenciální cílové molekuly pro terapii. Aplikace high-throughput technologií v klinické onkologii slibuje do budoucna posun ke kaïdodenním rutinním ãipov m anal zám nádorû a na jejich základû individualizaci léãebného programu. Pfied zavedením mikroãipû do klinické praxe jev ak je tû potfieba vyfie- it nûkolik sporn ch otázek t kajících se anal zy dat, reprodukovatelnosti a validace v sledkû, mezilaboratorního srovnávání a v neposlední fiadû také problém stále pomûrnû vysok ch pofiizovacích i provozních nákladû. Klíãová slova: mikroãipy, expresní anal zy, cdna, molekulární diagnostika Summary During recent few years, rapid progress in microarray technology has facilitated gene expression analyses of thousands of genes performed simultaneously in one experiment. It has revolutionized our understanding of the cellular processes complexity. Previously subtypes of tumors, new diagnostic and prognostic markers, or potential targets for therapy has been identified by microarray-based research of human transcriptom. In clinical oncology, high-throughput technologies implementation promises their routine application in tumor analyses and individualization of treatment. However, several issues relating to data analysis, reproducibility, cross-comparability, validation, and high purchase and operating costs need to be resolved before the technology can be adopted broadly in the clinical practices. Key words: microarray, gene expression analysis, cdna, molecular diagnostic Onkologická onemocnûní vznikají v dûsledku akumulace genetick ch, ale také fiady epigenetick ch zmûn. Druhou velmi podstatnou roli v progresi rakoviny hraje interakce nádorov ch bunûk s okolními stromálními, imunitními a zánûtliv mi buàkami. Právû tato komplexnost vzniku nádoru, genetická heterogenita maligních bunûk, ale také variabilita mezi pacienty vedou k identifikaci mnoha nádorov ch subtypû (dosud bylo rozli eno více jak 200 rûzn ch typû nádorû) (1). Diagnostické a prognostické klasifikace nádorov ch onemocnûní se v souãasné dobû opírají zejména o klinické a histopatologické nálezy, celou ífii klinické heterogenity neodráïejí v ak zcela dostateãnû. Nedávné pokroky ve v zkumu lidského genomu (2,3) a tzv. high-throughput technologie jiï umoïàují prostudovat molekulární komplexnost maligních tumorû a díky tomu zvolit co nejvhodnûj í léãebnou strategii pro kaïdého pacienta. Pro ucelenou charakterizaci nádorû na molekulární úrovni se otevírají moïnosti v podobû anal z nukleov ch kyselin (RNA, DNA), proteinû a metabolitû. Velmi cenná data jsou získávána díky ãipov m technologiím, mezi kter mi získaly ústfiední postavení expresní mikroãipy. Ty dovolují souãasnû monitorovat aktivitu nûkolika tisíc genû vdané tkáni/bunûãném typu (tzv. gene expression profilling, napfi. firmy Agilent, Affymetrix). Bioãipové tehnologie jsou v souãasné dobû v onkologii nejvíce vyuïívány pro tyto úãely: 1. nalezení molekulární podstaty onemocnûní 2. identifikace nov ch diagnostick ch markerû nádorového procesu 3. klasifikace/definice jednotliv ch nov ch subtypû daného onemocnûní na molekulární úrovni, tzv. molekulární diagnostika 4. identifikace odpovûdi pacienta na terapii 5. zlep ení terapeutick ch postupû, zavedení léãby zacílené na pfiíãinu onemocnûní Princip ãipové technologie DNA ãipové technologie jsou zaloïeny na hybridizaci nukleov ch kyselin, tj. interakci mezi DNA sondami imobilizovan mi na pevn povrch ãipu, které reprezentují zkouman gen, a mezi znaãen mi, voln mi molekulami nukleov ch kyselin odvozen mi z analyzovaného vzorku (Obr. 1). Pro expresní mikroãipy jsou v chozím materiálem molekuly RNA (celkové ãi mrna) izolované ze vzorku, které jsou pfiepsány na cdna pomocí reverzní transkripce azároveà fluorescenãnû ãi radioaktivnû znaãeny. Takto pfiipravená cdna je hybridizována na komplementární sondy imobilizované na povrchu ãipu. Signál generovan na kaïdé sondû pak odráïí hladinu exprese mrna daného genu v analyzovaném vzorku. Po detekci, kvantifikaci a normalizaci intenzit signálû pomocí specializovaného softwaru je vytvofien tzv. gene expression profile analyzovaného vzorku, kter pak lze srovnávat s expresními profily dal ích vzorkû. Existuje nûkolik verzí uspofiádání, v závislosti na typu povrchu ãipu (nylonové membrány, plastikové, nebo sklenûné ãipy) nebo na typu znaãení vzorku (radioaktivnû, chemiluminiscenãnû, fluorescenãnû). Oblíben m pfiístupem je semikvantitativní anal za genové exprese pomocí tzv. duálního znaãení, pfii kterém jsou na jeden ãip hybridizovány dva odli nû znaãené vzorky, napfiíklad vzorek z nádorové tkánû a vzorek z kontrolní, zdravé tkánû. Fluorescenãnû znaãené cdna (nejãastûji se vyuïívá Cy3 acy5 ãi Alexa barev) obou srovnávan ch vzorkû jsou ve stejné koncentraci smíchány a hybridizovány na jeden mikroãip. Barva spotu vzniklá interferencí signálû obou znaãek potom vypovídá o kvantitativním rozdílu v expresi daného genu mezi obûma vzorky. Technologie v roby mikroãipû Pro v robu ãipû jsou nejãastûji pouïívány nylonové membrány, plastikové nebo sklenûné materiály. Plastikové a nylono- KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 333

vé ãipy pfiedstavují tzv. makroãipy, neboè mají vût í rozmûry a men í hustotu nanesen ch spotû (napfiíklad nylonov ãip Atlas Human cdna Expression Array of firmy Clontech sleduje expresi 588 genû na membránû o rozmûru 8 x 12 cm). NejbûÏnûj ím povrchem je pravdûpodobnû mikroskopické sklíãko o velikosti 7,5 x 2,5 cm s povrchem upraven m pomocí hydrofobních polymerû (poly-l-lysin, modifikovan silan - aminosilan, epoxysilan apod.) poskytujících reakãní skupiny jako jsou -NH 2, -OH, =O pro navázání oligonukleotidû. Naná ení sond na povrch ãipu lze provádût nûkolika zpûsoby. První moïností je mechanické spotování jiï presyntetizovan ch sond a to buì cdna klonû ãi jejich PCR produktû, anebo chemicky pfiipraven ch oligonukleotidû - v hody a nev hody obou typû sond jsou shrnuty v Tabulce 1. Jednotlivé sondy jsou naná eny na ãip tenk mi ostr mi jehlami (ink-jet printing) v objemu cca 1nl a nati tûné spoty pak mají 100-150μm v prûmûru. Dal í moïností v roby mikroãipû je syntéza sondy ve formû oligonukleotidû in situ na povrchu ãipu (fotolitografie). Obrázek 1: Princip technologie expresních mikroãipû. Na obrázku je ãip Atlas Human cdna Expression Array od firmy Clontech s celkovou RNA z linie K562, z experimentû provádûn ch v na í laboratofii. Metodou fotolitografie, kterou vyvinula firma Affymetrix, jsou oligonukleotidové sondy syntetizovány pfiímo na povrchu sklenûného ãipu. Fotolitografická maska fiídí spolu se svûteln m paprskem syntézu tak, Ïe vazebná místa oligonukleotidû jsou svûtlem aktivována a reagují s nov m nukleotidem. Opakováním cyklû spolu se stfiídáním masek dochází k prodluïování fietûzcû sond vïdy o jeden nukleotid aï do celkové uniformní délky 25 nukleotidû. Tento zpûsob konstrukce zvy uje vyuïitelnost plochy ãipu o 1-2 fiády. KaÏd gen na ãipu od firmy Affymetrix je reprezentován jedenácti 25-merními sondami z rûzn ch oblastí téhoï genu, ãímï je zaji tûno nûkolikanásobné mûfiení exprese daného genu v rámci jednoho mikroãipu bûhem jedné anal zy. KaÏdá z jedenácti sond je navíc doplnûna o sondu s jednou chybnû párující bází umístûnou uprostfied sondy (tzv. mismatch), coï umoïàuje uïivateli ovûfiit specifiãnost hybridizace. Plo ka mikroãipu (1,25 cm) je rozdûlena do ãtvercû o velikosti 11x11 μm, z nichï na kaïdém jsou vázány kopie pouze pro jedin typ sondy. Nejnovûj í mikroãip firmy Affymetrix, kter umoïàuje detekovat hladiny aï 47 000 rûzn ch RNA, nese tûchto jedineãn ch ãtvercû celkem 1,3 miliony (4). Pfiíprava vzorku pro expresní anal zy Solidní nádory pfiedstavují z histologického hlediska heterogenní smûs rûzn ch bunûãn ch typû: maligní buàky v rûzném stupni diferenciace, krevní buàky, buàky zánûtlivé odpovûdi atd. Díky variabilitû v bunûãném sloïení nádorové tkánû je nutné vûnovat zvlá tní pozornost v bûru vzorku. Obvykle je maximální snaha soustfiedûna na získání pouze maligních bunûk. K tomuto úãelu jsou pouïívány rûzné mikrodisekãní techniky (napfi. Laser Capture Microdissection - LCM). Aãkoli je dnes moïné získat expresní profil pouze pro maligní sloïku nádorové tkánû, nelze opomenout vliv dal ích bunûãn ch komponent nádoru (endoteliální, buàky imunitního systému) na jeho progresi. V chozím materiálem pro anal zu expresních profilû je obvykle vysoce kvalitní celková RNA, v mnoïství 10-40μg, coï pfiibliïnû odpovídá 100mm 3 tkánû (5). Dal í moïnost pak pfiedstavuje pfiímá izolace mrna. Pokud není vzorek nádorové tkánû ihned zpracován a o etfien inhibitory RNáz, je nutné tkáà bezprostfiednû po resekci (maximálnû do 30 minut) zamrazit vtekutém dusíku a skladovat alespoà pfii -80 C, ãímï je zamezeno degradaci RNA. DÛraz je dále kladen zejména na ãistotu RNA (tj. RNA bez pfiímûsi DNA) a její integritu, kterou je moïné jednodu e ovûfiit pomocí elektroforézy v agarózovém gelu. Na rozdíl od ãerstv ch ãi zamrazen ch tkáàov ch vzorkû, které je nutné co nejdfiíve zpracovat, mohou b t parafinové tká- Àové bloãky fixované pomocí formaldehydu (tzv. FFPE vzorky) dlouhodobû skladovány. V hodou takto uchovávan ch preparátû je jejich dobrá klinická dokumentace: prûbûh onemocnûní, odpovûì pacienta na léãbu a její v sledek. Nicménû z FFPE vzorkû bylo je tû nedávno velmi problematické získat dostateãné mnoïství kvalitní, nedegradované RNA. Nyní jsou v ak na trhu k dispozici speciálnû pfiipravené kity pro izolaci RNA z tûchto tkáàov ch preparátû (Arcturus, kit Paradise Reagent System; QIAGEN, Launches RNasy FFPE kit) a také speciálnû upravené mikroãipy se sondami, které jsou odvozené od 3 koncû mrna (Affymetrix, mikroãip Gene- Chip Human X3P Array). Pokud jsou v chozím materiálem málobunûãné vzorky (napfiíklad po separaci bunûk na jednotlivé subtypy, po tkáàové biopsii ãi LCM), je moïné získanou mrna amplifikovat. Dostupné amplifikaãní kity jsou zpravidla limitovány 10ng mnoïstvím celkové RNA, nicménû i 1ng v chozího materiálu mûïe b t postaãující (napfi. NuGEN Technologies, Ribo-SPIA technology). Základní schéma amplifikace mrna má 3 kroky: podle mrna je nejprve syntetizován pomocí reverzní transkriptázy komplementární fietûzec cdna, následnû je vlákno mrna odbouráno a nahrazeno 2. fietûzcem cdna, ãímï vzniká dvoufietûzcová cdna, která je amplifikována. Poslední fází je pfiíprava znaãeného fietûzce antisense crna, kter je syntetizován podle kódujícího (+) cdna a má tudíï sekvenci komplementární k pûvodní bunûãné mrna (Obr. 2). Variabilita a její zdroje Pfii porovnávání v sledkû experimentû vycházejících z bioãipov ch anal z je nutno mít na vûdomí nejen pfiirozenou variabilitu, která vychází z charakteru bunûãného materiálu nebo odli ného bunûãného sloïení nádorové tkánû, ale také variabilitu technologického procesu. Zdroje této procesní variability mají pûvod napfiíklad v povaze a zpracování biologického materiálu (zpûsob pfiípravy vzorku, extrakce RNA). 334 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006

Pokud je po izolaci RNA kvûli malému mnoïství v chozího materiálu zafiazen navíc amplifikaãní krok, mûïe pfiedstavovat dal í pfiíãinu nárûstu variability v dûsledku rûzné senzitivity a aktivity enzymû pouïívan ch v amplifikaãních kitech nebo rozdílné efektivity znaãení. Dále mûïe variabilita získan ch dat vycházet z nespecifické cross-hybridizace ãi z odli - ností mezi jednotliv mi bioãipy (hybridizace, zpûsob znaãení testovaného vzorku, v bûr a délka sond pro konkrétní gen pfii konstrukci bioãipu). Obrázek 2: Obecn princip dvoustupàové amplifikace mrna Deregulované geny, identifikované pomocí ãipov ch technologií, které by mohly b t vyuïity jako diagnostické ãi prognostické markery a nebo jako potenciální cíle pro dal í v zkum, musí b t nezávisle validovány jinou standardní metodou jako je napfi. kvantitativní RT-PCR ãi northern blot. Anal za dat Hledání odli nû exprimovan ch genû mezi testovan mi soubory vzorkû b vá jedním z hlavních cílû bioãipov ch anal z. Pokud chceme porovnávat intenzity signálû mezi dvûma analyzovan mi vzorky, je nutno zahrnout do anal zy normalizaci dat, protoïe jednotlivé vzorky se mohou navzájem li it napfi. v koncentraci mrna, relativní vazebné afinitû ãi koncentraci vázané znaãky. Mezi nejãastûji pouïívané pfiístupy patfií celková normalizace intenzit, linearní regrese nebo log centering, pfiiãemï normalizace mûïe b t pouïita globálnû, tedy na celkov soubor získan ch dat, anebo lokálnû, ãili na vybranou sadu dat (6). Zpravidla vycházíme z nulové hypotézy, která fiíká, Ïe pro sledovan gen je mezi porovnávan mi vzorky pozorována shodná expresní hladina. Alternativní hypotéza naopak tvrdí, Ïe testované vzorky nemají v pfiíslu ném genu stejnou úroveà exprese. Pro stanovení pravdûpodobnosti obou hypotéz je potfieba pouïít napfi. parametrick t-test, nebo neparametrick Mann-Whitney test (6). ProtoÏe DNA ãipy poskytují aï nûkolik tisíc v sledn ch hodnot z jediného experimentu, jsou anal za, interpretace a uloïení takto velkého mnoïství dat nároãn m problémem. PfiestoÏe mûïeme pomocí mikroãipû nalézt geny, které vykazují v razn rozdíl v expresi a které lze dále vyuïít pro následné specifické anal zy, spoãívá nejvût í v znam bioãipov ch high-throughput anal z v odhalování komplexnosti genetick ch zmûn. Tato komplexnost je urãována pomocí matematick ch soustav podobnû exprimovan ch genû v celém mnoïství dat. Existují dva základní pfiístupy k anal ze mikroãipov ch dat. Prvním je takzvaná unsupervised analysis vyuïívající informace poskytované v emi geny, které jsou v dané tkáni exprimované. Do spoleãné kategorie tak lze seskupovat napfiíklad vzorky, které vykazují v raznou podobnost ve sv ch expresních profilech, nebo je moïné vyhledávat geny ve vzorku, které sevyznaãují shodnou expresní hladinou (zv enou/sníïenou transkripãní aktivitou v porovnání se zdravou kontrolou). Druh pfiístup zvan supervised learning sleduje pouze pfiedem vybranou skupinu genû - charakteristické markery definované pro jednotlivé diagnózy, a tím zafiazuje neznám vzorek do dfiíve definované podskupiny onemocnûní (7). Obû tyto metody mohou b t aplikovány na stejn soubor dat za rûzn m úãelem. První typ je ménû ovlivniteln a je vhodnûj í pro odhalování dosud neznám ch, morfologicky podobn ch subtypû tumorû pouze na základû podobností v expresních profilech. Supervised metoda je naopak vhodnûj í k diagnostice tumorû, které patfií do jiï definovan ch klinicky v znamn ch podskupin. Existuje nûkolik matematick ch nástrojû pro testování a znázoràování vztahû mezi expresními profily, mimo jiné tzv. klastrování a multidimensional scaling. Klastrovací metoda poskytuje dendrogramy podobné evoluãním stromûm, ve kter ch koncové vûtve zobrazují podobné vzorky/geny. V sledkem druhé z metod jsou tfiídimensionální tzv. scatter plots, ve kter ch se podobné vzorky (znázornûné body) seskupují v prostoru. Jedním z nejpopulárnûj ích klastrovacích nástrojû je hierarchical clustering (8), jiné metody vyuïívají K-means clustering a self-organizing maps. Aplikace expresních ãipû v klinické onkologii Nabídka specificky zamûfien ch expresních mikroãipû je v souãasné dobû velmi pestrá. Vedle celogenomov ch mikroãipû (Affymetrix, Agilent) jsou k dispozici bioãipy, které umoï- Àují detekovat expresní hladiny pouze vybran ch skupin genû, jejichï proteinové produkty vykazují jistou podobnost z hlediska funkce, bunûãné lokalizace, interakcí, apod. Napfiíklad firmy Clontech ãi SupperArray nabízí bioãipy se sondami pro sledování aktivity genû, u nichï se pfiedpokládá, Ïe participují na maligní transformaci buàky. Hlavními funkãními kategoriemi (klastry) jsou geny úãastnící se regulace bunûãného cyklu, apoptózy, diferenciace, bunûãné signalizaci dále pak geny, jejichï produkty se uplatàují jako transkripãní faktory, adhezivní molekuly ãi povrchové receptory. V souvislosti s hledáním molekulární podstaty vzniku a rozvoje nádorov ch onemocnûní se nabízí moïnost konstruovat mikroãipy, které by dovolily monitorovat expresi genû zapojen ch do konkrétní signální dráhy. Expresní bioãipy jsou v klinické onkologii vyuïívány pro diagnostiku, zji tûní rizika progrese onemocnûní nebo pro stanovení pfiedpokládané odpovûdi na léãbu. Diagnostika Zájem o vyuïití expresních bioãipû k onkologické diagnostice byl vyvolán prací kolektivu Khan et al. (9), podle které expresní profily rakovinn ch bunûãn ch linií odpovídaly jejich orgánu pûvodu. Mezi prvními klinick mi studiemi vyuïívajícími mikroãipy k diagnostice byly práce zab vající se akutními leukemiemi, u nichï je pfiístup k ãisté populaci nádorov ch bunûk relativnû jednoduch. Golub et al. (10) se zab val otázkou, zda je moïné vyuïít expresní ãipy pro diagnostické rozli ení akutní myeloidní leukemie (AML) od akutní lymfoidní leukemie (ALL). Pomocí unsupervised learning, pouze na základû genové exprese, dokázal správnû zafiadit 36 z 38 vzorkû kostní dfienû pacientû saml nebo ALL, pfiiãemï pouze 2 zûstaly nejasné. Tím dokázal, Ïe akutní leukemie lze klasifikovat pomocí microarrays bez jak chkoliv pfiedchozích klinick ch znalostí. Dále zaznamenal rozdílnost expresních profilû T-ALL a B-ALL, na základû které je moïné tyto dva subtypy akutní lymfatické leukemie odli it. S vyuïitím genov ch expresních profilû byly identifikovány a charakterizovány nové subtypy tumorû. Alizadeh et al. (11) identifikoval dva typy difuzního velkobunûãného B lymfomu odvozené z rûzn ch stádií zrání B-lymfocytÛ. Armstrong et al. (12) potvrdil, Ïe ALL s chromozomální translokací KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 335

t(4;11)(q21;q23), jejíï souãástí je gen MLL (mixed-lineage leukemia), mají charakteristick expresní profil odli n od ALL i AML, kter odpovídá ran m hematopoetick m progenitorov m buàkám. Klastrovací algoritmy tak mohou odli it ALL s MLL translokací od bûïné akutní leukemie, coï naznaãuje, Ïe MLL pfiedstavuje odli né onemocnûní. Z Armstrongovy ãipové anal zy vyplynulo, Ïe nejvíce odli ná je exprese genu FLT3 a na jejím základû lze oddûlit MLL od ostatních typû leukemií. Aberace FLT3 byla zaznamenána jiï dfiíve v nûkter ch pfiípadech AML a mohla by b t leukemogenní (13,14,15). FLT3, tyrosin kinázov receptor, by tedy mohl pfiedstavovat atraktivní cílovou molekulu pro v voj nov ch specifick ch léãiv. Dal ím pfiíkladem je publikace Sorlie et al. (16), která definuje na podkladû mikroãipov ch expresních anal z 5 podtfiíd karcinomu prsu, vãetnû nového myeloepitheliálního a dále luminálního epitheliálního typu. Bittner et al. (17) identifikoval dvû podtfiídy koïního maligního melanomu vykazující odli - nou agresivitu. Prognostické studie Mikroãipy byly vyuïity mimo jiné pro predikci prûbûhu rakoviny prsu (18,19), lymfomû (11,20), rakoviny plic (21) nebo adenokarcinomu ledvin (22,23). V pfiípadû predikce pfieïití u pacientek s rakovinou prsu se ukázalo, Ïe vyuïití mikroãipové technologie pfiedãí stávající metody zaloïené na klinick ch a histologick ch kritériích (19). U renálního karcinomu byl pomocí expresních ãipû a validace jejich v sledkû kvantitativním RT-PCR identifikován set biomarkerû pro predikci jeho agresivity. Na základû 34 genû, které nejv raznûji vykazovaly rozdíly v expresi, bylo pomocí hierarchického klastrování správnû zafiazeno 88% (23 z 26) vzorkû do skupiny agresivních a metastazujících karcinomû, 100% do skupiny neagresivních nádorû a 100% do skupiny non-neoplastick ch vzorkû. Autofii navíc poukázali na fakt, Ïe na základû exprese jednoho z kandidátních markerû (survivinu) lze predikovat pfieïití pacientû s renálním karcinomem (23). Expresní ãipy mohou b t také vyuïity pro diagnostikování metastáz a identifikaci tkánû, ze které pûvodnû pocházejí. I kdyï jsou tumory ãasto histologicky identické, urãení jejich povahy apûvodu je dûleïité pro správnou volbu léãebného postupu. Potfieba nalezení lep ích molekulárních markerû, které by odhalily primární zdroj metastázy, vedla k vyuïití mikroãipû pfii klasifikaci nádorû podle jejich pûvodu (24-27). Napfiíklad Su et al. (26) pouïil supervised learning metodu kidentifikování skupin genû, jejíï hladina exprese je charakteristická pro rûzné druhy nádorû. Tyto soubory zahrnovaly geny, jejichï exprese je typická pro danou zdravou tkáà, stejnû jako ty, jejichï hladina je zv ena v dûsledku onemocnûní. Pomocí vytvofieného klasifikaãního schématu pak správnû urãily 90% míst pûvodu nádorû, vãetnû 9 z 12 metastáz. Bhattacharjee et al. (27) dokázal, Ïe expresní mikroãipy jsou schopné rozli it primární plicní adenokarcinom od metastáz extra-pulmonálního pûvodu. Tyto studie prokázaly, Ïe metastázy si obecnû zachovávají expresní profil tkánû, ze které pocházejí, ãímï naznaãily potenciál ãipové technologie pro identifikaci tkáàového pûvodu u karcinomû vznikl ch z neznámého zdroje. Pfiedpovûì odpovûdi na léãbu Jedním z prvních úspûchû vyuïití mikroãipû pro odhad reakce pacienta na léãebn program byla identifikace 95 genû, jejichï expresní profil u pacientû s ALL podává informaci o citlivosti bunûk k STI571 (glivec, imatinib) (28). Pro leukemické buàky rezistentní vûãi pûsobení STI571 bylo charakteristické zv ení exprese v genech pro Bruton s tyrosin kinázu a dvou ATP syntetáz (ATP5A1 a ATP5C1). Na druhou stranu vykazovaly signifikatní pokles v aktivitû proapoptotického genu BAK1 a genu kontrolujícího prûbûh bunûãného cyklu p15ink4b. Obdobnû byly prokázány odli né expresní profily u skupin pacientek s rakovinou prsu pozitivnû, respektive negativnû reagujících na pfiedoperativní podávání docetaxelu (29). Celkem bylo definováno 92 genû, které vykazují odli nou aktivitu u chemosenzitivních/rezistentních pacientek. Z toho 14 genû vykazovalo zv enou expresi u pacientek rezistentních na léãbu docetaxelem, pfiiãemï tyto geny, pokud je jiï známa jejich funkce, se úãastní pfieváïenû procesû fiízení bunûãného cyklu, RNA transkripce a translace. U pacientek, které odpovídaly na léãbu docetaxelem, bylo identifikováno 78 genû se zv enou expresí. Z nich nejvíce náleïelo do kategorií genû úãastnících se apoptózy, stresov ch reakcích, adheze, transportu proteinû, signální transdukce nebo sestfiihu a transportu RNA. cdna mikroãipy oligounukleotidové mikroãipy V hody není nutná promární znalost uniformní délka (do 80 b) cdna sekvence moïnost vlastního naná ení automatizace, kontrola kvality spotû v laboratofii bûhem syntézy nárûst intenzity signálu vy í specifita, niï í pravdûpodobnost pozitivnû korelujes délkou sondy cross-hybridizace del í sonda (=stabilnûj í hybridní molekula) umoïàuje nastavit více stringentní podmínky, tím se sníïí signál pozadí cenovû v hodnûj í Nev hody moïnost cross-hybridizace moïnost kontaminace cdna klonû/pcr produktû Tabulka 1: Srovnání typû sond - klony cdna/pcr produkty versus oligonukleotidy Pfiísliby do budoucna Potenciál expresních mikroãipû pro zlep ování diagnostického a prognostického testování nejen v onkologii je stále více zfiejm. Z dat poskytovan ch ãipov mi technologiemi lze vybrat malé mnoïství markerû, jejichï genovou expresi je moïné dále sledovat konvenãními, iroce roz ífien mi technikami jako jsou imunohistochemie, in situ hybridizace ãi PCR. KvÛli genetické komplexnosti onkologick ch onemocnûní by ale mûla b t daleko pfiesnûj í kombinace molekulárních markerû získaná obsáhlou anal zou neï pouïití jediného markeru. Z toho vypl vá dal í vyuïití ãipov ch technologí: komplexní testování exprese v nádorové tkáni (pomocí mikroãipu vyrobeného pfiímo na míru danému onemocnûní) a vyuïití expresních profilû jako klinick ch testû. Je zde v ak stále je tû nûkolik nevyfie en ch otázek, na které bude tfieba nalézt odpovûì pfied zavedením mikroãipû do kaïdodenní klinické praxe. Nûkteré se t kají samotné technologie, jiné klinické vyuïitelnosti ãipû. DÛleÏit m problémem je standardizace metodiky. V souãasné dobû existuje velké mnoïství rûzn ch ãipov ch platforem, které vyuïívají rozdílné sady genû, hybridizaãní podmínky ãi detekãní metody. Na nûkter ch mikroãipech jsou spotovány cdna sondy rozliãn ch délek, na jin ch jsou syntetické délkovû uniformní oligonukleotidy; sonda pro tent Ï gen mûïe b t reprezentována na rûzn ch ãipech rûzn mi sekvencemi. Bylo pozorováno, Ïe délka sondy, stejnû jako její poloha v rámci hybridizujícího transkriptu hraje roli v intenzitû detekovaného signálu. Sondy krat- í neï 400 nukleotidû poskytují aï o polovinu niï í intenzity signálû neï sondy o délce 600-2000 nukleotidû. Obdobnû sondy odvozené od 3 -konce mrna se jeví z hlediska signálu jako v hodnûj í (6). KaÏdá laboratofi také mûïe mít jin pfiístup k získávání vzorkû z nádorové tkánû, pouïívat jiné kontrolní vzorky, ãi sady pouïívan ch markerû - to v e mûïe vést k rozdílûm v intenzitû signálû. Rutinnímu vyuïití této technologie brání v neposlední fiadû i fakt, Ïe komerãnû dostupné mikroãipy a pfiístrojové stanice jsou stále pfiíli drahé. Technologická revoluce v posledních letech zpûsobená prudk m rozvojem high-throughput technologií sk tá nové moïnosti pro v zkum na poli molekulární medicíny a otevírá prostor pro celistvûj í pochopení svûta biomolekul. Z onkologického hlediska DNA ãipy umoïàují zcela nov pohled do komplexity nádorû a pfiedstavují do budoucna velik potenciál pro zlep ení lékafiské péãe o pacienta. 336 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006

Literatura 1. Wadlow R, Ramaswamy S. DNA Microarrays in clinical cancer research. Current Molecular Medicine 2005, 5:111-120. 2. Lander ES, Linton LM, Birren B et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 2001, 409(6822):860-921. 3. Venter JC, Adams MD, Myers EW et al. The sequence of the human genome. Science 2001, 291(5507):1304-51. 4. www.affymetrix.com 5. Ramaswamy S, Golub TR. DNA microarrays in clinical oncology. J Clin Oncol 2002, 20(7):1932-41. 6. Brentani RR, Carraro DM, Verjovski-Almeida S et al. Gene expression arrays in cancer research: methods and applications. Crit Rev Oncol Hematol. 2005, 54(2):95-105. 7. Raychaudhuri S, Sutphin PD, Chang JT, Altman RB. Basic microarray analysis: grouping and feature reduction. Trends Biotechnol 2001, 19(5): 189-93. 8. Eisen MB, Spellman PT, Brown PO, Botstein D. analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci U S A 1998, 95(25):14863-8. 9. Khan J, Simon R, Bittner M et al. Gene expression profiling of alveolar rhabdomyosarcoma with cdna microarrays. Cancer Res 1998, 58(22):5009-13. 10. Golub TR, Slonim DK, Tamayo P et al. Molecular classification of cancer: class discovery and class prediction by gene expression monitoring. Science 1999, 286(5439):531-7. 11. Alizadeh AA, Eisen MB, Davis RE et al. Distinct types of diffuse large B- cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature 2000, 403(6769):503-11. 12. Armstrong SA, Staunton JE, Silverman LB et al. MLL translocations specify a distinct gene expression profile that distinguishes a unique leukemia. Nat Genet 2002, 30(1):41-7. 13. Nakao M, Yokota S, Iwai T et al. Internal tandem duplication of the flt3 gene found in acute myeloid leukemia. Leukemia 1996, 10(12):1911-8. 14. Tse KF, Mukherjee G, Small D. Constitutive activation of FLT3 stimulates multiple intracellular signal transducers and results in transformation. Leukemia 2000, 14(10):1766-76. 15. Zhao M, Kiyoi H, Yamamoto Y et al. In vivo treatment of mutant FLT3- transformed murine leukemia with a tyrosine kinase inhibitor. Leukemia 2000, 14(3):374-8. 16. Sorlie T, Perou CM, Tibshirani R et al. Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical implications. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001, 98(19):10869-74. 17. Bittner M, Meltzer P, Chen Y et al. Molecular classification of cutaneous malignant melanoma by gene expression profiling. Nature. 2000, 406(6795):536-40. 18. van t Veer LJ, Dai H, van de Vijver MJ et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature 2002, 415(6871):530-6. 19. van de Vijver MJ, He YD, van t Veer LJ et al. A gene-expression signature as a predictor of survival in breast cancer. N Engl J Med 2002, 347(25):1999-2009. 20. Rosenwald A, Wright G, Chan WC et al.the use of molecular profiling to predict survival after chemotherapy for diffuse large-b-cell lymphoma. N Engl J Med 2002, 346(25):1937-47. 21. Beer DG, Kardia SL, Huang CC et al. Gene-expression profiles predict survival of patients with lung adenocarcinoma. Nat Med 2002, 8(8):816-24. 22. Takahashi M, Rhodes DR, Furge KA et al. Gene expression profiling of clear cell renal cell carcinoma: gene identification and prognostic classification. Proc Natl Acad Sci U S A 2001, 98(17):9754-9. 23. Kosari F, Parker AS, Kube DM et al. Clear cell renal cell carcinoma: gene expression analyses identify a potential signature for tumor aggressiveness. Clin Cancer Res 2005, 11(14):5128-39. 24. Giordano TJ, Shedden KA, Schwartz DR et al. Organ-specific molecular classification of primary lung, colon, and ovarian adenocarcinomas using gene expression profiles. Am J Pathol 2001, 159(4):1231-8. 25. Ramaswamy S, Tamayo P, Rifkin R et al. Multiclass cancer diagnosis using tumor gene expression signatures. Proc Natl Acad Sci U S A 2001, 98(26):15149-54. 26. Su AI, Welsh JB, Sapinoso LM et al. Molecular classification of human carcinomas by use of gene expression signatures. Cancer Res 2001, 61(20):7388-93. 27. Bhattacharjee A, Richards WG, Staunton J et al. Classification of human lung carcinomas by mrna expression profiling reveals distinct adenocarcinoma subclasses. Proc Natl Acad Sci U S A 2001, 98(24):13790-5. 28. Hofmann WK, de Vos S, Elashoff D et al. Relation between resistance of Philadelphia-chromosome-positive acute lymphoblastic leukaemia to the tyrosine kinase inhibitor STI571 and gene-expression profiles: a geneexpression study. Lancet 2002, 359(9305):481-6. 29. Chang JC, Wooten EC, Tsimelzon A et al. Patterns of resistance and incomplete response to docetaxel by gene expression profiling in breast cancer patients. J Clin Oncol 2005, 23(6):1169-77. KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 337