DAVID NOVOTNÝ, IVA KŘÍŽKOVÁ A JIŘINA KRÁTKÁ OPTIMALIZOVANÝ POSTUP PRO DETEKCI GLOMERELLA CINGULATA VE VĚTVÍCH A KMENECH JABLONÍ POMOCÍ MIKROBIOLOGICKÝCH METOD. METODIKA PRO ÚTVARY STÁTNÍ SPRÁVY Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2008
Metodika vznikla za finanční podpory Mze ČR a je výstupem projektu č. Mze NAZV QF4074. Metodika je určena pro státní správu Státní rostlinolékařskou správu. O uplatnění metodiky byla se 17.12.2008 uzavřena smlouva podle ustanovení $269 zákona 513/1991 Sb., obchodního zákoníku. Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2008 ISBN: 978-80-87011-78-2
DAVID NOVOTNÝ, IVA KŘÍŽKOVÁ A JIŘINA KRÁTKÁ OPTIMALIZOVANÝ POSTUP PRO DETEKCI GLOMERELLA CINGULATA VE VĚTVÍCH A KMENECH JABLONÍ POMOCÍ MIKROBIOLOGICKÝCH METOD. METODIKA PRO ÚTVARY STÁTNÍ SPRÁVY Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2008
Abstrakt: Optimalizovaný postup pro detekci Glomerella cingulata ve větvích a kmenech jabloní pomocí mikrobiologických metod. Metodiky dává přesný pracovní postup pro detekci houby Glomerella cingulata (vč. nepohlavního stadia Colletotrichum gloeosporioides) ve větvích a kmenech jabloní pomocí mikrobiologických metod tak, aby bylo možné stanovit přítomnost/absenci jmenovaného druhu houby v matečných rostlinách jabloní, hrušní a kdouloní jak to žádá certifikační schéma pro matečné rostliny jabloní, hrušní a kdouloní vydané Evropskou a středozemní organizací ochrany rostlin (EPPO). Abstract: Optimised technique to detection of Glomerella cingulata in apple branches and stems by microbiological methods. Methodology provides precise technique to detection of fungus Glomerella cingulata (incl. anamorphic state Colletotrichum gloeosporioides) in apple branches and stems by microbiological methods. It is way to determine absence or occurrence of the species in the samples. The methodology is based on requirement of the certification schemes for nuclear stock of Malus, Pyrus and Cydonia issued by European and Mediterranean Plant Protection Organization (EPPO) Oponenti: Ing. Jana Kloutvorová a Ing. Eva Zapletalová Metodika je pro útvary státní správy a mohou ji využívat jakékoliv další pracoviště, které jsou vybaveny pro mikrobiologický rozbor vzorků. Metodika byla schválena Ministerstvem zemědělství ČR.
OPTIMALIZOVANÝ POSTUP PRO DETEKCI GLOMERELLA CINGULATA VE VĚTVÍCH A KMENECH JABLONÍ POMOCÍ MIKROBIOLOGICKÝCH METOD. Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Odbor rostlinolékařství Oddělení mykologie Vypracovali: RNDr.David Novotný Ph.D., Mgr. Iva Křížková Ph.D., RNDr. Jiřina Krátká Dr.Sc. I) Cíl metodiky Cílem metodiky je dát přesný pracovní postup pro detekci houby Glomerella cingulata ve větvích a kmenech jabloní pomocí mikrobiologických metod tak, aby bylo možné stanovit přítomnost/absenci jmenovaného druhu houby v matečných rostlinách jabloní, hrušní a kdouloní, jak to žádá certifikační schéma pro matečné rostliny jabloní, hrušní a kdouloní vydané Evropskou a středozemní organizací ochrany rostlin (EPPO). II) Vlastní popis metodiky Úvod Druhy rodu Glomerella (Glomerellaceae, Hypocreomycetideae, Sordariomycetes, Ascomycota) (Kirk et al., 2008) jsou známy jako patogeny, endofyty nebo saprofyty různých druhů rostlin. Jedním z nejvýznamnějších druhů z tohoto rodu je Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & H. Schrenk, jehož anamorfním stádiem je Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc (dle Bayerova kódu - GLOMCI), který žije na, nebo v různých druzích rostlin jako patogen nebo endofyt (Stone et al., 2004). V případě jabloní způsobuje především hořkou hnilobu jablek. Choroba se vyznačuje šedohnědými lézemi na plodech a listech, které jsou zpočátku červenými skvrnami, které se mění na hnědé nepravidelné skvrny (Jones et Aldwinckle, 1990). Na živném médiu vytváří velmi variabilní kolonie šedě až hnědě zbarvené s narůžovělými skvrnami, reverz tmavě hnědý s vínově červenými skvrnami. Konidie vznikají z fialid v acervulátních konidiomatech nebo v ranných stádiích vývoje z fialid na jednotlivých hyfách. Konidie jsou přímé, válcovitě uťaté na apexu o velikosti 9-24 x 3-4,5 m. Apresoria jsou kyjovitá nebo nepravidelná o velikosti 6-20 x 4-12 m (de Hoog, 2000). V certifikačním schématu pro matečné rostliny jabloní, hrušní a kdouloní vydaném Evropskou a středozemní organizací ochrany rostlin (EPPO) je požadována absence druhu G. cingulata v matečných rostlinách (Anonymus, 1999), přičemž tato směrnice neposkytuje návod na detekci této houby. Navržená metodika se zabývá odběrem a zpracováním vzorků, ve kterých lze detekovat patogena pomocí mikrobiologických metod. Odběr vzorku 1) Prohlédneme rostlinu nebo její část (celý stromek, kmínek, větev) a zjistíme, zda na nich nejsou nekrotické skvrny nebo hojící se rány. (obr. č. 1-4)
Obrázek č. 1, 2 - Symptomy napadení G. cingulata (24 měsíců po inokulaci) na větvičkách jabloně: Obrázek č. 3, 4 - Symptomy napadení G. cingulata (24 měsíců po inokulaci) na větvičkách jabloně: Napadené větvičky na řezu s hnědě zbarveným dřevem pod kůrou. 2) Pokud uvedené symptomy jsou patrné, tak odebereme vzorek o velikosti nejméně 2-3 cm na délku (v případě kmene odřízneme nekrotizující pruh kůry a dřeva, v případě
větve odřízneme buď pruh nekrotizující kůry a dřeva nebo pokud je to možné celý kus větve), vložíme ho do nepoužitého igelitového sáčku, který pečlivě uzavřeme, aby nedošlo k vyschnutí. Sáčky označíme a připojíme: jméno vzorkovatele, jméno a adresu pěstitele, lokalitu, druh a odrůdu dřeviny, datum sběru. Vzorky co nejdříve dopravíme do diagnostické laboratoře. Vzorky uchováváme v chladničce. 3) Pokud nejsou na sledované rostlině žádné symptomy poškození, tak ze 3 větví a z báze, středu a vrcholu (tzn. pod korunou) kmínku odebereme vzorky, které budou nejméně 3 centimetry dlouhé (v případě kmene odřízneme pruh kůry a dřeva, v případě větve odřízneme buď pruh kůry a dřeva nebo pokud je to možné celý kus větve). V případě menších rostlin odebereme pouze 1 vzorek pro analýzu. Vzorky vložíme do nepoužitého igelitového sáčku, který pečlivě uzavřeme, aby nedošlo k vyschnutí vzorků. Sáčky označíme a připojíme: jméno vzorkovatele, jméno a adresu pěstitele, lokalitu, druh a odrůdu dřeviny, datum sběru. Vzorky co nejdříve dopravíme do diagnostické laboratoře. Vzorky uchováváme v chladničce. 4) Vzorky uložené v chladničce zpracujeme do 48 hodin (výjimečně do 72 hodin). Mikrobiologické vyšetření Potřebný materiál a přístroje Potřebné přístroje: autokláv, mikroskop s objektivem zvětšujícím 100-x, flow-box třídy Biohazard II nebo očkovna, termostat na inkubaci; doporučené: horkovzdušný sterilizátor (na vysterilizování potřebného skla) Materiál a drobné nástroje: sladinový extrakt, agar, destilovaná voda, 96% denaturovaný ethanol (ethanol pouze s příměsí benzínu a bez příměsi nafty a petroleje), chlornan sodný (přesněji chlornan sodný roztok), vysterilizované sklenice s víčkem (pokud bez víčka tak přikryté 2 vrstevným alobalem místo víček), 2 skalpely s výměnnou čepelkou, čepelky pro skalpely, 2 pinzety s délkou 145 mm, 1 pinzetu s délkou 250 nebo 300 mm, 2 pinzety s délkou okolo 130 mm z hodinových per, lihový kahánek nebo laboratorní kahan na plyn, skleněné misky nebo sterilní umělohmotné misky, krycí a podložní skla pro mikroskopování, infekční jehly a injekční stříkačku pro přípravu preparátu Postup přípravy vzorků 1) Uříznout 1-4 cm velký kus větve nebo kmene jabloně. Pokud dodaný vzorek představuje celá větev, tak vzorek představuje špalíček. V případě, že vzorek představuje pruh kůry a dřeva odříznutý z kmene nebo větve, vzorek upravíme tak, aby byl o délce mezi 1-4 centimetry. 2) Mechanicky očistit kartáčkem a opláchnout pod tekoucí vodovodní vodou. 3) Připravený vzorek uložit do připravené nesterilní, ale čisté Petriho misky. 4) Povrchově sterilizovat vzorek v následující řadě (přenos mezi jednotlivými sterilizačními činidly pinzetami namočenými v lihu a ožehlými plamenem). 5) Nejprve vzorek povrchově vysterilizovat v denaturovaném 96 % ethanolu (ethanol pouze s příměsí benzínu a bez příměsi nafty a petroleje) 1 minuta. 6) Poté vzorek povrchově vysterilizovat v chlornanu sodném (přesněji chlornan sodný roztok) s přibližně 10 % obsahem chloru 2 minuty. 7) Pak vzorek povrchově vysterilizovat v denaturovaném 96 % ethanolu (ethanol pouze s příměsí benzínu a bez příměsi nafty a petroleje) 30 sekund. 8) Nakonec vzorek opláchnout ve sterilní vodě 30 sekund. 9) Přenést vysterilizovanou pinzetou na sterilní Petriho misku.
10) Ve flow-boxu vysterilizovaným skalpelem uříznout ze zpracovávaného vzorku kousky o velikosti 3-5 x 3-5 x 1-2 mm a vysterilizovanou pinzetou tyto kousky přenést a položit po 5 kusech do Petriho misky o průměru 90 mm se sladinovým agarem. 11) Inkubovat při pokojové teplotě, optimálně při 25 C, a při střídaní tmy a denního světla po 12 hodinách. Sladinový agar Sladinový extrakt (= malt extract) - 20 g Agar 20 g Destilovaná voda 1000 ml Autoklávovat 20 minut při 110 C. Vyhodnocení vzorků 1) Po 10-21 dnech mikroskopicky prohlédnout kolonie vyrostlé z kousků v Petriho miskách (obr. č. 5) 2) Glomerella cingulata bude vytvářet bělošedé, nižší kolonie (obr. č. 6) a budou se vytvářet válcovité hyalinní 1 buněčné, 9-24 x 3-4,5 m velké konidie s uťatým jedním nebo oběma konci anamorfního stádia Colletotrichum gloeosporioides (obr č. 9) Možnost záměny s jinými druhy z rodu Colletotrichum, anamorfními stadii druhů z rodu Glomerella Z jabloní jsou známy celkem tři druhy z rodu Colletotrichum a to vedle druhu C. gloeosporioides (teleomorfa Glomerella cingulata) ještě druhy C. acutatum a C. dematium. Nejviditelnější rozdíl mezi těmito druhy je ve tvaru konidií. Druh C. acutatum se vyznačuje výrazně špičatými konidiemi (obr. č. 10) a bílými, krémovými, šedými nebo růžovo-oranžovými kolonie (obr. č. 7). Revers kolonií je krémový až oranžový s hnědými skvrnami (obr. č. 8). Tento druh může způsobovat, stejně jako C. gloeosporioides, hořkou hnilobu jablek. Druh C. dematium se vyznačuje výrazně zahnutými srpovitými konidiemi (obr. č. 11) a v USA způsobuje chorobu jablek s anglickým názvem spongy dry rot. Závěr: Mikrobiologická metoda založená na izolaci Glomerella cingulata z větví a kmenů jabloní při inkubaci na sladinovém agarovém médiu se ukázala jako spolehlivou a vhodnou metodou pro zjištění přítomnosti uvedeného fytopatogenního druhu. Této metodě lze vytknout, že nedává výsledky během 48 hodin od odebrání vzorku, avšak je snadno proveditelná v mnoha laboratořích a v porovnání s molekulárně-genetickými a imunochemickými metodami je podstatně lacinější.
Obrázek č. 5 Analyzovaný vzorek větve jabloně - kolonie Glomerella cingulata vyrostlá na sladinovém agaru po 10 dnech inkubace založených vzorků. Kolonie Glomerella cingulata Obrázek č. 6 Čistá kultura kmene Glomerella cingulata vyrostlá na sladinovém agaru po 10 dnech inkubace.
Obrázek č. 7 Čistá kultura kmene Colletotrichum acutatum vyrostlá na bramborovo-dextrósovém agaru po 10 dnech inkubace líc kolonie. Obrázek č. 8 Čistá kultura kmene Colletotrichum acutatum vyrostlá na bramborovo-dextrósovém agaru po 10 dnech inkubace rub kolonie. Obrázek č. 9 - Konidie Colletotrichum gloeosporioides
Obrázek č. 10 - Konidie Colletotrichum acutatum Obrázek č. 11 - Konidie Colletotrichum dematium
III) Srovnání novosti postupů oproti původní metodice, případně jejich zdůvodnění, pokud se bude jednat o novou neznámou metodiku ( 2, odst. 1, písm. a, bod 2 zákona č. 130/2002 Sb.). Dosud nebyla vypracována metodika pro stanovení přítomnosti Glomerella cingulata ve větvích a kmenech jabloní. IV) Popis uplatnění metodiky, pro koho je určena, jakým způsobem bude uplatněna. Metodika slouží pro: stanovení absence/přítomnosti G. cingulata v matečných rostlinách jabloní, hrušní a kdouloní při dovozu a vývozu tohoto materiálu do/z České republiky a při poskytování matečných rostlin dalším pěstitelům v rámci ČR stanovení absence/přítomnosti G. cingulata v sadbovém materiálu jabloní, hrušní a kdouloní při dovozu a vývozu tohoto materiálu do/z České republiky a při poskytování sazenic rostlin dalším pěstitelům v rámci ČR stanovení absence/přítomnosti G. cingulata ve větvích a kmenech jabloní, hrušní a kdouloní odumírajících nebo vykazujících příznaky poškození. Metodiku mohou využívat jakékoliv laboratoře, které jsou vybaveny pro mikrobiologický rozbor vzorků. Jsou to jednak orgány státní správy (např. Státní rostlinolékařská správa), ale i nestátní laboratoře. V) Seznam použité literatury ANONYMUS (1999). Normes OEPP. EPPO Standards. Certification schemes. Pathogentested material of Malus, Pyrus and Cydonia. EPPO Bulletin 29(3):239-252. DE HOOG G. S., GUARRO J., GENÉ J. and FIGUERAS M. J. (2000): Atlas of Clinical Fungi CBS, 1126 p. JONES A. L. et ALDWINCKLE, H. S. (Eds.) (1990): Compendium of apple and pear diseases 125 p., St. Paul. KIRK P. M., CANNON P. F., MINTER D. W. and STALPERS J. A. (eds.) (2008): Ainsworth & Bisby S Dictionary of the fungi. 10th edition Wallingford, 771 p. STONE J. K., POLISHOOK J. D. and WHITE J. F. jr. (2004): Endophytic fungi In: Mueller G. M., Bills G. F. and Foster M. S. (eds), Biodiversity of fungi. Inventory and monitoring methods, p. 241-270, Amsteradam et al. VI) Seznam publikací, které předcházely metodice a byly publikovány (pokud existují), případně výstupy z určité znalosti, jestliže se jedná o originální práci. NOVOTNÝ D. (2007): Houby rodu Pezicula a Glomerella a ovocné dřeviny, Mykologické listy 102: 48. NOVOTNÝ D. (2007): Příspěvek k poznání endofytické mykobioty větví a listů jabloní a jejich vztahu k fytopatogenním houbám. In: Sborník referátů z odborného semináře "Diagnostika a hodnocení chorob rostlin, se zaměřením na obilniny", 9.11.2006, VÚRV Praha-Ruzyně, pp. 48-53.
NOVOTNÝ D. (2007): Studium endofytických hub zemědělsky významných rostlin. In: Nováková A. (ed), Sborník příspěvků z workshopu MICROMYCO 2007, 4.-5. 9. 2007 České Budějovice, pp. 97-101. Finančně hrazeno projektem NAZV QF 4074.
Autoři: RNDr. David Novotný Ph.D., Mgr. Iva Křížková Ph.D, RNDr. Jiřina Krátká DrSc. Název: Optimalizovaný postup pro detekci Glomerella cingulata ve větvích a kmenech jabloní pomocí mikrobiologických metod. Vydal: Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Drnovská 507, 161 06 Praha 6 Ruzyně ve Výzkumném ústavu zemědělské techniky, v.v.i., Drnovská 507, 161 06 Praha 6 - Ruzyně Sazba a tisk: Výzkumný ústav zemědělské techniky, v.v.i., Drnovská 507, 161 06 Praha 6 - Ruzyně Náklad: 20 ks Metodika je veřejně přístupná na adrese www.vurv.cz Vyšlo v roce 2008 Vydáno bez jazykové úpravy Kontakt na autora: novotny@vurv.cz Autor titulní fotografie: RNDr. David Novotný Ph.D. Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2008 ISBN: 978-80-87011-78-2
Vydal Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. ve Výzkumném ústavu zemědělské techniky, v.v.i., 2008