Biotechnologické aplikace mikroorganismů sylabus 1
FYZIOLOGICKÉ VLASTNOSTI A BIOTECHNOLOGICKÉ VYUŽITÍ ZÁSTUPCŮ RODU PSEUDOMONAS... 4 VÝZNAM PSEUDOMONÁD... 4 BIOCHEMICKÉ VYBAVENÍ... 5 FYZIOLOGICKÉ VLASTNOSTI A BIOTECHNOLOGICKÉ VYUŽITÍ ZÁSTUPCŮ RODU BACILLUS... 5 VÝZNAM BACILŮ... 5 FYZIOLOGICKÉ VLASTNOSTI A BIOTECHNOLOGICKÉ VYUŽITÍ SPORULUJÍCÍCH ANAEROBŮ. 6 TECHNOLOGICKÉ APLIKACE SPORULUJÍCÍCH ANAEROBŮ... 7 PRODUKCE TOXINŮ... 8 BAKTERIE SYNTETIZUJÍCÍ AMINOKYSELINY... 8 ENZYMOVÉ VYBAVENÍ KORYNEFORMNÍCH BAKTERIÍ... 9 BAKTERIE MLÉČNÉ, OCTOVÉ A PROPIONOVÉ... 9 ZÁKLADNÍ CHARAKTERISTIKA... 9 BIOTECHNOLOGICKÉ APLIKACE... 9 METHANOGENEZE... 10 METHYLOTROFNÍ MIKROORGANISMY... 11 ANABOLISMUS METHYLOTROFŮ... 12 KATABOLISMUS METHYLOTROFŮ... 12 VYUŽITÍ METHYLOTROFŮ V BIOTECHNOLOGIÍCH... 13 FYZIOLOGICKÉ VLASTNOSTI A BIOTECHNOLOGICKÉ VYUŽITÍ RODU ZYMOMONAS... 13 AKTINOMYCETY JEJICH VYUŽITÍ V BIOTECHNOLOGIÍCH... 14 VLASTNOSTI A BIOTECHNOLOGICKÉ VYUŽITÍ RODŮ AGROBACTERIUM, DEINOCOCCUS A THERMUS... 16 ROD AGROBACTERIUM... 16 VYUŽITÍ V BIOTECHNOLOGIÍCH... 17 ROD DEINOCOCCUS... 17 VYUŽITÍ V BIOTECHNOLOGIÍCH... 18 ROD THERMUS... 18 VYUŽITÍ V BIOTECHNOLOGIÍCH... 18 SINICE... 18 VYUŽITÍ V BIOTECHNOLOGIÍCH... 19 VLASTNOSTI A BIOTECHNOLOGICKÉ VYUŽITÍ VLÁKNITÝCH MIKROSKOPICKÝCH HUB... 20 ROD ASPERGILLUS... 20 VYUŽITÍ V BIOTECHNOLOGIÍCH... 21 ROD PENICILLIUM... 21 VYUŽITÍ V BIOTECHNOLOGIÍCH... 22 ROD TRICHODERMA... 22 VYUŽITÍ V BIOTECHNOLOGIÍCH... 23 ROD CLAVICEPS... 24 ROD FUSARIUM... 25 VLASTNOSTI A BIOTECHNOLOGICKÉ VYUŽITÍ KVASINEK... 25 2
ROD SACCHAROMYCES... 26 VYUŽITÍ V BIOTECHNOLOGIÍCH... 26 PŘÍKLADY DALŠÍCH KVASINEK VYUŽÍVANÝCH V BIOTECHNOLOGIÍCH... 26 JEDNOBUNĚČNÉ ŘASY... 27 VYUŽITÍ V BIOTECHNOLOGIÍCH... 27 3
Fyziologické vlastnosti a biotechnologické využití zástupců rodu Pseudomonas Rod Pseudomonas je z hlediska své morfologie representován gramnegativními tyčinkami přímými nebo mírně zakřivenými, pohybujícími se (velmi často) pomocí polárně situovaných bičíků, nevytváří spory ani jiné klidové formy. Jeho zástupci jsou heterotrofně aerobní a nikdy nedisponují fermentativním metabolismem. Z fylogenetického hlediska tento rod zahrnuje velmi širokou skupinu fyziologicky značně odlišných prokaryot z domény bakterií, vnitřně tříděných na základě homologie 16S rrna do pěti skupin. Lze je izolovat z nejrůznějšího přírodního materiálu. Lokality s přibližně neutrálními hodnotami ph (případně mírně kyselé prostředí do ph 4,5), přítomnost rozpustných organických substrátů, nepříliš nízká tenze kyslíku, teplota v rozmezí hodnot 4 až 42 C, to jsou obecně vhodné podmínky pro výskyt pseudomonád. Z toho vyplývá, že přirozenými místy výskytu může být říční a mořská voda, půda, povrch rostlin (včetně kořenového systému) a potraviny. Značná rozmanitost této skupiny mikroorganismů je častou příčinou obtíží při jejich taxonomickém zařazení. Podobná morfologie, případně shodné fyziologické vlastnosti tedy nejsou jednoznačným kriteriem pro taxonomické zařazení zástupců tohoto rodu. Řada druhů původně zařazených do rodu Pseudomonas byla včleněna a reklasifikována do nově zavedených rodů (např. rody Acidovorax, Aminobacter, Burkholderia, Comamonas, Deleya, Hydrogenophaga, Methylobacterium, Delftia). Význam pseudomonád 1. Degradace rozsáhlé škály organických molekul až na oxid uhličitý. Rod Pseudomonas je nutričně nenáročný. Dobré podmínky pro růst zajišťuje jednoduché minerální médium doplněné organickými molekulami jako zdroji uhlíku a energie. Utilizovány mohou být jak jednouhlíkaté látky (s výjimkou CO 2 ), tak i velmi neobvyklé C-zdroje, které se v současném, často kontaminovaném prostředí vyskytují. Těmito vlastnostmi se rod Pseudomonas podílí na koloběhu uhlíku v přírodě. Rod Pseudomonas využívá jako zdroj dusíku amonné ionty, aminokyseliny a často i nitrát. Aerobní asimilace nitrátu spočívá v jeho redukci na amonné ionty, které jsou následně inkorporovány do buňky. Nutriční přizpůsobivost pseudomonád je dána přítomností řady induktivních operonů, které jsou v případě potřeby přepisovány a tak zajišťují buňce přítomnost širokého spektra často neobvyklých enzymů. Tato vlastnost činí pseudomonády ekologicky významnými mikroorganismy ve vodním a půdním prostředí. Jsou zodpovědné za degradaci mnoha látek vzniklých rozkladem rostlin a živočichů včetně xenobiotik v aerobním prostředí. 2. Někteří zástupci tohoto rodu jsou původci kažení chlazeného masa, mléka, vajec, ryb, tuků, a to vzhledem ke svým schopnostem růstu i při 4 C a vhodnému enzymovému vybavení (přítomnost lipasy, proteasy). Kontaminovaným potravinám mohou pseudomonády udělovat pachutě (mýdlová, hořká), cizí vůně (rybí, ovocná), případně zabarvení (žluté, červené, zelené, modré, fluoreskující) v důsledku přítomnosti zejména fenazinových barviv. 3. Některé druhy jsou řazeny mezi rostlinné a živočišné pathogeny, vykazující značnou rezistenci vzhledem k většině běžně používaných antibiotik. Mohou také kontaminovat krev, případně krevní deriváty uchovávané v chladících prostorech. 4. V některých případech slouží jako modelové mikroorganismy pro fyziologická a biochemická studia. 4
5. Fluorescentní pseudomonády jsou zodpovědné za produkci sekundárních metabolitů, zejména sideroforů (látek zajišťujících ionty železa) a antibiotik (s účinky namířenými proti bakteriím, kvasinkám i plísním). Biochemické vybavení Pro rod Pseudomonas je charakteristický aerobně respirační metabolismus. Zástupci tohoto rodu disponují plně funkčním Krebsovým cyklem a pro biosyntetické účely je určen glyoxalátový cyklus, který má funkci jako anaplerotického systému. Katabolismus organických látek je často založen na aktivitě oxygenas. Oxygenasy (zejména 1,2-dioxygenasa a 2,3-dioxygenasa) se podílejí na počátečních krocích štěpení mnoha alifatických i aromatických látek. V r. 1952 objevili Entner a Doudoroff u kmene P. saccharophila do té doby neznámý způsob štěpení glukosy, který byl následně prokázán u dalších pseudomonád a který byl podle svých objevitelů nazván Entner-Doudoroffova (E-D) dráha. Základní schéma E-D dráhy je obdobné jako v případě Embden-Meyerhof-Parnasovy dráhy. Rozdíl spočívá v přítomnosti dvou enzymů, unikátních pouze pro E-D dráhu, a to 6-fosfoglukonátdehydratasy (EDD) a 2-keto-3-deoxy- 6-fosfoglukonátaldolasy (EDA). E-D dráha je realizována i jinými mikroorganismy, a to ze všech tří domén živých organismů. Fyziologické vlastnosti a biotechnologické využití zástupců rodu Bacillus Rod Bacillus je representován extrémně širokou skupinou tyčinkových grampozitivních bakterií se světlolomnými sporami. Většina zástupců je pohyblivá prostřednictvím bičíků umístěných laterálně nebo peritrichálně. Metabolismus bacilů je chemoheterotrofní, organické látky jsou disimilovány striktní fermentací, striktní respirací, případně kombinací fermentace a respirace. Jinými slovy, zástupci bacilů jsou obligátně aerobní, případně fakultativně nebo obligátně anaerobní. V respiračním metabolismu jsou konečnými akceptory elektronů buď molekulový kyslík, nebo nitrát. Spektrum utilizovaných substrátů je druhově závislé a úzce souvisí i s místem výskytu. Velká část bacilů patří mezi saprofyty osídlujícími především půdní prostředí, někteří zástupci jsou vzhledem k produkci toxinů patogenní. Můžeme je nalézt ve velmi širokém teplotním pásmu (již od -5 C, horní limit pro některé vegetativně rostoucí formy činí 75 C) a rozmezí ph (ph 4 10). Pro zástupce tohoto rodu je typická tvorba světlolomných endospor charakteristických extrémní odolností vůči řadě faktorů vnějšího prostředí (např. teplo, vysušení, UV záření). V tomto směru představují endospory rodu Bacillus jednu z nejodolnějších dosud poznaných životních forem. Význam bacilů S rodem Bacillus jsou spojeny především následující oblasti průmyslových aplikací: 1. Buněčný růst i sporulace jsou procesy spojené se značným množstvím biosyntetických i biodegradačních aktivit, z nichž mnohé nacházejí technologické uplatnění. Předmětem komerčního zájmu jsou především všechny enzymy degradující škrob (α-amylasa, β-amylasa, amyloglukosidasa). Extracelulární enzymy - celulasa a xylanasa jsou potenciálně využitelné při konverzi různých odpadních látek a přírodních materiálů na snáze utilizovatelné substráty. Dalšími využitelnými enzymy jsou pektolytické enzymy a proteasy (esterasy, metaloproteasy, alkalické serinové proteasy). 5
2. Četní zástupci tohoto rodu produkují látky antimikrobní povahy patřící mezi peptidy. Tato produkce je významná zejména u B. subtilis (65 70 různých peptidových antibiotik) a B. brevis (20 25 antibiotik). Účinek antibiotik je namířen především proti grampozitivním bakteriím, jiná působí na bakterie gramnegativní, případně na kvasinky a plísně. Zajímavým rysem antibiotik je jejich neobvyklá struktura založená na přítomnosti D-aminokyselin a některých atypických aminokyselin, které se v proteinech běžně nevyskytují. Vzhledem k této skutečnosti jsou příslušné struktury odolné vůči působení proteolytických enzymů, s nimiž jsou v bezprostředním kontaktu, případně vůči obdobným enzymům rostlinného a živočišného původu. Dalším charakteristickým rysem antibiotik je to, že s jejich syntézou nesouvisí ribozómy, ale že sekvence aminokyselin je determinována enzymy. 3. Některé druhy bacilů vykazují insekticidní vlastnosti, působí na různá vývojová stadia hmyzu. Dominantní pozici zaujímá B. thuringiensis syntetizující toxiny s účinky na ekonomicky významné druhy hmyzu. S nástupem sporulace s v mateřské buňce producenta vytvářejí krystalické inkluze protoxických molekul příslušných proteinů. Jakmile je parasporální krystal vstřebán hmyzem, je solubilizován a aktivován (při ph 9 10). Následná interakce molekul toxinu s buněčnou membránou zažívací trubice hmyzu vede k poruše transportních procesů a následné lyzi hostitele. Geny zodpovědné za syntézu příslušných toxinů jsou dobře prostudované a byly využity při přípravě transgenních Bt rostlin. 4. Další potenciální aplikace představuje aerobní produkce vitaminu B 12 (B. megaterium), produkce enzymů penicilinamidasy a steroidhydrolasy (B. megaterium) a schopnost štěpit neobvyklé C-P vazby, a tak se podílet na bioremedici lokalit kontaminovaných některými insekticidy. V posledních letech je často zmiňovaným zástupcem tohoto rodu B. anthracis, původce závažného infekčního onemocnění teplokrevných živočichů známého pod názvem antrax (sněť slezinná). Je-li příslušné onemocnění u postiženého pacienta včas diagnostikováno, pak je úspěšně léčitelné. Nástup onemocnění, zvláště v případě inhalace spor, je ovšem velice rychlý, což může mít fatální důsledky. Této skutečnosti bylo již několikrát zneužito v bioteroristických akcích. Některé druhy, zejména B. cereus, kontaminují potraviny a jsou příčinou jejich kažení. Rezistence spor k vysušení umožňuje přečkat dlouhou dobu i ve vysušených potravinách (obiloviny, mouka). Následné zpracování potravin má za následek klíčení spor, jejich růst a produkci především emetických toxinů. Infikovány mohou být i další potraviny, např. mléko, maso, zelenina, sušené byliny a koření. Fyziologické vlastnosti a biotechnologické využití sporulujících anaerobů V rámci této kapitoly budou zmíněny vlastnosti obligátně anaerobních sporulujících gramnegativních bakterií, které jsou zajímavé z biotechnologického hlediska. Anaerobní bakterie jsou producenty celé řady látek vzhledem k tomu, že jejich katabolismus umožňuje jednak neúplné degradace víceuhlíkatých látek, jednak syntézu velkých molekul z jednoduchých uhlíkatých substrátů. Sporulace vede ke tvorbě endospor, které jsou velmi odolné vůči řadě faktorů vnějšího prostředí (např. mohou být uchovány za přítomnosti kyslíku) a stabilitou svých vlastností představují vhodné inokulum. Tato skupina zahrnuje více druhů, technologické uplatnění je spojeno především s rodem Clostridium, v některých případech pak se zástupci rodů 6
Butyribacterium, Sporolactobacillus a Desulfotomaculum. Jednotlivé taxony lze isolovat z různých zdrojů. Jsou to např. zkažené potraviny a jakékoliv přirozené nebo uměle vytvořené anaerobní prostředí (říční a mořské usazeniny, zažívací trakt živočichů, dřevní hmota). Některé druhy rodu Clostridium osidlují termální prameny a vulkanické systémy. Z fyziologického hlediska je tato skupina rozmanitá. Teplotní pásmo růstu je v rozmezí 20-60 C, někteří zástupci patří mezi halofily (vyžadují pro růst koncentraci 5 15 % NaCl). Z hlediska vývoje života na Zemi lze předpokládat, že sporulující anaerobové patří mezi mikroorganismy značně zakonzervované evolucí. Disponují výkonným enzymovým aparátem, který jim umožňuje realizovat katabolické děje i za energeticky stresových podmínek. Byly to patrně rozmanité depolymerasy a oxidoreduktasy, které zodpovídaly za transformace substrátů v raných fázích vývoje života. Technologické aplikace sporulujících anaerobů 1. Produkce rozpouštědel Snad nejdéle známá je produkce acetonu a butanolu druhem C. acetobutylicum, který je schopen utilizovat široké spektrum často i odpadních substrátů (škrob, syrovátka, hexosy, pentosy). Zatímco v minulosti byl v centru pozornosti hlavně aceton, používaný jako příměs do leteckých benzinů, nyní jde zejména o butanol, který by na základě svých vlastností mohl být přidáván do motorové nafty a do benzinu. V současné době je pro produkci 1-butanolu využíván C. beijerinckii. Produkce etanolu termofily (C. thermocellum, C. thermohydrosulfuricum, C. thermosaccharolyticum ) je perspektivní jednak vzhledem k možnosti využít levné suroviny (celulosa, hemicelulosy, škrob, hexosy, pentosy), jednak z důvodů vyšších reakčních rychlostí pří dané teplotě. 2. Produkce organických kyselin Nejzajímavější je v tomto směru produkce octové kyseliny druhem C. thermoaceticum. Pokud je výchozí surovinou hexosa, pak z 1 molu substrátu jsou získány 3 moly produktu, což znamená, že nevzniká žádný vedlejší produkt. Mezi další organické kyseliny produkované metabolismem sporulujících anaerobů patří kyselina máselná, kaproová, mléčná, propionová a akrylová. 3. Produkce methanu Sporulující anaerobové mají mimořádný význam při anaerobní degradaci zemědělských, městských a průmyslových odpadů. Tato skupina mikroorganismů ovšem nevytváří methan jako konečný produkt svého katabolismu, ale výsledkem fermentace vysokomolekulárních biopolymerů jsou prekursory (jedno či dvouuhlíkaté), které jsou následně využívány methanogeny. Výsledkem metabolické spolupráce dvou skupin mikroorganismů (celulolytických a methanogenních) je konečný produkt, methan. 4. Produkce vitaminů Tato skupina prokaryot představuje významný potenciál pro produkci vitaminů, přestože výše celkového nárůstu biomasy je u anaerobů ve srovnání s aeroby podstatně nižší a to i při růstu na týchž substrátech. Důvodem je velká potřeba vitaminů pro enzymové reakce anaerobů. Znamená to, že např. fermentace Butyribacterium methylotroficum vycházející z methanolu vede k vysoké produkci vitaminu B 12. Ze stejné příčiny je biomasa C. acetobutylicum dobrým zdrojem riboflavinů. 7
Produkce toxinů Clostridium botulinum vyskytuje se v půdě a v mořské vodě a vytváří nejsilnější známé bakteriální toxiny, botulotoxiny (smrtelná dávka činí 6 x 10-8 g). Podle antigenních charakteristik toxinů lze u produkujících kmenů rozlišit až 8 různých typů toxinů. S výjimkou jednoho se jedná o neurotoxiny. Čisté toxiny jsou termolabilní, jsou inaktivovány t = 80 C po dobu 10 min. Botulotoxiny mohou být produkovány též některými kmeny C. butyricum a C. baratii. Clostridium tetani půdní bakterie, producent tetanotoxinu. Vlastní onemocnění způsobují dva toxiny (tetanolysin, tetanospasmin), řazené rovněž mezi neurotoxiny. Bakterie syntetizující aminokyseliny Koncem 50. let 20. stol. byl v Japonsku popsán první kmen schopný extracelulární produkce glutamové kyseliny, který získal taxonomické označení Micrococcus glutamicus. Později byl reklasifikován jako Corynebacterium glutamicum. Produkce glutamové kyseliny byla v uplynulých letech prokázána u mnoha kmenů vzájemně podobných. Užitečným nástrojem využitým pro klasifikaci a identifikaci těchto grampozitivních bakterií je přítomnost meso-diaminopimelové kyseliny v buněčné stěně. Koryneformní bakterie ve své buněčné stěně dále obsahují arabinosu, galaktosu a mykolové kyseliny mající uhlíkatý řetězec tvořený 22 36 atomy uhlíku a přímé řetězce nasycených nebo nenasycených mastných kyselin. Název rodu Corynebacterium je odvozen od řeckého slova koryne znamenajícího v překladu palička a vypovídá o tvaru těchto bakterií. Jedná se o tyčinky přímé nebo mírně zakřivené, nestejného průměru a nepravidelné morfologie, často spojené po dvou do písmena V. Toto uspořádání je výsledkem nedokončeného buněčného dělení, kdy se dvě dceřiné buňky od sebe zcela neoddělí, ale zůstanou spojené v krátkém úseku prostřednictvím části vnější vrstvy buněčné stěny. Koryneformní bakterie jsou chemoorganotrofní, aerobní nebo fakultativně anaerobní, podle teplotního pásma růstu patří mezi mesofily. Mnoho zástupců tohoto rodu patří mezi významné lidské i zvířecí parazity a pathogeny (např. původce záškrtu C. diphteriae). Všechny koryneformní bakterie syntetizující glutamovou kyselinu vyžadují pro růst přítomnost biotinu, některé zároveň i thiaminu vzhledem k tomu, že postrádají ve svém enzymovém vybavení přítomnost některých enzymů podílejících se na jejich syntéze. Přítomnost biotinu je nezbytná pro aktivitu enzymu acetyl-coa-karboxylasy, potřebného pro biosyntézu mastných kyselin. Nízká hladina biotinu v kultivačním prostředí má za následek omezení syntézy mastných kyselin a tudíž vytvoření defektních buněčných obalů. Bakterie syntetizující glutamovou kyselinu jsou velmi citlivé k řadě antibiotik, k penicilinu, tetracyklinu, chloramfenikolu, streptomycinu a dalším. Pokud kultivace bakterií probíhá v přítomnosti dostatečného množství biotinu, k extracelulární produkci glutamové kyseliny dojde pouze v případě, je-li v rané exponenciální fázi přidána subletální koncentrace penicilinu, případně vhodného detergentu. Je-li takový inhibitor aplikován až v pozdně exponenciální nebo dokonce až ve stacionární fázi růstu, nedojde k extracelulární produkci glutamové kyseliny ani při značně vysoké koncentraci inhibitoru. Tato skutečnost dokumentuje výraznou rigiditu buněčné stěny. Buňky obtížně lyzují, ať už působením lysozymu, nebo ultrazvuku. Úspěšná produkce glutamové kyseliny stimulovala zájem o nalezení vhodných kmenů, které by produkovaly další aminokyseliny. U kmenů koryneformních bakterií izolovaných z přirozeného prostředí byla prokázána extracelulární produkce následujících aminokyselin: valinu, prolinu, alaninu a glutaminu. Producenti dalších aminokyselin byli získáni na základě změn v buněčném metabolismu a jeho regulaci, případně metodami genových manipulací. 8
Enzymové vybavení koryneformních bakterií Mezi dobře utilizovatelné substráty patří glukosa, fruktosa, sacharosa, maltosa a ribosa. Částečně je utilizována manosa, galaktosa a sorbosa. Ostatní sacharidy využívány nejsou. Sacharidy jsou katabolizovány enzymy Embden-Meyerhof-Parnasovy (EMP) dráhy na pyruvát, který po transformaci na acetyl-coa vstupuje do Krebsova cyklu. Tato skupina prokaryot disponuje rovněž enzymy pentosofosfátového cyklu. Glutamát je tvořen z α-ketoglutarátu enzymem glutamátdehydrogenasa. Glutamová kyselina je intracelulární produkt a její vysoká hladina na principu zpětnovazebné regulace inhibuje další biosyntézu. K tomu, aby došlo ke zvýšené produkci je zapotřebí vytvořit vhodné kultivační podmínky, které zajistí uvolňování této kyseliny do vnějšího prostředí. Bakterie mléčné, octové a propionové Bakterie, které syntetizují mléčnou, octovou a propionovou kyselinu jako konečný metabolický produkt jsou z hlediska své morfologie i fyziologie značně odlišné. Vzhledem k některým společným rysům jejich metabolismu, pro které jsou využívány v biotechnologiích, je však o nich pojednáno ve společné kapitole. Základní charakteristika Mléčné bakterie jsou zařazeny především do rodů Lactococcus a Leuconostoc z čeledi Streptococcaceae a Lactobacillus z čeledi Lactobacillaceae. Zástupci rodu Lactococcus jsou grampozitivní, chemoorganotrofní, fakultativně anaerobní, metabolismus je fermentativní, příp. realizují určitý typ respirace. R. Leuconostoc je představován bakteriemi, které jsou grampozitivní, chemoorganotrofní, fakultativně anaerobní, metabolismus je fermentativní a v některých případech aerobně respirační. Rod Lactobacillus je rovněž grampozitivní, chemoorganotrofní, fakultativně nebo obligátně anaerobní, metabolismus je fermentační. Všechny mléčné bakterie jsou velmi náročné na kultivační podmínky. Octové bakterie jsou zahrnuty v rodech Acetobacter a Gluconobacter. Zástupci obou rodů jsou gramnegativní, chemoorganotrofní, obligátně aerobní s metabolismem aerobně respiračním. Propionové bakterie (r. Propionibacterium) jsou grampozitivní, chemoorganotrofní, obligátně nebo fakultativně anaerobní, někteří zástupci jsou aerotolerantní, metabolismus je fermentativní, v některých případech aerobně respirační. Biotechnologické aplikace Bakterie mléčného kvašení se tradičně dělí na homofermentativní a heterofermentativní (Kluyver, 1931). Homofermentativní mléčné kvašení je realizováno zástupci rodu Lactococcus a většinou druhů r. Lactobacillus. Glukosa je katabolizována EMP drahou na pyruvát, ten je prostřednictvím enzymu NAD + -laktátdehydrogenasa transformován na laktát. Heterofermentativní mléčné bakterie jsou zastoupeny v r. Leuconostoc a částečně v r. Lactobacillus. Glukosa (případně některé pentosy) jsou katabolizovány enzymy pentosofosfátové dráhy a je vytvářeno přibližně ekvimolární množství laktátu, etanolu a CO 2. Octové bakterie nemají ve svém enzymovém vybavení enzymy EMP ani E-D dráhy. Glukosu (ale i pentosy) mohou štěpit modifikovaným pentosofosfátovým cyklem na acetylfosfát a erythroso-4-fosfát. Rod Gluconobacter nedisponuje plně funkčním 9
Krebsovým cyklem, a proto vytváří z acetylfosfátu výhradně acetát a ATP. Rod Acetobacter za přístupu dostatečného množství kyslíku vytvořený acetylfosfát plně odbourá na CO 2 a ATP. Nemá-li však k dispozici kyslík, pak se i jeho metabolismus zastavuje u acetátu jako konečného produktu. Erytroso-4-fosfát je metabolizován cyklicky za vzniku 2 molekul acetátu. Za omezeného přístupu vzduchu probíhá tedy metabolismus u rodů Acetobacter i Gluconobacter shodně. Produkty této neúplné oxidace jsou hromaděny v mediu. Metabolická výbava těchto bakterií dále umožňuje oxidaci etanolu na acetát a podobně i další primární alkoholy jsou oxidovány na odpovídající karboxylové kyseliny. Sekundární alkoholy jsou oxidovány na ketony. Propionové bakterie při fermentaci glukosy, glycerolu a laktátu poskytují jako hlavní produkty propionát, acetát a CO 2. Tvorba propionové kyseliny probíhá ve dvou větvích, jedna je lineární a druhá cyklická. Katabolizovaný substrát je nejprve přeměněn na pyruvát. V přímé metabolické větvi propionového kvašení je jedna molekula pyruvátu oxidována za vzniku acetyl-coa. Konečnými produkty této části jsou acetát, CO 2, ATP a NADH. Druhá metabolická větev zpracovává dvě molekuly pyruvátu a je cyklická. Methylmalonyl-CoA reaguje s pyruvátem za vzniku propionyl-coa a oxalacetátu. Z první sloučeniny vzniká odštěpením CoA třetí konečný produkt, propionová kyselina, zatímco z oxalacetátu je regenerován methylmalonyl-coa za uvolnění ATP. Propionové bakterie jsou součástí sýrařských kultur používaných při výrobě sýrů ementálského typu. Methanogeneze Přeměna organických substrátů na methan je anaerobní proces, který probíhá za účasti směsného mikrobního společenství. Vhodnými substráty pro methanogenezi jsou přírodní polymery celulosa, škrob, hemicelulosy a proteiny. Má-li dojít k rozkladu těchto substrátů, potom část populace označovaná jako nemethanogenní (viz anaerobní sporulující bakterie), rozkládá polymery na jednoduché látky, které slouží jako substráty pro methanogenezi. Přirozeným prostředím, v němž dochází k úplné biokonverzi substrátu na methan, jsou bažiny, močály, kaly a hydrotermální prameny, tedy obecně anaerobní rozkladné systémy. K částečnému rozkladu biopolymerů na těkavé mastné kyseliny s krátkým řetězcem, methan a oxid uhličitý dochází v zažívacím traktu některých živočichů (hospodářská zvířata, termiti). Methanogeni jsou striktně anaerobní, jednobuněčné organismy, původně řazené do domény bakterií. Po zavedení nové fylogenetické domény Archaea v r. 1990 byla celá skupina methanogenů do této unikátní domény přeřazena. Methanogeni jsou charakterizováni výraznými vzájemnými morfologickými rozdíly, rozdíly v nutričních požadavcích i rozdíly v ekosystémech, které osídlují. Na rozdíl od této diverzity představují fyziologicky jednotnou skupinu. Methanogenní reakce probíhají podle následujících rovnic (uvedené substráty jsou jedinými substráty, které mohou být pro tvorbu methanu využity) : 4 H 2 + CO 2 CH 4 + 2 H 2 O 4 HCOOH CH 4 + 3 CO 2 + 2 H 2 O 4 CH 3 OH 3 CH 4 + CO 2 + 2 H 2 O 4 CH 3 NH 2 Cl + 2 H 2 O 3 CH 4 + CO 2 + 4 NH 4 Cl 2 (CH 3 ) 2 NHCl + 2 H 2 O 3 CH 4 + CO 2 + 2 NH 4 Cl 4 (CH 3 ) 3 NCl + 6 H 2 O 9 CH 4 + 3 CO 2 + 4 NH 4 Cl CH 3 COOH CH 4 + CO 2 (CH 3 ) 2 S + H 2 O 1,5 CH 4 + 0,5 CO 2 + H 2 S 10
Produkce methanu z kteréhokoliv uvedeného substrátu je doprovázena uvolňováním energie pro růst methanogenů. Podle způsobu výživy lze methanogenní zástupce dělit na autotrofní (využívající CO 2 nejen jako zdroj energie při methanogenezi, ale i jako jediný zdroj uhlíku pro růst nicméně použití termínu autotrofní je v tomto případě sporné, vzhledem k tomu, že CO 2 není fixován Calvinovým cyklem) a heterotrofní (vyžadující přítomnost jiných C-zdrojů). Methanogeneze je jediným způsobem, jak tato skupina mikroorganismů získává energii. Příslušné mikroorganismy produkují CH 4 jako jediný produkt svého katabolismu. Jednou z nejlépe prostudovaných drah je redukce CO 2 prostřednictvím H 2. Pro tuto redukci je zapotřebí osmi elektronů. Již první studie zaměřené na biochemii tvorby CH 4 prokázaly, že volné jednouhlíkaté látky předpokládané intermediáty redukce tedy kyselina mravenčí, formaldehyd a metanol, nejsou během redukce detekovatelné. Vzhledem k tomu byl již před řadou let vysloven předpoklad, že reakční dráha začíná vazbou CO 2 na molekulu nosiče, kofaktoru a všechny následující reakce pak probíhají za vzniku intermediátů navázaných na příslušnou molekulu. Poslední krok pak spočívá v uvolnění nosiče a CH 4. Roli nosičů nejčastěji zastávají methanofuran (MFR), tetrahydromethanopterin (H 4 MPT) a koenzym M (CoM-SH). CoM-SH je unikátní pro methanogenezi, MFR a H 4 MPT se vyskytují i u jiných nemethanogenních archaeí. Enzymy, podílející se na methanogenezi jsou často nejen rodově, ale i druhově závislé a proto popis jednotlivých reakčních kroků je vázán vždy na zcela konkrétní druh. Methanogeni získávají energii ve formě ATP na cytoplasmatické membráně v důsledku činnosti systému transportujícího elektrony. Klíčový je enzym heterodisulfidreduktasa, který redukuje Co-M-S-S-Co-B na HS-CoM a HS-CoB a poté se tyto koenzymy vrací zpět do methanogeneze. Vytvořený gradient proronů slouží ke tvorbě ATP. Velmi významným substrátem pro methanogenezi je acetát. Přibližně 2/3 methanu získaného v anaerobních reaktorech je výsledkem methanogeneze z acetátu. Využít acetát jako výhradní zdroj uhlíku a energie dokážou pouze dva rody: Methanosarcina a Methanothrix. Degradace acetátu acetoklastickými methanogeny v přírodě je přínosná, neboť zabraňuje nežádoucí acidifikaci prostředí. Obligátní methanogeni nevyužívají pro asimilaci CO 2 Calvinův cyklus, ani redukční větev TCA cyklu. Klíčový metabolit, acetyl-coa, je získáván složitou kondenzací dvou jednouhlíkatých látek odvozených od CO 2. Enzymy, které jsou v této metabolické dráze zapojeny, jsou unikátní a jsou předmětem řady studií. Takto vytvořený acetyl-coa je následně přeměněn na prekursorové metabolity prostřednictvím metabolických drah, většinou známých z metabolismu heterotrofů. Biologickou cestou je každoročně produkováno přibližně 10 9 tun methanu. 75 % celkového množství vzniká v močálech, bažinách a vulkanickém ekosystému, 25 % pak v zažívacím traktu živočichů. Zájem o úplné biokonverze přírodních biopolymerů je motivován snahou snížit objem čistírenských kalů a získat energii následným spalováním methanu. Methanogeneze představuje rovněž závažný ekologický problém. Methan absorbuje infračervené záření a patří mezi plyny vyvolávající skleníkový efekt. Koncentrace methanu v atmosféře se v posledních letech zvyšuje a tím se i tento plyn podílí na globálním oteplování Země. Methylotrofní mikroorganismy Pod pojmem methylotrofní růst máme na mysli aerobní růst neautotrofních mikroorganismů na redukovaných uhlíkatých látkách postrádajících vazby C-C. Mezi nejdůležitější substráty methylotrofů patří methan, metanol, methylaminy, mravenčí kyselina, formaldehyd, formamid, dimethyléter, dimethylkarbonát, dimethylsulfoxid a dimethylsulfid. Methylotrofy můžeme dělit 11
na obligátně a fakultativně methylotrofní. Obligátní methylotrofové využívají výše uvedené substráty jako výhradní zdroj uhlíku a energie, zatímco fakultativní methylotrofové jsou schopné růst na řadě jiných látek. Vzhledem k tomu, že příslušné substráty jsou v přírodě bohatě zastoupeny (voda, půda, povrchy rostli a živočichů), není překvapující, že methylotrofie představuje častý typ fyziologie jednobuněčných organismů, a to jak z domény bakterií, tak z domény eukaryot (kvasinky). Methylotrofové představují významný oxidační článek jak v souvislosti s přeměnou redukovaných C 1 látek na CO 2, tak v dusíkovém cyklu často oxidují amonné ionty na dusitany a dusičnany. Anabolismus methylotrofů Obligátní methylotrofové syntetizují veškerý buněčný materiál z výše uvedených substrátů a jejich anabolické dráhy jsou v zásadě dvojího typu: 1. Serinová dráha popsána již v 60. letech na základě zjištění, že řada mikroorganismů je vybavena vysokou hladinou enzymů podílejících se na biosyntéze serinu. Vstupním substrátem této dráhy je formaldehyd, kosubstrátem malé množství oxidu uhličitého. Pokud má být do této dráhy zapojen jiný substrát, musí být nejdříve přeměněn na formaldehyd. Průběh dráhy lze sumarizovat: HCHO + CO 2 CH 3 COOH... serin Do této skupiny patří někteří zástupci rodů Bacillus, Corynebacterium, Arthrobacter, Pseudomonas, Achromobacter. 2. Ribulosomonofosfátová dráha enzymy této dráhy jsou přítomné jak u bakterií (r. Methylobacterium, Methylomonas), tak v pozměněné formě u kvasinek (Candida boidinii, Pichia cellobiosa, Hansenula capsulata). Výsledkem dráhy je kondenzace tří molekul formaldehydu na jednu molekulu triosafosfátu, intermediátu syntézy komponent buněčné hmoty. Nejčastější varianta: 3 HCHO dihydroxyacetonfosfát Původně se předpokládalo, že mikroorganismy disponují pouze jedním z uvedených mechanismů. Existují však důkazy potvrzující, že jeden a týž mikroorganismus může být vybaven enzymy obou drah s tím, že jedna dráha je konstitutivní a druhá indukovatelná konkrétními růstovými podmínkami. Katabolismus methylotrofů Oxidace substrátů probíhá u většiny methylotrofů prostřednictvím dvouelektronových oxidačních kroků: CH 4 CH 3 OH HCHO HCOOH CO 2 Jednotlivé kroky jsou dostatečně exergonické, což teoreticky umožňuje vznik ATP. Katabolická oxidační dráha může být buď přímá, jak je výše uvedeno, nebo cyklická. Cyklická oxidační dráha bývá též nazývána disimilační ribulosomonofosfátovou drahou. První enzymy této dráhy jsou společné s ribulosomonofosfátovou anabolickou (asimilační) drahou. Vzhledem k tomu je logické, že enzymy cyklické dráhy disponují druhy vybavené též enzymy anabolické ribulosomonofosfátové dráhy. Některé druhy jsou schopné realizovat přímou i cyklickou oxidaci. Jak přímá, tak cyklická oxidační dráha poskytují dvě molekuly redukovaných pyridinových nukleotidů a jednu molekulu oxidu uhličitého na jednu molekulu formaldehydu. Schéma elektrontransportního řetězce u methylotrofů je dobře známé, v řadě případů je nejen rodově, ale i 12
druhově závislé. Spojení mezi transportem elektronů a produkcí ATP je ztrátové, reálný zisk ATP není v souladu s odpovídající vytvořenou potenciální energií. Využití methylotrofů v biotechnologiích Metanol (případně methan) představoval zejména v uplynulých desetiletích atraktivní substrát pro kultivaci methylotrofních kvasinek. Takto vytvořená biomasa byla využívána buď přímo, nebo jako zdroj řady metabolitů. V poslední době se v souvislosti s využitím methylotrofů objevily další možnosti. Jedná se o jednostupňové konverze (CO CO 2, CH 4 CH 3 OH ), jejichž výhodou je možnost realizace procesu při nízkých reakčních teplotách. Velmi perspektivní je využití methylotrofní kvasinky Pichia pastoris pro produkci rekombinantních proteinů. Vlastnosti Pichia pastoris využitelné pro tuto aplikaci: Jednoduchý expresní systém (ve srovnání se složitějšími eukaryoty). Snadná genová manipulace. Nízká náročnost na složení kultivačních medií (levná kultivace velké objemy). Dosažení vysokých hodnot buněčné density. Ve srovnání se S. cerevisiae 10 100x vyšší výtěžky biomasy. Ideální pro produkci transgenního proteinu ve velkých objemech. Neprodukuje toxiny, pyrogenní látky. Možnost produkce nativních proteinů přítomných u vyšších eukaryot (správná posttranslační modifikace glykosylace, folding). Pichia pastoris přirozeně sekretuje daleko méně vlastních proteinů ve srovnání se S. cerevisiae jednodušší izolace rekombinantního proteinu. Dokáže využít jako výhradní zdroj uhlíku a energie glycerol, metanol, glukosu, sorbitol, etanol, acetát. Pichia pastoris oxiduje metanol na formaldehyd (dva geny pro alkoholdehydrogenasu AOX1 AOX2) za přítomností kyslíku, proces probíhá v peroxizomech. Kvasinková AOX je exprimována ve velkém množství (5% veškeré mrna). Toho využívá heterologní expresní systém, kdy je transgen vložen pod AOX promotor. Fyziologické vlastnosti a biotechnologické využití rodu Zymomonas Bakterie rodu Zymomonas jsou v mnoha směrech vyjímečné. V tropických oblastech se po staletí využívá jejich kvasných schopností pro přípravu přirozeně kvašených alkoholických nápojů (např. pulque). V literatuře se informace o r. Zymomonas objevují již od roku 1912, ovšem zájem o jejich průmyslové využití vzrostl až v posledních desetiletích, a to na základě zjištění, že produkují etanol v množství srovnatelném s kvašením kvasinek. Rod Zymomonas je representován gramnegativními tyčinkami často opatřenými 1 4 lofotrichálně umístěnými bičíky. Nevytváří spory, neukládá žádný reservní materiál. Z fyziologického hlediska je rod chemoheterotrofní, fakultativně anaerobní nebo mikroaerotolerantní. R. Zymomonas byl vytvořen reklasifikací některých zástupců jiných rodů na základě unikátní metabolické schopnosti využívat pro kvašení Entner-Doudoroffovu dráhu i v anaerobním režimu. Na základě technik zavedených v molekulární biologii byl v 70. letech ze všech testovaných isolátů (40) vytvořen jediný representativní zástupce, jediný druh se dvěma subspeciemi, a to Z. mobilis subsp. mobilis (používaný pro průmyslovou produkci etanolu) a Z. mobilis subsp. pomaceae (původce kažení moštů a piva, kontaminant). Spektrum substrátů, které je tento druh schopen využívat, je omezeno na glukosu, fruktosu (konstitutivními enzymy) a sacharosu (pouze u některých kmenů, enzymy jsou induktivní povahy). Ostatní substráty 13
využívány nejsou. Dobrého nárůstu je dosaženo na chemicky definovaném médiu obsahujícím některé růstové faktory (pantothenát vápenatý, thiamin, pyridoxin, biotin, nikotinová kyselina). Použití melasy jako substrátu se neosvědčilo vzhledem k přítomnosti některých inhibičních faktorů, inhibiční efekt je vyvolán i vysokými koncentracemi iontů hořčíku a draslíku. Rozmezí tolerovaných hodnot ph je široké (ph 3,5 7) s optimem při neutrální hodnotě ph. Rod Zymomonas je značně rezistentní vůči běžně používaným antibiotikům (peniciliny, streptomycin, bacitracin), výjimku tvoří chloramfenikol a tetracykliny. Vykazuje rovněž výrazný antagonický efekt vůči řadě bakterií, což bylo zpočátku vysvětlováno vlastní produkcí antibiotik, která ovšem nebyla prokázána. Toto působení zřejmě souvisí s extracelulární produkcí proteinů kódovaných plasmidy. Účinným rozlišením obou zmíněných subspecií je maximální růstová teplota. Zatímco Z. mobilis subsp. pomaceae neroste při teplotě vyšší než 34 C, Z. mobilis subsp. mobilis většinou při této teplotě vykazuje jak dobrý nárůst, tak dobrou produkci etanolu. Rod Zymomonas je vysoce osmotolerantní, tato vlastnost je ovšem rovněž odlišná pro zmíněné subsp. Obecně platí, že Z. mobilis subsp. mobilis roste při vyšších koncentracích cukru (až do 40 %) než Z. mobilis subsp. pomaceae. Vysoká koncentrace cukru však výrazně snižuje růstovou rychlost. Pro optimální produkci etanolu je uváděna optimální koncentrace glukosy nebo sacharosy do 20 %. Vzhledem k tomu, že r. Zymomonas je isolován z kvasících moštů, je jeho tolerance vůči etanolu vysoká (až do 16 % obj.). Vysoká koncentrace cukru nebo etanolu způsobuje změnu v poměru mastných kyselin (větší podíl C 18 : 1, nižší podíl C 16 : 1). V cytoplasmatické membráně těchto bakterií byla dále zjištěna vyšší hladina kys. vakcenové (C 18 : 1 11) ve srovnání s ostatními gramnegativními bakteriemi. Vysoká koncentrace etanolu pozměňuje také kvalitativní složení membránových fosfolipidů a poměr lipidů vůči proteinům. Enzymové vybavení této bakterie je v mnoha ohledech výjimečné. V prvé řadě je to již výše zmíněná schopnost využít pouze tři substráty, glukosu, fruktosu a sacharosu. Růst na sacharose je podmíněn přítomností invertasy a levansacharasy. Mnoho kmenů rostoucích na sacharose produkuje extracelulární polysacharid, levan (polymer na bázi fruktosových jednotek spojených β-(2 6) vazbami). K syntéze levanu dochází při růstu na sacharose, nikoliv na samotné fruktose. Biosyntéza levanu je kódována plasmidy. Levan je žádaným polymerem ve farmacii a potravinářském průmyslu. Bakteriální rod Zymomonas se do určité míry svými vlastnostmi podobá kvasinkám S. cerevisiae, k produkci etanolu však nepoužívá enzymy glykolýzy, ale Entner-Doudoroffovy dráhy. Rod Zymomonas je jediným dosud známým rodem mikroorganismů, který dokáže tuto dráhu provozovat i za anaerobních podmínek. Hlavními produkty v případě anaerobiozy jsou etanol a oxid uhličitý, energetický zisk je pouze 1 ATP na 1 mol zkvašené glukosy. V případě aerobiozy je produkováno větší množství vedlejších produktů. Vysoká koncentrace etanolu nevyvolává denaturaci enzymů, ale vyvolává nekompetitivní inhibici. V současné době zájem o technologické využití této bakterie stoupá a metodami genových manipulací jsou připravovány nové kmeny s výhodnějšími vlastnostmi pro konkrétní aplikace. Příprava kmenů schopných utilizovat xylózu a arabinózu (hydrolyzáty dřeva) je velmi atraktivní. Aktinomycety jejich využití v biotechnologiích Řád Actinomycetales je tvořen osmi čeleděmi, ve kterých jsou zahrnuty bakterie se schopností tvořit vlákna a někdy i mycelium. Vlákna mohou být velmi krátká a pozorovatelná jen za určitých kultivačních podmínek nebo dokonale vyvinutá, která ve vytvořeném vzdušném a substrátovém myceliu diferencují ve spory. Spory se mohou tvořit buď jednotlivě na koncích hyf, po dvojicích nebo v řetízcích. Aktinomycety jsou především grampozitivní bakterie, 14
chemoorganotrofní, saprofytické nebo parazitické. Pokud jde o nároky na kyslík, patří sem aerobní, fakultativně anaerobní i anaerobní druhy. V přírodě jsou aktinomycety široce zastoupeny, zejména v půdním prostředí, odtud se rozšiřují do ostatních ekosystémů, a to převážně prostřednictvím spor. Tvoří skupinu mikroorganismů s mimořádným průmyslovým významem a to jak vzhledem ke svému biosyntetickému, tak vzhledem k biodegradačnímu potenciálu. V současné době se nejčastěji využívá vlastností následujících rodů: Rod Streptomyces v přírodě velmi rozšířený, druhové zastoupení je dáno typem přítomného organického substrátu a obsahem vody. Streptomycety jsou častou součástí přírodních mikrobních společenství kolonizujících a degradujících organický materiál, což je dáno širokým spektrem využívaných zdrojů uhlíku. Utilizovány jsou i některé vysokomolekulární polymery, (např. chitin, škrob, pektin, některé hemicelulosy a lignin). Streptomycety jsou obligátně aerobní, proto dávají přednost půdám provzdušněným před těžkým a silně promáčeným prostředím. Ve velmi suchých půdách se vyskytují v menším měřítku. Ve vhodném prostředí dosahují až 98 % celkové mikrobní populace. Z hlediska požadavků na ph lze streptomycety rozdělit na acidofilní (rostoucí v rozmezí ph 3,5 6,5), neutrofilní (ph 5,0 9,0) i alkalifilní, osídlující lokality s hodnotou ph vyšší než ph 9,0. Většina streptomycet je mesofilní, malá část je termofilní. V základním metabolickém vybavení jsou obsaženy enzymy glykolysy, E-D dráhy a Krebsova cyklu. Buněčná struktura streptomycet odpovídá prokaryotům grampozitivního typu, je vytvářeno mycelium, jehož vzdušné hyfy diferencují v řetízky spor. Streptomycety jsou vynikajícími producenty antibiotik, v literatuře je uváděno více než 600 odlišných strukturních typů. Mezi nejdéle používaná antibiotika patří aminoglykosid streptomycin, který byl prvním antibiotikem, které se dalo použít pro léčbu tuberkulózy. Streptomycety produkují rovněž enzymy degradující polymery (amylasy, dextranasy, xylanasy, pektinasy, proteasy, lipasy). V poslední době stoupá význam biodegradačních a biotransformačních schopností aktinomycet. Rody Streptoverticillium, Actinoplanes, Actinomadura, Micromonospora - rovněž přítomné v půdním prostředí, produkují přibližně 200 odlišných typů antibiotik. Disponují také širokým biodegradačním potenciálem nacházejícím bohaté uplatnění v přirozeném i kontaminovaném půdním prostředí. Rody Rhodococcus, Nocardia přitahují pozornost jak z hlediska své atypické buněčné stavby, tak vzhledem ke svému enzymovému vybavení. Patří mezi půdní prokaryota charakterizovaná rychlým nárůstem, snadnou manipulací, produkcí antibiotik a velmi širokým biodegradačním potenciálem. Vymezujícím kriteriem těchto rodů je lipofilní charakter buněčných obalů. Peptidoglykan, dominantní konstrukční prvek buněčné stěny bakterií, je v tomto případě zajímavý tím, že N-acetylmuramová kyselina je často nahrazena N-glykolylmuramovou kyselinou. Mykolové kyseliny s délkou základního uhlíkatého řetězce 30 54 atomů uhlíku (r. Rhodococcus) jsou přítomné ve dvou stavebních formách, jednak kovalentně vázané na matrici peptidoglykanu a jednak ve formě lehce extrahovatelných volných lipidů. Délka řetězce mykolových kyselin určuje hydrofobitu buněčného obalu, se vzrůstající délkou stoupá. Na stavbě buněčné stěny se dále podílejí lipoglykany (nejčastěji lipomanany a lipoarabany), proteiny, lipoproteiny (vytvářející poriny) a polární lipidy (fosfolipidy, glykolipidy). Zástupci těchto rodů jsou schopní utilizovat velké množství jak hydrofilních, tak díky lipofilitě buněčných obalů i hydrofobních uhlíkatých substrátů. Druhým faktorem podmiňujícím utilizaci hydrofobních substrátů je produkce extracelulárních povrchově aktivních látek 15
(biosurfaktantů). Jedná se především o estery trehalosy (hydrofobní část tvoří mastné kyseliny C 12 C 18, hydrofilní částí je trehalosa), které mají neionogenní charakter a tudíž neinterferují s buněčnými obaly. Spektrum využívaných zdrojů dusíku je rovněž široké a zahrnuje i xenobiotika. Degradace organických látek probíhá po jejich oxidaci. Využití zástupců zmíněných rodů nespočívá pouze v bioremedičních technologiích. Další aplikace souvisejí se schopností akumulace těžkých kovů včetně radioaktivních, s produkcí pigmentů pro potravinářský průmysl a s možnostmi realizovat specifické biotransformace (syntéza farmak, stereoisomerů aminokyselin, akrylamidu). Některých enzymových aktivit může být využito při konstrukci biosensorů (heroinesterasa detekce heroinu, fenylalaninhydrogenasa detekce fenylketonurie). Vlastnosti a biotechnologické využití rodů Agrobacterium, Deinococcus a Thermus Rod Agrobacterium uměle vytvořený rod (r. 1907) zahrnující klastr rostlinných patogenů. Na základě komparativní analysy 16S rrna byl tento rod podobně jako rod Allorhizobium začleněn do rodu Rhizobium (r. 2001), ovšem tato reklasifikace se příliš neujala, takže se v literatuře stále setkáváme s původním taxonomickým označením. Hlavní zástupci: Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium tumefaciens = Rhizobium radiobacter Agrobacterium larrymoorei = Rhizobium larrymoorei Agrobacterium rhizogenes = Rhizobium rhizogenes Agrobacterium rubi = Rhizobium rubi Agrobacterium vitis = Rhizobium vitis Rod Agrobacterium je representován půdními, gramnegativními, nesporulujícími, pohyblivými, tyčinkovitými bakteriemi, patogenními vůči dvouděložným rostlinám. Genom zpravidla obsahuje cirkulární chromozóm, 2 plazmidy a lineární chromozóm. Rod Agrobacterium disponuje jedinečnou schopností přenosu genů (z Ti a Ri plasmidů) do rostlin (velikost ~200 kbp DNA) a způsobují tak tvorbu krčkových nádorů (crown galls, Ti plasmid) a vláskových kořenů (hairy roots, Ri plasmid). Pro dvouděložné rostliny je charakteristické, že v případě poranění jejich podzemních částí produkují řadu fenolových látek, které jsou uvolňovány do půdy (např. kyselina 4-hydroxybenzoová, ferulová, sinapová, lysergová, galová, katechol, vanilin, pyrogalol, syringon a acetosyringon). Přítomnost fenolových látek v půdě je příčinou pozitivní chemotaxe a aktivace genů virulence, které jsou neseny plazmidy Ti u Agrobacterium tumefaciens a Ri A.rhizogenes. Po rozpoznání chemotaktického signálu dojde v první fázi ke slabému (reverzibilnímu) zachycení bakterie pomocí vytvořených celulosových nebo glykanových vláken (kotva) v místě poranění rostliny. Těmito vlákny se bakterie poutají i vzájemně (mikrokolonie). Dále dojde k syntéze receptorových proteinů, které jsou součástí vnější membrány bakterie a které pomáhají při zachycení ( probodnutí ) rostlinné buňky. Receptorové proteiny jsou kódovány geny virulentní oblasti plazmidu. Následně dochází k aktivaci dalších genů souvisejících s virulencí. Tyto geny kódují například endonukleázy, které způsobují vznik jednořetězcových zlomů na specifických místech Ti plazmidu. Dojde k uvolnění úseku ssdna (jednovláknová DNA) z Ti plazmidu, který bude následně transportován do jádra hostitelské rostliny. Tento přenášený úsek plazmidu je označován jako T-DNA. Další proteiny kódované oblastí virulence se navazují na T-DNA (tvoří komplex) a zajišťují její transport z bakteriální buňky a integraci do chromozómu hostitelské 16
rostliny. T-DNA se začleňuje do náhodného místa genomu rostliny. T-DNA obsahuje geny kódující enzymy pro produkci opinů, které nemohou být využity rostlinami, ale slouží jako růstový a energetický substrát bakterie a geny (onc geny) pro produkci rostlinných hormónů, podporujících buněčné dělení a tvorbu nádorů tvořených nediferenciovanými buňkami, které jsou nazvány crown galls. K expresi těchto genů dochází v rostlině. Ri plasmid rovněž nese onc geny a geny pro tvorbu opinů. Onc geny vyvolají produkci auxinů vyvolávajících nadprodukci kořenových tkání symptomů onemocnění - tvorby vláskových kořenů. Využití v biotechnologiích Geneticky modifikované kmeny A. tumefaciens fungují jako trojský kůň a pašují námi podvržené geny do genomu rostlin a vytvářejí tak transgenní rostliny. Do stávajícího rostlinného genomu jsou vnášeny geny pro rezistenci k herbicidům, hmyzím škůdcům, vůči plísním, bakteriálním a virovým chorobám, geny pro lepší technologické vlastnosti (konzistence, trvanlivost produktu a další). Příprava vektorů spočívá v úpravě sekvence T-DNA, v odstranění genů pro fytohormony a opiny a nahrazení cizorodou DNA transgenem. Nevýhoda této transformace je, žeti plasmid je velký (200kb) a manipulace je obtížná. Řešení představuje využití binárních vektorů. Rod Deinococcus Hlavní zástupci: D. radiodurans, D. proteolyticus, D. radiopugnans, D. radiophilus, D. grandis, D. indicus, D. frigens, D. saxicola, D. marmola, D. geothermalis a D. murrayi D. radiodurans (pův. Micrococcus) byl objeven v r. 1956 A. W. Andersonem (Oregon). Potravináři testovali využití gama paprsků pro sterilaci plátků masa. Dávky byly voleny tak, aby gama paprsky zabily vše živé. Nicméně maso se záhy zkazilo. Následně byl isolován D. radiodurans ( úděsná bobule přežívající radiaci ). D. radiodurans je polyextrémofil, radioresistentní, odolný vůči vakuu, dehydrataci, chladu a kyselému prostředí. Z morfologického hlediska se jedná o netypické grampozitivní bakterie; atypická stavba buněčných obalů potvrzuje pradávnou vývojovou linii. V peptidoglykanu je zastoupen ornithin místo diaminopimelové kyseliny, teichoové kyseliny nejsou přítomny. Buněčné obaly zahrnují vnější membránu, v níž nejsou obsaženy lipidy (jinak vždy přítomné ve vnější membráně gramnegativních bakterií). V cytoplasmatické membráně je obsažena kyselina palmitoolejová místo fosfatidylglycerolu. D. radiodurans je bakterie růžově nebo červeně zbarvená v důsledku přítomnosti karotenoidů. Vytváří tyčinky, koky, páry nebo tetrády, je nepohyblivá, aerobní, mesofilní (psychrofilní), heterotrofní, nesporulující. Místem výskytu je vzduch, voda, půda, potraviny (i sterilované), extrémní prostředí Antarktida (suché horniny), chirurgické nástroje, domácí prach. D. radiodurans vyniká mimořádnou odolností k ionizujícímu, např. rentgenovému záření i k chemickým mutagenům. Tato bakterie disponuje atypickým uspořádáním genetického materiálu. Je vybavena dvěma cirkulárními chromozómy (od každého často 4 10 kopií) a dvěma odlišnými plasmidy (megaplasmid a malý plasmid). Struktura buněk je unikátní, vnitrobuněčné prostředí je členěno na dva až čtyři oddíly neúplně oddělené přepážkami cytoplasmatické membrány. Každý oddíl má své vlastní chromozómy (i větší počet kopií), které obsahují mnoho opakujících se sekvencí. Ze snímků z elektronového mikroskopu vyplývá, že v rozptýlené podobě (tedy biologicky aktivní ) je DNA přítomna jen v jednom, nebo ve dvou oddílech, které zřejmě zajišťují životní funkce celé buňky a ve zbývajících dvou oddílech je DNA naopak silně kondenzována do zvláštní prstencové struktury. V těchto oddílech jsou tedy chromozómy velmi kompaktní a slouží pravděpodobně jako genetická banka. 17
V případě ozáření se v prstencové (kondenzované) struktuře DNA obě vlákna sice zlámou a vzniknou stovky oddělených fragmentů (při dávce 5000 Gy se vytvoří několik set zlomů DNA), nicméně nedojde k jejich vzájemnému posunu. Tyto fragmenty pak mohou být reparačními mechanismy spojeny v původním pořadí, aniž vznikne větší počet mutací. Tato fáze trvá asi hodinu. V další fázi se prstence DNA zvolna rozvolňují do podoby písmene S, přesouvají se k otvorům spojujícím sousední oddíly a nakonec splynou dva chromozómy z těchto oddílů v jeden. Následně působí další opravné mechanismy, které pracují na základě porovnání dvou identických molekul DNA. Po delší době (za 12 24h), se dělením chromozómů a celých buněk obnoví původní buněčná struktura tvořená čtyřmi oddíly a životaschopnost buňky zůstane zachována. Ukázalo se tedy, že opravný mechanismus není založen na žádném novém principu, tato bakterie má pouze vícečetné kopie genů zajišťující opravy ozářené DNA. Příroda tedy vyvinula velice účinný univerzální opravný mechanismus, ale naprostá většina organismů má v buňkách pouze omezené množství molekul pro opravu poškozené DNA. D. radiodurans má těchto molekul podstatně více, a proto opraví DNA rychleji a lépe. D. radiodurans zásluhou výše uvedených mechanismů přežívá dávku až 15000 Gy (37% přežití), zatímco běžně k usmrcení bakterie stačí 10 Gy (letální dávka pro člověka méně než 10 Gy) Využití v biotechnologiích Bioremediace radioaktivních lokalit kontaminovaných rozpouštědly a těžkými kovy Detoxikace radioktivních odpadů (čištění jaderných reaktorů) Rod Thermus Hlavní zástupce Thermus aquaticus je atypická grampozitivní bakterie, která je opatřena vnější membránou. Morfologie je proměnná odpovídá vnějším podmínkám, nejčastěji dlouhá vlákna, ale i tyčinky. Je obligátně aerobní (většinou), heterotrofní, nepohyblivá, nesporulující, lze ji isolovat z termálních pramenů v různých oblastech světa (poprvé byla objevena ve vřídlech v Yellowstonském národním parku), hodnoty ph vyžadované pro růst jsou převážně neutrální (někdy alkalické), teplotní pásmo 65 90 C. Bakterie je často zabarvena přítomnými pigmenty žlutě, oranžově a červeně. Z biochemické výbavy lze zmínit přítomnost enzymů následujích biochemických drah: EMP dráha, TCA, glyoxalátový cyklus, respirační systém. Bakterie jsou nutričně nenáročné (C-zdroj glukosa, sacharosa, organické kyseliny, N-zdroj amonné ionty, nízké koncentrace nutrientů). Využití v biotechnologiích Zdroj enzymu Taq polymerasa (DNA polymerasa), jednoho z nejvíce využívaných enzymů v molekulární biologii (polymerasová řetězová reakce PCR), jehož výhodou je odolnost vůči denaturačním teplotám, což umožňuje opakované použití Zdroj dalších termostabilních enzymů: serinové proteasy, glukosidasy, pululanasa Sinice 200 rodů, několik tisíc druhů Tradiční český název sinice, pochází z termínu sinný = modrý a je odvozen z řeckého překladu cyanos = modrý. Název sinice je tedy terminologicky správný. Současně jsou také často uváděny termíny cyanobakterie, cyanoprokaryota nebo cyanofyta. První dva termíny jsou v souladu s Mezinárodním bakteriologickým kódem, termín cyanophyta je v souladu s Mezinárodním kódem 18
botanické nomenklatury. Občas se pro tuto skupinu prokaryot nesprávně uvádí název modrozelené řasy, který je zavádějící a chybný, protože řasy patří mezi eukaryota. Sinice se vyskytují téměř všude ve sladkovodním i mořském planktonu, v půdě, na smáčených stěnách, uvnitř kamenů. Typický je výskyt ve všech extrémních biotopech, s výjimkou extrémně kyselých lokalit. Sinice jsou kosmopolitní organismy, které žijí i na sněhu, skalách, kůře stromů, srsti zvířat, v jeskyních. Šíří se větrem apod. Byly identifikovány také jako součást domácího prachu. Podle fosilních nálezů měly cyanobakterie významný podíl na vytvoření kyslíkové atmosféry na Zemi, objevily se v prekambriu před cca 3,5 miliardami let a před 2 miliardami let se staly dominující skupinou organismů na Zemi. Z metabolického hlediska jsou sinice fotoautotrofové. Vyznačují se fotosyntézou oxygenního typu, při níž je voda donorem elektronů, oxid uhličitý je fixován na organické sloučeniny a jako vedlejší produkt se uvolňuje kyslík. Fotosyntéza probíhá v tylakoidech obsahujících fotosyntetická barviva (čtyři druhy chlorofylu, tři fykobiliproteiny: modrý allofykocyanin a fykocyanin a červený fykoerytrin, dále barviva β-karoten, zeaxantin a další). Sinice jsou také významnými fixátory vzdušného dusíku a tak ovlivňují koloběh dusíku v přírodě. Sinice produkují množství dalších sekundárních metabolitů a podpůrných látek, například různé oligosacharidy, karboxylové kyseliny, vitamíny, peptidy, enzymy, antibiotika a polysacharidy. Na ochranu proti UV záření vytvářejí pigmenty, např. scytonemin, β-karoten a další. Sinice jsou nechvalně známými producenty toxinů: Alkaloidní neurotoxiny Paralytické toxiny Alkaloidní hepatotoxiny Peptidické hepatotoxiny Cytotoxiny Embryotoxiny Dermatotoxické alkaloidy Genotoxiny a mutageny Imunotoxiny, imunomodulátory a imunosupresory Využití v biotechnologiích 1. Spirulina laxissima, S. platensis, S. subsalsa Mnoho cyanobakteií způsobuje zdravotní problémy, Spirulina je však unikátní, protože je pro člověka nesmírně prospěšná. Spirulina patří mezi gramnegativní bakterie, má tvar tyčinek, spirál nebo disků. Je mezofilní, někteří zástupci tohoto rodu jsou však isolováni i z horkých pramenů. Spirulina je typický vodní organismus, vyskytující se nejčastěji ve sladkovodním alkalickém prostředí, někteří zástupci byli též isolováni z moře. Patří mezi fotosyntetizující aeroby, je autotrofní, obsahuje chlorofyl, karotenoidy, fykocyanin (modrý pigment) a další barviva. Spirulinu znali již Aztékové, je využívána v tradiční čínské a japonské medicíně, byla použita při léčbě nemoci z ozáření po výbuchu v Černobylu. Unikátní složení spiruliny: Proteiny: 55-70% Sacharidy: 15-25% Tuky: 6-8% Minerály: 6-13% Vláknina: 8 10% 19
Antioxidanty: ß- karoten (chrání kůži a oči, posiluje imunitu, provitamín A), zeaxanthin (chrání oči, mozek), kryptoxanthin, fykocyanin (chrání játra a ledviny), chlorophyl (anti-toxin, anti-karcinogen), superoxiddismutasa, vitamíny: A1, B1, B2, B6, B12, C a E Spirulina obsahuje 300% kalcia ve srovnání s mlékem Spirulina obsahuje 2300% železa ve srovnání se špenátem Spirulina obsahuje 3900% ß-karotenu ve srovnání s karotkou Spirulina obsahuje 375% proteinů ve srovnání s tofu Výhody kultivace sinic Není zapotřebí zemědělská půda, sinice lze kultivovat ve třech typech kultivačních zařízení, ve zvláštních typech rybníků, v reaktorech a v hybridních zařízeních. Zdrojem uhlíku je všudypřítomný oxid uhličitý (kultivace vede zároveň ke snižování emisí) a jako další nutrienty lze s výhodou využít komponenty přítomné v odpadních vodách. Zdrojem energie pro fotosyntézu je sluneční světlo. 2. Synechocystis sp. Jeden z nejvíce studovaných mikroorganismů, jehož genom byl sekvenován. Slouží jako modelový mikroorganismus pro studim fotosynézy, fototaxe, asimilace uhlíku a dusíku, evoluce plastidů a adaptace na environmetální stres. Vlastnosti a biotechnologické využití vláknitých mikroskopických hub Na tomto místě se zmíníme pouze o některých zástupcích jednobuněčných eukaryot (hub), patřících z části do pomocného oddělení Deuteromycota (konidiální houby), méně pak o representantech oddělení Ascomycota. Deuteromycety představují uměle vytvořenou (nefylogenetickou) skupinu, do které jsou řazeny nepohlavně se rozmnožující houby, u kterých není (nebo v minulosti nebyla) známa pohlavní část životního cyklu. Protože přirozený systém většiny hub je založen právě na poznání teleomorfního stadia, nebylo možno tyto druhy do fylogenetického systému zařadit. Z ryze praktických důvodů je často i v současné době toto označení přijímáno i v případě, že u konkrétního druhu jsou již známa obě stadia (anamorfní a teleomorfní). Stále však existují druhy, u nichž teleomorfní stadium dosud známo není a jejichž zařazení mezi deuteromycety je pak nezbytné. Představitelé této skupiny jsou vláknité mikroskopické houby, pro které bylo zavedeno označení plísně (19. stol., J. S. Presl). S tímto pojmenováním se setkáváme v aplikovaných oborech velice často, i když z taxonomického hlediska tento termín není vždy správně použit ( plísně zasahují ve skutečnosti do několika systematických skupin). Rod Aspergillus Rod Aspergillus patří k nejrozšířenějším a nejhojněji se vyskytujícím rodům plísní, jednotlivé druhy mohou být isolovány z půdy, ze vzduchu, z potravin, z organických zbytků a mnoha dalších zdrojů. Je representován značným počtem druhů fyziologicky rozdílných, z nichž řada disponuje metabolickými vlastnostmi vhodnými pro komerční využití. Tento rod zaujímá výjimečné postavení v historii mykologie a v biotechnologiích. Je řazen mezi deuteromycety, jeho vegetativní cyklus vede ke tvorbě konidií. Pokud je známa sexuální fáze životního cyklu, pak v souladu se zavedeným názvoslovím je pro tuto fázi používáno nové rodové označení - r. Eurotium. Životní cyklus je v tomto případě zakončen tvorbou askospor. V 50. letech minulého století byl u druhu A. nidulans popsán další typ životního cyklu - parasexuální životní cyklus, který tvoří alternativu k sexuálnímu cyklu. V sexuálním cyklu dochází k pravidelnému střídání haploidní a diploidní fáze, což u parasexuálního cyklu být nemusí. Parasexuální cyklus však 20