Studium degradačních změn PCB v závislosti na vnějších podmínkách Vlasta Dudková, Stanislava Šolcová a Kateřina Demnerová VŠCHT Praha, Ústav biochemie a mikrobiologie, Technická 3, Praha 6, 166 28 Inovativní sanační technologie ve výzkumu a praxi Ţďár nad Sázavou 8. 9. 10. 2008
Osnova Problematika PCB Cíle Naměřená data Závěr
Chlorace bifenylu (209 kongenerů) Úvod - PCB Syntetický charakter Charakteristiky (nehořlavé, nerozpustné v vodě, stabilní, odolné proti vysokým teplotám a elektrickému napětí, dlouhověkost) Průmyslové použití (electrická zařízení, teplotní výměníky, hydraulické systémy a další specializované aplikace) Toxický efekt (bioakumulace v potravním řetězci)
Degradace PCB za aerobních podmínek OH OH OH H COOH H O A OH B OH C D CH 2 HOOC OH COOH VI O 2 NADPH H 2 O 2 H 2 O I II III IV V I: chlorbifenyl A: bifenyl-2,3-dioxygenasa (bpha) B: bifenyldihydrogendioldehydrogenasa (bphb) C: 2,3-dihydroxybifenyl-1,2-dioxygenasa (bphc) D: 2-hydroxy-6-oxo-6-fenylhexa-2,4-dienoáthydrolasa (bphd) II: cis-2,3-dihydro-2,3-dihydroxychlorbifenyl III: 2,3-dihydroxychlorbifenyl IV: 2-hydroxychlor-6-oxo-6-fenylhexa-2,4-dienová kyselina V: chlorbenzoová kyselina VI: 2-hydroxychlor-2,4-pentadienová kyselina
Popis testování degradačních změn Indukovaná bakteriální kultura o T 600 = 10-2 Delor 103 (2 μg/ml) + ISTD (PCB 209-0,3 μg/ml ) 48 hod inkubace Extrakce PCB diethylether (6 hod) GC-μECD (DB-XLB; 30 X 0,25 X 0,25) Statistická analýza dat (Dixonův test; ANOVA) Frame, G. M. (1997): A collaborative study of 209 PCB congeners and Aroclors on 20 different HRGC columns 1. Retention and coelution database. Fresenius' Journal of Analytical Chemistry 357: 701-713 Frame, G. M. (1997): A collaborative study of 209 PCB congeners and Aroclors on 20 different HRGC columns 2. Semi-quantitative Aroclor congener distribution. Fresenius' Journal of Analytical Chemistry 357: 714-722
Proč Pseudomonas pseudoalcaligenes JAB-1? 400 153 + 180 28 350 300 250 200 150 ng/ml 52 101 138 100 50 0 Kontrola 6 hodin 18 hodin 48 hodin 78 hodin IUPAC # Ryšlavá E., Krejčík Z., Macek T., Nováková H., Demnerová K., Macková M. (2003): Study of PCB degradation in real contaminated soil. Fresenius Enviromental Bulletin 12: 296-301
Bifenyl v médiu?? Induktor Kompetitivní inhibitor Postupné vyuţívání substrátů Imbeault N. Y. R., Powlowski J. B., Colbert Ch. L., Bolin J. T., Eltis L. D. (2000): Steady-state kinetic characterization and crystallization of a polychlorinated biphenyl-transforming dioxygenase. Journal of Biological Chemistry 275(17): 12430-12437
Bifenyl v médiu 18 17 13 + 27 24 16 15 32 34 + 54 29 26 25 31 + 53 28 20 + 33 51 45 22 46 43 52 48 49 47 75 44 42 71 41 64 37 + 40 + 68 57 58 + 67 102 63 95 74 70 66 + 91 55 92 84 60 + 101 99 83 97 87 85 110 82 + 151 77 + 135 + 144 147 123 134 105 138 209 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 4 97 6 8 19 ng/ml Kontrola Bifenyl Ne bifenyl IUPAC #
Závislost na ph Jak se změní spektrum degradovatelných kongenerů v závislosti na ph?
19 18 17 13 + 27 24 16 15 32 34 + 54 29 26 25 31 + 53 28 20 + 33 51 45 22 46 43 52 48 49 47 75 44 42 71 41 64 37 + 40 + 68 57 58 + 67 102 63 95 74 70 66 + 91 55 92 84 60 + 101 99 83 97 87 85 110 82 + 151 77 + 135 + 144 147 123 134 105 138 209 Kultivace při různém ph 140 120 ng/ml 100 80 60 40 20 0 4 9 7 6 8 Kontrola ph 5,5 ph 6 ph 9 ph 7 IUPAC #
Ovlivnění ionty Mg 2+ katalytické centrum bifenyldioxygenasa Ca 2+ regulace přenašečů (transport PCB do buňky) Fe 2+ součást Fe-S proteinů (ferredoxin, bifenyldioxygenasa) G - bakterie Mg 2+ brání tvorbě pórů v membráně Divalentní ionty redukce nábojových repulsí (vazba na LPS vnější membrány) Sikkema J, de Bont J. A. M. a Poolman B. (1995): Mechanisms of membrane toxicity of hydrocarbons. Microbiological reviews 59 (2): 201-222 Segura A., Duque E., Mosqueda G., Ramos J. L. a Junker F. (1999) Multiple responses of Gram-negative bacteria to organic solvent. Environmental Microbiology 1(3): 191 198
8 19 18 17 13 + 27 24 16 15 32 34 + 54 29 26 25 31 + 53 28 20 + 33 51 45 22 46 43 52 48 49 47 75 44 42 71 41 64 37 + 40 + 68 57 58 + 67 102 63 95 74 70 66 + 91 55 92 84 60 + 101 99 83 97 87 85 110 82 + 151 77 + 135 + 144 147 123 134 105 138 209 Ca 2+ Mg 2+ Fe 2+ 100 80 ng/ml 60 40 20 0 4 976 Kontrola Fe Ca Mg IUPAC #
Kombinace Ca 2+ Mg 2+ Fe 2+ 100 80 ng/ml 60 40 20 0 Kontrola FeCa MgFe CaMg IUPAC #
8 19 18 17 13 + 27 24 16 15 32 34 + 54 29 26 25 31 + 53 28 20 + 33 51 45 22 46 43 52 48 49 47 75 44 42 71 41 64 37 + 40 + 68 57 58 + 67 102 63 95 74 70 66 + 91 55 92 84 60 + 101 99 83 97 87 85 110 82 + 151 77 + 135 + 144 147 123 134 105 138 209 Různé koncentrace Mg 2+ 100 80 ng/ml 60 40 20 0 4 976 Kontrola 0,081 541 0,81 54,1 mmol/l IUPAC # Mg 2+
Závěry a diskuse ph: optimální 7 Degradace jen v přítomnosti Mg 2+ iontů Koncentrace Mg 2+ : optimální 1 50 mmol/l
Skládka Lhenice Reálná půda Půda větraná a zalévaná každých 14 dní Doba ošetřování: 150 dní µmol/l µmol/l NO 3-25 NH 4 + 1 500 SO 4-850 Na + 3 500 PO 4 3-5 000 Ca 2+ 12 HPO 4-3 500 K + 2 000 H 2 PO 4-2 000 Mg 2+ 80 Fe 2+ 4
0 IUPAC # 206 195 + 207 196 + 203 170 + 198 193 156 173 181 + 202 128 + 175 138 130 179 146 118 147 + 149 151 136 83 99 56 + 84 66 + 91 95 58 + 67 64 96 42 47 + 104 52 46 51 31 + 53 34 15 27 400000 19 6 1 Reálná půda 500000 ng/g 300000 200000 100000 Kontrola Voda Mg2 MgSO4 FeCaMg
10 19 18 17 27 24 16 15 32 54 34 26 25 31 + 53 28 20 + 33 51 45 22 46 73 43 52 48 49 47 + 75 44 42 71 41 96 72 37 + 40 94 58 + 67 102 63 95 74 70 66 + 91 80 92 56 + 84 60 + 113 99 Reálná půda Thousands 500 400 300 200 100 0 ng/g Kontrola Voda Mg2 MgSO4 FeCaMg IUPAC #
Děkuji za pozornost Tato práce byla financována z výzkumných projekt Centrum 1M06011 a NPV II 2B06151
Celkové počty MO na PCA 16,0 14,0 12,0 10,0 cfu * 10 6 [g půdy] 8,0 6,0 4,0 2,0 0,0 H2O H2O + MgSO4, FeSO4, Ca(NO3)2 H2O + FeSO4, Ca(NO3)2 H2O + MgSO4 H2O + Mg2 MM MM + MgSO4, FeSO4, Ca(NO3)2 MM + FeSO4, Ca(NO3)2 MM + MgSO4 MM + MgSO4 (prášek) MM + Mg2 MM + MgSO4, FeSO4 MM + MgSO4, Ca(NO3)2 MM + FeSO4 MM + Ca(NO3)2
Celkové počty MO na MM 16,0 14,0 12,0 cfu * 10 6 [g půdy] 10,0 8,0 6,0 4,0 2,0 0,0 H2O H2O + MgSO4, FeSO4, Ca(NO3)2 H2O + FeSO4, Ca(NO3)2 H2O + MgSO4 H2O + Mg2 MM MM + MgSO4, FeSO4, Ca(NO3)2 MM + FeSO4, Ca(NO3)2 MM + MgSO4 MM + MgSO4 (prášek) MM + Mg2 MM + MgSO4, FeSO4 MM + MgSO4, Ca(NO3)2 MM + FeSO4 MM + Ca(NO3)2
Analytické stanovení PCB pomocí GC/µ-ECD Agilent 6890N DB-XLB (30 m 0,25 mm 0,25 µm) N 2 (inlet 45,1 ml/min; detektor 60 ml/min) Splitless (1 µl vzorku) Isobaricky (0,993 bar) Teplota: inlet - 250 C pec: 50 C (30 C/min) 160 C (2,5 C/min) 300 C detektor - 340 C