OPTIMALIZOVANÉ POSTUPY PRO DETEKCI PEZICULA ALBA A P. MALICORTICIS V PLETIVECH JABLONÍ POMOCÍ IMUNOCHEMICKÝCH METOD.

Transkript

1 IVA KŘÍŽKOVÁ, DAVID NOVOTNÝ A JIŘINA KRÁTKÁ OPTIMALIZOVANÉ POSTUPY PRO DETEKCI PEZICULA ALBA A P. MALICORTICIS V PLETIVECH JABLONÍ POMOCÍ IMUNOCHEMICKÝCH METOD. METODIKA PRO ÚTVARY STÁTNÍ SPRÁVY Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2008

2 Metodika vznikla za finanční podpory Mze ČR a je výstupem projektu č. Mze NAZV QF4074. Metodika je určena pro státní správu. O uplatnění metodiky byla se Státní rostlinolékařskou správu uzavřena smlouva podle ustanovení $269 zákona 513/1991 Sb., obchodního zákoníku. Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2008 ISBN:

3 IVA KŘÍŽKOVÁ, DAVID NOVOTNÝ A JIŘINA KRÁTKÁ OPTIMALIZOVANÉ POSTUPY PRO DETEKCI PEZICULA ALBA A P. MALICORTICIS V PLETIVECH JABLONÍ POMOCÍ IMUNOCHEMICKÝCH METOD. METODIKA PRO ÚTVARY STÁTNÍ SPRÁVY Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2008

4 Abstrakt: Optimalizované postupy pro detekci Pezicula alba a P. malicorticis v pletivech jabloní pomocí imunochemických metod. Metodika poskytuje přesný pracovní postup pro detekci houby Pezicula alba a P. malicorticis ve větvích a kmenech jabloní pomocí imunochemických metod tak, aby bylo možné rychle a spolehlivě zjistit přítomnost jmenované houby. Absenci tohoto druhu v matečných rostlinách jabloní, hrušní a kdouloní žádá certifikační schéma vydané Evropskou a středozemní organizací ochrany rostlin (EPPO). Abstract: Optimised technique to detection of Pezicula alba and P. malicorticis in apple tissue by imunochemical methods. Methodology provides precise technique to detection of fungi Pezicula alba and P. malicorticis in apple branches and stems by imunochemical methods. It gives way to determine absence or occurrence of the species in the samples quickly and reliably. The methodology is based on requirement of the certification schemes for nuclear stock of Malus, Pyrus and Cydonia issued by European and Mediterranean Plant Protection Organization (EPPO). Oponenti: Ing. Jana Kloutvorová a Ing. Eva Zapletalová Metodika je pro útvary státní správy a mohou ji využívat jakékoliv další pracoviště, které jsou vybaveny pro mikrobiologický rozbor vzorků. Metodika byla schválena Ministerstvem zemědělství ČR.

5 OPTIMALIZOVANÉ POSTUPY PRO DETEKCI PEZICULA ALBA A P. MALICORTICIS V PLETIVECH JABLONÍ POMOCÍ IMUNOCHEMICKÝCH METOD. Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Odbor rostlinolékařství Oddělení mykologie Vypracovali: Mgr. Iva Křížková Ph.D., RNDr. David Novotný Ph.D. a RNDr. Jiřina Krátká DrSc. I) Cíl metodiky Cílem metodiky je poskytnout přesný pracovní postup pro detekci houby Pezicula alba a P. malicorticis ve větvích a kmenech jabloní pomocí imunochemických metod tak, aby bylo možné rychle a spolehlivě zjistit přítomnost jmenované houby. Absenci tohoto druhu v matečných rostlinách jabloní, hrušní a kdouloní požaduje certifikační schéma vydané Evropskou a středozemní organizací ochrany rostlin (EPPO). II) Vlastní popis metodiky. Navržená metodika se zabývá odběrem a zpracováním vzorků, ve kterých lze detekovat patogena pomocí imunochemických metod, tj. pomocí již připravených protilátek a obsahuje i návod na přípravu protilátek samotných. Součástí metodiky je také příprava protilátek, neboť komerční diagnostické soupravy pro detekci Pezicula alba a P. malicorticis v současné době nejsou k dispozici. Detekce jmenovaných hub mikrobiologickými metodami je obtížná a mnohdy velmi neprůkazná a proto tyto metody nelze použít. Výskyt, význam a popis sledovaných patogenů Druhy rodu Pezicula (Dermataceae, Helotiales, Leotiomycetes, Ascomycota) (Kirk et al. 2008) se vyskytují v různých druzích rostlin, především poměrně hojně ve dřevinách. Jedná se jednak o endofyty žijící ve zdravých pletivech větví kmenů nebo patogeny, které jsou nalézány v nekrotických skvrnách, zejména na lesních dřevinách, ale druhy Pezicula alba, P. malicorticis a P. perennans byly zjištěny v Severní Americe a Evropě jako původci rakoviny a anthraknózy kůry jabloní, hrušní, broskvoní a meruněk. Zmíněné druhy nebyly dosud zaznamenány v České republice jako původci rakoviny a anthraknózy kůry uvedených ovocných dřevin, ale P. alba je v ČR známa jako původce kruhové hnědé hniloby jablek. Ale v celosvětovém měřítku byly u jabloní dosud zjištěny Pezicula corticola, P. sepium, P alba, P. malicorticis a P. perennans a u hrušní druhy P. corticola, P. sepium, P malicorticis a P. perennans (Jones et Aldwinckle 1990, Verkley 1999). V roce 1999 byl obnoven samostatný rod Neofabraea a nyní jsou do něj řazeny mimo jiné druhy N. alba, N. malicorticis a N. perennans, což jsou druhy známé jako patogeny ovocných dřevin (Verkley 1999). V České republice byli zástupci rodu Pezicula zaznamenány ve stádiu plodnic na různých, především lesních dřevinách (Novotný 2003). V certifikačním schématu pro matečné rostliny jabloní, hrušní a kdouloní vydaném Evropskou a středozemní organizací ochrany rostlin (EPPO) je požadována absence druhů Pezicula alba Guthrie 1959, (dnes synonymum jména Neofabraea alba (E. J. Guthrie) Verkley 1999) a s Baeyrovým kódem PEZIAL, a P. malicorticis (H. S. Jackson) Nannf. 1932, (dnes synonymum jména Neofabraea malicorticis H.S. Jacks a s Baeyrovým

6 kódem PEZIMAP) (Anonymus 1999), přičemž tato směrnice neposkytuje návod na detekci těchto hub. Imunodetekce druhů P. alba a P. malicorticis nebyla ve světě ani v ČR dosud řešena. P. alba vytváří na sladinovém agaru bělavé nebo růžově žlutohnědé až skořicové kolonie (obr. č. 1) s šafránovým až oranžovým reverzem, které po 14 dnech dosahují velikosti mm. Vzdušné mycelium je hojné. Konidiomata se v kultuře tvoří pouze u některých kmenů a jsou µm velké a v nich se na konidioforech někdy vytvářejí x 2,5-3,5 µm cylindrické až vřetenovitě-alantoidní, neseptované, slabě až výrazně zakřivené makrokonidie. V konidiomatech se v kultuře mohou vytvářet hyalinní 1-buněčné, cylindrické, většinou silně zakřivené x 0,5-1 µm velké mikrokonidie (Verkley 1999). P. malicorticis tvoří na sladinovém agaru šedivé, korálové nebo masově zbarvené kolonie (obr. č. 2) s červeným až žlutohnědým reverzem, které po 14 dnech dosahují velikosti okolo 30 mm. Vzdušné mycelium je dobře vyvinuté, ale je nižší než u P. alba. Konidiomata se v kultuře vytvářejí pouze u některých kmenů a jsou µm velké a v nich se na konidioforech někdy vytvářejí 1535 x 3-6 µm cylindrické až vřetenovitě-alantoidní, 1-buněčné, slabě až výrazně zakřivené makrokonidie. V konidiomatech se v kultuře mohou vytvářet hyalinní 1-buněčné, cylindrické, přímé nebo slabě zakřivené 5-8 (-13) x 1-2 µm velké mikrokonidie (Dugan et al. 1993, Verkley 1999). Obrázek č. 1 - Kolonie Pezicula alba na 2 % sladinovém agaru Obrázek č. 2 - Kolonie Pezicula malicorticis na 2 % sladinovém agaru Popis příznaků choroby Druhy rodu Pezicula způsobují na větvičkách drobné, okrouhlé skvrny, které mohou být za vlhka načervenalé či vínové. Postupně se zvětšují, protahují do eliptického tvaru s propadlým, oranžovohnědým povrchem léze (obr. č. 3A). Mezi zdravým a nemocným pletivem se mohou vytvářet trhliny (obr. č. 3B, 4A). Kůra se odlupuje a odhaluje dřevo nebo vlákna lýka. Léze se obvykle nezvětšují v následujícím roce po napadení. V peridermu se mohou tvořit krémově zbarvené acervuly a pronikat na povrch trhlinami (Jones and Aldwinckle 1990).

7 A B Obrázek č. 3 - Symptomy napadení P. alba (6 měsíců po inokulaci) na větvičkách jabloně: A - hnědočervená nekrotická léze, B - léze s prasklinami A B Obrázek č Symptomy napadení P. malicorticis (6 měsíců po inokulaci) na větvičkách jabloně: A - povrchová nekróza, B napadená větvička na řezu s hnědě zbarveným jádrovým dřevem. Onemocnění na plodech se projevuje většinou až v druhé polovině skladovacího období. Vyvolává ostře ohraničené okrouhlé hnědé léze o průměru 0,5 3 i více cm, jejichž povrch může být miskovitě prohnutý (obr. č. 5-8). Napadená dužina na řezu plodem může mít také miskovitý tvar, pletivo je tuhé, ohraničené od zdravé části, ale není snadno oddělitelné. Na povrchu skvrn se postupně tvoří acervuly (Lánský 2002, Hluchý et al. 1997, Henriquez et al. 2004).

8 Obrázek č. 5 Začínající hniloba jablka Obrázek č. 6 Začínající hniloba jablka odrůdy Golden Delicious způsobená odrůdy Idared způsobená Pezicula alba po Pezicula alba po inokulaci. inokulaci. Obrázek. č. 7 a 8 Hniloba jablek odrůdy Golden Delicious způsobená Pezicula alba po inokulaci.

9 Odběr a zpracování vzorků Odběr vzorků pro laboratorní analýzu provádíme při prohlídce porostu nebo stromů jabloní v rámci fytosanitární kontroly zaměřené na kontrolu a průzkum výskytu škodlivých organismů. Z kontrolovaných stromů odebíráme vzorky pro imunochemické stanovení. Odebrané vzorky výhonů a větviček se symptomy napadení zbavíme listů a ihned uložíme do mikrotenového sáčku, který pečlivě uzavřeme, aby nedošlo k vyschnutí vzorků. Sáčky označíme a připojíme: jméno vzorkovatele, jméno a adresu pěstitele, lokalitu, druh a odrůdu dřeviny, datum sběru. Vzorky co nejdříve dopravíme do diagnostické laboratoře. Skalpelem oloupeme kůru, lýko a povrchovou vrstvu dřeva a vzorek zvážíme. Kousky pletiva rozstříháme nůžkami na drobnější části a drtíme ve třecí misce s pomocí tekutého dusíku nebo mořského písku. Vzorek extrahujeme v PBS (3 ml/g pletiva) po 24 hod. při 4 ºC. Centrifugací (4020 g, 10 min, 0 C) oddělíme supernatant od peletu, supernatant buď ihned testujeme, anebo zamrazíme (nejlépe při -45 C nebo nižší teplotě). Nepřímá PTA-ELISA na mikrotitrační destičce 1. Aplikován antigen nebo extrakt ze vzorku - ředění: bikarbonátový pufr ph 9,6, nebo PBS, objem: 100 µl / jamku, inkubace: 25 C, 3 h nebo přes noc v lednici. 2. Promytí - promývací roztok (PBS s Tweenem, 0,5 ml v 1000 ml), celkem promývání 3x po 5 minutách, na závěr z desky vyklepat zbylou tekutinu. 3. Blokace - blokační pufr (1 % BSA v PBS), množství 200 µl / jamku, inkubace 30 minut při 25 C 4. Promytí - ad Primární protilátka - ředění v blokačním pufru: ředíme IgG na koncentraci 0,1 µg/ml, množství: 100 µl/jamku, inkubace: 25 C, 3 h nebo přes noc v lednici. 6. Promytí - ad Konjugát - značený alkalickou fosfatázou (anti-rabbit IgG-AP), ředění v promývacím pufru, koncentrace 250 mu, množství: 100 µl / jamku, inkubace: 25 C, 3 h nebo přes noc v lednici. 8. Promytí - ad Substrát - p-nitrofenylfosfát - 1 mg / 1 ml substrátového pufru (smíchat těsně před použitím), množství: 100 µl / jamku, inkubace minut. 10. Zastavení reakce: 50 µl / jamku 3 mol / l NaOH (120 g / 1000 ml) tento krok není nutný. 11. Absorbance 405 nm. Dot-blot Všechny kroky metody provádíme v jedné vaničce, za pokojové teploty a mírného třepání. Nitrocelulózová membrána musí být ve všech používaných roztocích ponořena, po každém kroku postupu se použitý roztok vylije. Ilustrační fotka nitrocelulózové membrány po provedeném testu (obr. č. 9). 1) Kapku extraktu (2 ml) opatrně kápneme na membránu podle dopředu stanoveného schématu). 2) Membránu ponoříme do 15 ml blokačního pufru (2 % BSA v PBS), třepání 1 hod.

10 3) Slít, dát primární protilátku ředěnou v blokačním pufru (IgG ředíme na koncentraci 0,1 µg/ml), třepání 1 hod. 4) 3 x promýt v PBS (3 x 3 min.). 5) Nalít 0,01M Tris-NaCl, ph 8,1 a 3 min. na třepačce, vylít. 6) 0,01M Tris NaCl, ph 8,1 + konjugát anti-rabbit IgG AP (dle doporučení, 500 U/ml ), třepat ½ hodiny na třepačce, vylít. 7) 3 x promýt 0,01M Tris-NaCl, ph 8,1 (3x 3 min. na třepačce). 8) 2 x promýt 0,1 M Tris-NaCl, ph 8,1 + MgCl2 (0,102 g MgCl2.6 H2O na 100 ml Tris = 0,5 mm ), vylít. 9) Nalít substrát, 10 ml/desku (200 ml NBC/BCIP Stock Solution do 10 ml Tris+MgCl2), sledovat vývoj zabarvení (na třepačce), vylít. 10) Zastavit v H2O (několikrát promýt). Kalibrační křivka antigenu (1, 5, 10 µg/ml) Obrázek č. 9 Test dot-blot provedený na nitrocelulózové membráně (jako kalibrační křivka použit immunogen, vzorky 1-8 jsou větvičky jabloně uměle inokulované P. malicorticis, 9 a 10 negativní kontroly). Hodnocení testů Výsledky imunotestů jsou porovnány s pozitivní kontrolou, kterou může být buď kalibrační křivka koncentrací antigenu, nebo pletivo hostitelské rostliny, které bylo úspěšně inokulováno a prokazatelně infikováno patogenem. Do každého testu je třeba zařadit negativní kontrolu (pletivo z několika prokazatelně nenapadených rostlin), která stanoví prahové hodnoty při prováděném testování. Na základě absorbancí

11 dostatečného počtu negativních kontrol (cca 10) stanovíme detekční limit testu (detekční limit = průměr negativních vzorků + 3* jejich směrodatná odchylka). Hodnota detekčního limitu je nejnižší hodnota absorbace, od které je vzorek hodnocen jako pozitivní. Upozornění Připravené polyklonální protilátky pro detekci rodu Pezicula jsou uloženy ve Sbírce mikroorganismů a protilátek oddělení mykologie, Odbor rostlinolékařství, VÚRV, a jsou k dispozici pro referenční a diagnostické laboratoře SRS. V současné době je k dispozici primární protilátka pro nepřímé formáty ELISA. Příprava specifické protilátky pro detekci rodu Pezicula Příprava antigenu Pro přípravu antigenu je třeba napěstovat mycelium patogena. Z okraje aktivně rostoucí kolonie očkujeme mycelium na tekuté Czapek-Dox médium (CDM) do Rouxových lahví (objem 2 l) nebo Erlenmeyerových baněk (objem 500 ml). Kultivujeme při C dnů jako stacionární kulturu. Poté mycelium zfiltrujeme a necháme rychle uschnout při pokojové teplotě. Purifikovaný antigen (proteinová frakce) Mycelium rozdrtíme v třecí misce na jemný prážek a extrahujeme rozpustné sloučeniny v extrakčním pufru (20 ml na 1 g mycelia) při 5 C 24 hodin. Na chlazené centrifuze stáčíme 10 minut při 1 C a 4000 g. Proteiny z roztoku srážíme v ledové lázni postupným přikapáváním stejného objemu nasyceného roztoku (NH4)2SO4, ph 7-8 a ponecháme do druhého dne v lednici. Sraženina je oddělena odstředěním 10 minut při 1 C a 4000 g a získaný pelet rozpuštěn v objemu PBS, který odpovídá 1/10 objemu použitého extrakčního pufru. Roztok proteinů je dialyzován v dialyzačním střívku proti 50 % PBS, který je třikrát vyměněn (optimální doba výměny 4 hod, 8-12 hod, 12 hod), teplota 4-8 oc. Po dialýze je antigen zahuštěn na vrstvě PEG a změřen obsah proteinů pomocí DC protein assay kit (fa BioRad). Takto připravený antigen je buď rozpipetován do ependorfek a uchován při -50 C nebo lyofilizován. Purifikované antigeny jsou použity jako imunogeny při imunizaci pokusných zvířat. Nepurifikovaný antigen (totální extrakt) Tento typ antigenů můžeme použít jako pozitivní kontrolu v testech nebo je využít pro stanovení křížových reakcí připravených protilátek. Začátek přípravy podobný jako u purifikovaného antigenu. Rozdrcené mycelium hub je extrahováno v extrakčním pufru s DTT. Po odstranění peletu je supernatant dialyzován v dialyzačním střívku proti 50 % PBS, který je třikrát vyměněn (optimální doba výměny 4 hod, 8-12 hod, 12 hod), teplota 4-8 oc. Po dialýze je antigen zahuštěn na PEG a změřen obsah proteinů pomocí DC protein assay kit, kalibrační křivka BSA (fa BioRad). Takto připravený antigen je buď rozpipetován do eppendorfek a uchován při -50 C nebo lyofilizován.

12 Doporučené imunizační schéma Laboratorní králíci rasy Činčila velká jsou imunizováni v třítýdenních intervalech imunizačními dávkami podkožně do oblasti lopatek. Imunizační dávka obsahuje zvyšující se množství houbových proteinů ( μg/dávku) v objemu 0,5 ml sterilní destilované vody a 0,5 ml adjuvans (AL-SPAN-OIL). Poslední dávka (boostr) je podána bez adjuvans. Po 8-10 dnech od podání boostru je zvířatům odebrána krev z marginální ušní žíly (maximálně 50ml). Izolace IgG z antiséra Odebraná krev je ponechána 1 hodinu při 37 C a poté do druhého dne v ledničce. Krevní koláč je odstraněn centrifugací. Sérum je buď dále zpracováváno, nebo zamrazeno při -20 až -30 C. U každého séra je zjišťován titr. Imunoglobulíny (IgG) jsou ze séra vysráženy nasyceným roztokem (NH4)2SO4 (použitý objem síranu amonného = objemu séra) a dále purifikovány pomocí afinitní chromatografie na proteinu A (fa Sigma) dle pokynů výrobce. Roztok IgG je dialyzován proti 50 % PBS, zahuštěn a změřen obsah proteinů (DC protein assay kit, kalibrační křivka bovinní IgG, fa BioRad). Roztok IgG je naředěn na pracovní koncentraci 1mg/ml stabilizačním roztokem. Roztok IgG je uchováván při -20 až -30 C. Média, pufry Czapek-Dox médium (CDM) 1g KH2PO4 0,5 g MgSO4.7H2O 0,01 g FeSO4.7H2O 0,5 g KCl 2g NaNO3 30 g sacharóza Doplnit do 1 litru vodovodní vody, upravit ph na 6,2 Sladinový agar 20 g sladinový extrakt (= malt extract) 20 g agar Doplnit do 1 litru destilované vody Autoklávovat 20 minut při 110 C. Extrakční pufr 50 mm Tris base, 100 mm NaCl, 1 mm EDTA, 100 mm octan amonný, 2% Triton X mm dithiothreitol, Doplnit do 1000 ml destilovanou vodou, upravit ph na 8,2 (měřeno ledové při 1 C) Bikarbonátový pufr 1,59 g Na2CO3 2,93 g NaHCO3

13 0,2 g NaN3 Doplnit do 1000 ml destilovanou vodou, upravit ph = 9,6 PBS pufrovaný fyziologický roztok 8,0 g NaCl 0,2 g KH2PO4 2,9 g Na2HPO4.12H2O 0,2 g KCl Doplnit do 1 litru destilovanou vodou, adjustovat na ph 7,2-7,4 Substrátový pufr 97 ml diethanolaminu (C4H11NO2) 100 mg MgCl2 x 6 H2O 0,2 g NaN3 800 ml destilovaná voda ph nastavíme pomocí HCl % na ph 9,8 a doplníme do 1000 ml destilovanou vodou nebo použít hotový pufr od Loewe Biochemica, katalog. č. D Stabilizační pufr 0,88 g NaCl 0,5 g BSA Doplnit do 100 ml destilovanou vodou. (BSA - bovine serum albumin) Použití mikrobiologických metod Metoda reizolace P. alba a P. malicorticis z pletiv jabloní na agarových živných mediích se ukázala jako nevhodná pro rutinní diagnostiku, protože ani jedna z těchto hub běžně nevytváří ani pohlavní ani nepohlavní struktury včetně spor, čímž se výrazně snižuje možnost rozeznání uvedených druhů od dalších druhů hub žijících ve větvích a kmenech jabloní. P. alba a P. malicorticis by bylo možné identifikovat pouze na základě jiných morfologických struktur jejich vegetativního mycelia. P. alba ani P. malicorticis nevytváří na vegetativním myceliu žádné takové struktury, a proto není možné mikrobiologické kultivační metody pro spolehlivou a jasnou identifikaci použít. III) Srovnání novosti postupů oproti původní metodice, případně jejich zdůvodnění, pokud se bude jednat o novou neznámou metodiku ( 2, odst. 1, písm. a, bod 2 zákona č. 130/2002 Sb.). Dosud nebyla vypracována žádná metodika pro stanovení absence/přítomnosti Pezicula alba a P. malicorticis ve větvích a kmenech jabloní.

14 IV) Popis uplatnění metodiky, pro koho je určena, jakým způsobem bude uplatněna. Metodika slouží pro: stanovení absence/přítomnosti Pezicula alba a P. malicorticis v matečných rostlinách jabloní, hrušní a kdouloní při dovozu a vývozu tohoto materiálu do České republiky a při poskytování matečných rostlin dalším pěstitelům v rámci ČR stanovení absence/přítomnosti Pezicula alba a P. malicorticis v sadbovém materiálu jabloní, hrušní a kdouloní při dovozu a vývozu tohoto materiálu do České republiky a při poskytování sazenic rostlin dalším pěstitelům v rámci ČR stanovení absence/přítomnosti Pezicula alba a P. malicorticis ve větvích a kmenech jabloní, hrušní a kdouloní odumírajících nebo vykazujících příznaky poškození. Metodiku mohou využívat laboratoře, které jsou vybaveny pro imunodiagnostický rozbor vzorků. Jsou to jednak orgány státní správy (např. Státní rostlinolékařská správa), ale mohou to být i další pracoviště. V) Seznam použité související literatury ANONYMUS (1999). Normes OEPP. EPPO Standards. Certification schemes. Pathogentested material of Malus, Pyrus and Cydonia. EPPO Bulletin 29(3): DE JONG S. N., LEVESQUE C. A., VERKLEY G. J. M., ABELN E. C. A., RAHE J. E., BRAUN P. G. (2001): Phylogenetic relationships among Neofabraea species causing tree cankers and bull's-eye rot of apple based on DNA sequencing of ITS nuclear rdna, mitochondrial rdna, and the β-tubulin gene. - Mycol. Res., 105 (6): DUGAN F. M., GROVE G. G. and ROGERS J. D. (1993): Comparative studies of Cryptosporiopsis curvispora and C. perennans. I. Morphology and pathogenic behaviour. Mycologia, 85: GARIÉPY T. D., LÉVESQUE C. A., DE JONG S. N. and RAHE J. E. (2003): Species specific identification of the Neofabraea pathogen complex associated with pome fruits using PCR and multiplex DNA amplification. Mycological Research, 107: HARLOW E. and LANE D. (1999): Using antibodies: a laboratory manual. - Cold Spring Harbor, NY, 495 p. HENRIQUEZ J. L., SUGAR D. and SPOTTS R. A. (2004): Etiology of bull s eye rot of pear caused by Neofabraea spp. in Oregon, Washington, and California. - Plant Dis. 88: HLUCHÝ M., ACKERMNAN P., ZACHARDA M., BAGAR M., JETMAROVA E., VANEK G. (1997): Obrazový atlas chorob a škůdců ovocných dřevin a révy vinné., - Biocont Laboratory s.r.o., Brno, 36 p. JONES A. L. and ALDWINCKLE H. S. (1990): Compendium of apple and pear diseases. - APS Press, St. Paul, Minnesota, USA, 125 p. KIRK P. M., CANNON P. F., MINTER D. W. and STALPERS J. A. (eds.) (2008): Ainsworth & Bisby S Dictionary of the fungi. 10th edition Wallingford, 771 p. KŘÍŽKOVÁ-KUDLÍKOVÁ I., KRÁTKÁ J. and NOVOTNÝ D. (2006): Characterisation of polyclonal antibodies for the detection of the genus Neofabraea, In: Book of Abstracts of the "8th Conference of the European Foundation for Plant Pathology and British Society

15 for Plant Pathology Presidential Meeting 2006", 13th-17th August 2006, KVL, Frederiksberg, Denmark, p. 114 LÁNSKÝ M. (2002): Choroby a poruchy při skladování jablek., Agro, roc. VII, 1, NOVOTNÝ D. (2003): Cryptosporiopsis radicicola and Pezicula eucrita - neglected species of microscopic fungi in the Czech Republic. - Czech Mycol. 55:57-72.) VERKLEY G. J. M. (1999): A monograph of the genus Pezicula and its anamorphs. Stud. Mycol. 44:1180. VI) Seznam publikací, které předcházely metodice a byly publikovány (pokud existují), případně výstupy z určité znalosti, jestliže se jedná o originální práci. NOVOTNÝ D. (2004): Study of endophytic mycobiota of selected fruit trees with special reference to genus Pezicula (including Neofabrae) in the Czech Republic - a preliminary results, In: Book of Abstracts of the 7th Conference of the European Foundation for Plant Pathology and... "Discovery, Development and Delivery in Plant Pathology", 5th-10th September, University of Aberdeen, UK, p. 40. KŘÍŽKOVÁ-KUDLÍKOVÁ I., KRÁTKÁ J. and NOVOTNÝ D. (2006): Characterisation of polyclonal antibodies for the detection of the genus Neofabraea, In: Book of Abstracts of the "8th Conference of the European Foundation for Plant Pathology and British Society for Plant Pathology Presidential Meeting 2006", 13th-17th August 2006, KVL, Frederiksberg, Denmark, p. 114 KŘÍŽKOVÁ-KUDLÍKOVÁ I., KRÁTKÁ J., CHALUPNÍKOVÁ J., NOVOTNÝ D. (2006): Charakteristika polyklonálních protilátek pro detekci rodu Neofabraea, Mykologické listy 97: 47 NOVOTNÝ D. (2007): Houby rodu Pezicula a Glomerella a ovocné dřeviny, Mykologické listy 102: 48. NOVOTNÝ D. (2007): Příspěvek k poznání endofytické mykobioty větví a listů jabloní a jejich vztahu k fytopatogenním houbám. In: Sborník referátů z odborného semináře "Diagnostika a hodnocení chorob rostlin, se zaměřením na obilniny", , VÚRV Praha-Ruzyně, pp NOVOTNÝ D. (2007): Studium endofytických hub zemědělsky významných rostlin. In: Nováková A. (ed), Sborník příspěvků z workshopu MICROMYCO 2007, České Budějovice, pp Finančně hrazeno projektem NAZV QF 4074.

16 Autoři: Název: Mgr. Iva Křížková Ph.D, RNDr. David Novotný Ph.D., RNDr. Jiřina Krátká DrSc. Optimalizované postupy pro detekci Pezicula alba a P. malicorticis V pletivech jabloní pomocí imunochemických metod. Vydal: Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Drnovská 507, Praha 6 Ruzyně ve Výzkumném ústavu zemědělské techniky, v.v.i., Drnovská 507, Praha 6 - Ruzyně Sazba a tisk: Výzkumný ústav zemědělské techniky, v.v.i., Drnovská 507, Praha 6 - Ruzyně Náklad: 20 ks Metodika je veřejně přístupná na adrese Vyšlo v roce 2008 Vydáno bez jazykové úpravy Kontakt na autora: novotny@vurv.cz Autor titulní fotografie: RNDr. David Novotný Ph.D. Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2008 ISBN: Vydal Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. ve Výzkumném ústavu zemědělské techniky, v.v.i., 2008