LABRATRNÍ PŘÍSTRJE A PSTUPY KVANTITATIVNÍ 31 P NMR SPEKTR- SKPIE HUMINVÝCH KYSELIN FRANTIŠEK NVÁK, RICHARD HRABAL b, IVANA BARTŠVÁ b JIŘÍ KALČÍK Ústv půdní biologie AV ČR, N Sádkách 7, 370 05 České Budějovice, b NMR lbortoř, VŠCHT Prh, Technická 1905, 166 8 Prh 6 Dejvice novkf@dle.uek.cs.cz Došlo 4.7.03, přeprcováno 15.3.04, přijto 31.3.04. Klíčová slov: 31 P-NMR, difosforečnny, fosfolipidy, fosfonáty, huminové kyseliny, monoestery kyseliny fosforečné Úvod Přeměny norgnických orgnických sloučenin fosforu v přírodě jsou velmi úzce propojeny v koloběhu fosforu. Přestože některé části tohoto koloběhu byly klsickými nlytickými metodmi prostudovány poměrně detilně, mechnismy přeměn orgnického fosforu jsou známy nedosttečně, neboť většin údjů byl získán nepřímými postupy, jejichž výsledky čsto nelze jednoznčně interpretovt. Proto se postupně proszuje přímé studium různých frkcí fosforu v přírodě, především humusových kyselin, metodou 31 P NMR spektroskopie. Kvlittivně nové informce mění přežívjící názory n koloběh i dostupnost fosforu v ekosystémech mohou ovlivnit řdu oborů zákldního i plikovného výzkumu, npř. pedologii, geobotniku, lesnictví zemědělství, i přispět k řešení tk význmných problémů životního prostředí, jko je eutrofizce vod nebo sorpce dostupnost těžkých kovů v půdě. Huminové kyseliny jsou morfní polydisperzní látky žlutohnědé ž černé brvy s poměrně vysokou molekulovou hmotností. Jsou rozpustné v lklickém prostředí (0,1 M- NH), v kyselém prostředí (ph < ) se srážejí. Půdní huminové kyseliny (HK) obshují přibližně 41 57 % uhlíku, 33 54 % kyslíku, 3,5 7 % vodíku 0,7 4,5 % dusíku v bezpopelové sušině. bsh fosforu v půdních HK je poměrně nízký, běžně se pohybuje 1 okolo 800 1500 mg.kg 1, všk díky tomu, že přírodní fosfor je tvořen jediným izotopem 31 P, jehož jádro se spinem 1/ je nvíc dosttečně citlivé (má vysoký gyromgnetický poměr), poskytuje 31 P NMR spektroskopie význmné možnosti pro studium frk- cí fosforu v HK. Fulvokyseliny (FK), spolu s huminovými kyselinmi oznčovné souhrnně jko humusové kyseliny, obshují fosforu méně než HK, jejich 31 P NMR spektr všk lze rovněž úspěšně měřit. Přes poměrně nízký obsh fosforu vážou humusové kyseliny znčnou část jeho zásoby v půdě, tkže měřením 31 P NMR spekter HK získáme cenné informce o složení půdního fosforu. Zákldy pro přiřzení jednotlivých 31 P NMR bsorpčních pásů půdního orgnického fosforu položili Newmn Tte. gner 3 rozlišil v 31 P NMR spektrech čtyř HK z lesních půd 15 signálů, které přiřdil čtyřem formám orgnického fosforu (P org ). Přestože půdy byly velmi podobné, zjistil význmné rozdíly v množství i přítomnosti jednotlivých typů P org. d konce 80. let 0. století je metod 31 P NMR spektroskopie poměrně čsto využíván při studiu vzby fosforu v huminových kyselinách i různých lklických půdních extrktech, v nichž HK tvoří podsttnou složku. Mteriál metodik Huminové kyseliny byly izolovány z půdních vzorků podle trdičního schémtu (obr. 1), zloženého n deklcifikci vzorku 0,1 M-HCl extrkci roztokem 0,1 M-NH. Z lklického výluhu, odděleného od tuhé fáze centrifugcí (1000 g po dobu 30 min) filtrcí, byly HK vysráženy 0,1 M-HCl následně čištěny přesrážením nnofiltrcí. Roztok sodných solí huminových kyselin byl zmržen vysušen lyofilizcí. Převod sodných solí n kyseliny, obvykle prováděný n koloně plněné silně kyselým ktexem Dowex, není nezbytný, protože se vzorek huminových kyselin (resp. solí) před měřením 31 P NMR spekter rozpouští v ND. HK by se též částečně sorbovly n iontoměniči přitom by se mohl snížit obsh fosforu ve vzorku. HK izolovné podle tohoto schémtu jsou poměrně čisté, proto vhodné npř. pro stnovení optimálních prmetrů pro měření NMR spekter. Čsově náročná izolce všk může vést k částečné hydrolýze HK, tím ke ztrátě cenných informcí, jež lze studiem 31 P NMR spekter HK získt. Úprv postupu izolce humusových kyselin jeho srovnání s dlšími užívnými metodmi byly jedním z cílů této práce. Elementární nlýz HK byl prováděn n nlyzátoru Crlo Erb 1108. bsh celkového fosforu v HK byl stnoven po minerlizci 7% kyselinou chloristou 4. Fosfor převedený minerlizcí n orthofosforečnn byl po rekci s molybdennem monným skorbovou kyselinou stnoven spektrofotometricky jko fosfomolybdenová modř 5,6. 31 P NMR spektr byl měřen n spektrometru Bruker AMX-3 400 s prcovní frekvencí 161,986 MHz s těmito prmetry: teplot 98,15 K, průměr kyvety 36
půd < mm nebo hrbnk 0,1M-HCl; 0 h, lbor. teplot; promytí H, filtrce deklcifikovný vz. FK (frkce 1) Extrkce 0,1M NH 4 h, ultrzvuková lázeň, lbor. teplot; centrifugce 1000 g, filtrce HK + FK půd + huminy Přídvek nsyceného roztoku N S 4 0,3 h kogulce humusojílového komplexu; filtrce srženiny HK + FK Srážení HK přídvkem 0,1M HCl; Filtrce, příp. centrifugce humusojílový komplex HK FK Čištění přesrážením HK Ultrfiltrce n membráně Amicon 500.10 3 D HK humusojílový komplex Ultrfiltrce n membráně Amicon 10 3 D Promývání redestilovnou vodou HK (N soli) roztok blstních látek br. 1. Zákldní schém izolce čištění huminových kyselin 5 mm, počet jednotlivých průchodů n jedno spektrum 10 000, délk excitčního pulsu 17,0 µs (90 ), délk kvizičního čsu 0,37 s, šířk spektr 50 000 Hz, relxční prodlev T d s, širokopásmový 1 H-decoupling (zrušení interkce spinů). FID (free induction decy, zánik volné indukce) byl zprcován s rozšířením linie 10 Hz. Chemické posuny byly měřeny vůči 85% H 3 P 4, jko externímu stndrdu. Výsledky diskuse Vliv použitého extrkč ního č inidl n kvlitu spektr Pro stnovení jednotlivých frkcí orgnického fosforu v půdě 31 P NMR spektroskopií se čsto používá extrkce 0,5 M-NH. Nevýhodou tohoto postupu je extrkce méně než 50 % celkového fosforu (P t ) u některých půd 7, možnost hydrolýzy extrhovných huminových kyselin v silně 37
lklickém roztoku podobně jko u některých jiných extrkčních činidel součsná extrkce prmgnetických iontů (Fe 3+, Mn + ), které snižují rozlišení NMR spekter. Ze vzorků lpínských půd lze roztokem NH extrhovt 66 8 % P t (horizonty A) 8 51 % P t (horizonty B) 8 ; přitom 9 99 % extrhovného fosforu připdá n orgnický fosfor, vázný především v HK. Roztokem EDTA v NH byl extrhován největší podíl půdního fosforu v podzolových půdách 7 rovněž většin typů fosforu ve srovnání s roztokem 0,5 M-NH i roztokem 0,5 M-NH s přídvkem Chelexu X-100. Použití směsi NH-EDTA prvděpodobně snižuje stupeň hydrolýzy, vypočítný z poměru obshu diesterů monoesterů 7, nicméně rozlišení NMR spektr bývá výrzně horší než v přípdě jiných extrkčních činidel, protože prmgnetické ionty komplexovné EDTA zůstávjí v roztoku. Nproti tomu extrkce vzorků lesních půd směsí Chelex X-100 + NH poskytovl spektr s ostrými signály, do extrktu všk bylo převedeno pouze 3 35 % P t. Při extrkci vzorků směsí 0,5 M-NH + 0,1 M EDTA (1:1) přecházel do extrktu větší podíl Mn +, toto činidlo všk extrhovlo nejvyšší podíl půdního fosforu (71 90 %) včetně polyfosfátů. Někteří utoři 9 doporučují snížit obsh Mn + Fe 3+ v extrktu n koloně plněné Chelexem X-100 nebo přídvkem tohoto sorbentu do filtrátu; nevýhodou může být částečná sorpce humusových látek n sorbentu. Izolce reltivně čistých HK je obtížná zejmén ze vzorků, pocházejících z hlubších půdních horizontů, kde je obsh HK nízký tyto látky bývjí vázány v komplexech s jílovými minerály nebo ionty Fe 3+ Al 3+, jejichž přítomnost ve vzorku může komplikovt měření NMR spekter. Pro studium frkcí orgnického P jsou všk HK z hlubších horizontů důležité, neboť vzájemné srovnávání 31 P NMR spekter HK izolovných z jediného (většinou svrchního) horizontu půd, které nejsou příbuzné, má jen omezený význm 10. bsh blstních látek, které zvyšují obsh popelovin v HK, lze snížit čištěním nnofiltrcí npříkld n membráně Amicon PBVK nebo loužením vzorku v 3% HF. Velmi dobré výsledky u kyselých půd poskytuje postup zložený n extrkci 0,1 M-NH, podobný izolci huminových kyselin, použitý u jednotlivých horizontů podzolu 11 umožňující stnovit odděleně frkce fosforu v huminových kyselinách fulvokyselinách. Protože extrkce čištění huminových kyselin je čsově velmi náročná procedur, při níž nelze vyloučit hydrolýzu některých sloučenin fosforu, nvrhli Pnt spol. 1 dvojnásobnou čtyřhodinovou extrkci vzorku 0,4 M-NH s následným oddělením hydroxidu gelovou chromtogrfií. Extrkt odstředěný n centrifuze byl nnesen n kolonu plněnou Sephdexem G-5, kde se oddělily humusové kyseliny od NH. Eluát HK byl poté zhuštěn n vkuové odprce při 35 C. Nevýhodou postupu je strhávání větších molekul HK při centrifugci (10 000 g po dobu 40 min) sorpce části humusových kyselin n Sephdexu. Kpcit kolony je omezená při větších objemech vzorku jsou huminové látky příliš dlouho v prostředí koncentrovného roztoku NH; nvíc utory používná poměrně vysoká teplot 35 C může urychlovt eventuální hydrolytické rekce. Proto jsme modifikovli stndrdní 0 extrkci humusových kyselin tk, že ji provádíme po dobu 4 h v 0,1 M-NH. V průběhu extrkce je směs čtyřikrát vystven 15minutovému působení ultrzvuku, by se rozrušily gregáty dosáhlo vyššího výtěžku HK. Po 4 hodinách je extrkt oddělen n centrifuze při 1500 g, filtrován, přídvkem HCl je sníženo jeho ph n 11,5 je vprven do nnofiltrční cely. Zde je extrkt při lbortorní teplotě v tmosféře dusíku promýván destilovnou vodou koncentrován, přičemž se n ultrfiltrčním nástvci s membránou Amicon YM1 oddělí nízkomolekulární látky. Koncentrát je poté zmržen lyofilizován stejným postupem jko huminové kyseliny. Modifikcí tohoto postupu je jeho rozšíření o deklcifikci vzorku 0,1 M-HCl před extrkcí, jíž se odstrní ionty C +, popřípdě Fe 3+, Mn + Al 3+, které vážou část fosforu, zvýší se bsolutní množství extrhovných fosforečnnů jejich monoesterů. Tento stupeň všk má dvě nevýhody jednk vede k zániku některých minoritních signálů v 31 P NMR spektrech, prvděpodobně v důsledku hydrolýzy v kyselém prostředí, jednk může negtivně ovlivnit následnou extrkci vzorku 0,1 M-NH, protože se část hydroxidu spotřebovává n titrci půdního sorpčního komplexu, který byl při deklcifikci převeden do H + cyklu. (Tento druhý vliv je ptrný především u půd humu- b 0 15 10 5 0-5 -10-15 ppm br.. Vliv deklcifikce vzorku n kvlitu 31 P NMR spektr humusových kyselin izolovných z humusového horizontu kmbizemě; vzorek bez deklcifikce, b - vzorek před izolcí deklcifikovný; bě 31 P NMR spektr byl měřen se stejnými prmetry 38
Tbulk I Vliv způsobu izolce HK n frkční složení P v půdních huminových kyselinách; T55 trdiční způsob; T550 izolce rozšířen o působení 3% HF kvůli snížení obshu popelovin blst spektr T55 T55 T550 T550 [ppm] [%] [mg.kg 1 ] [%] [mg.kg 1 ] 15 34, 589 7,5 344 5,5 7,5 6, 107, 8 3 5,5 8,1 484 31,7 398 1 3 17,1 94 16,7 09 0 (-) 14,4 48 1,9 75 Celkem 100,0 171 100,0 154 sem chudých, kdy je třeb použít pro izolci určitého množství HK větší nvážku vzorku. Lze jej eliminovt ndbytkem roztoku NH nebo kontrolou ph.) Hlvní předností tohoto stupně je výrzné zlepšení kvlity spekter zejmén v těch přípdech, kdy půd obshuje prmgnetické ionty (kmbizemě, horizonty B podzolů), které mohou rozšířením linie výrzně zhoršit rozlišení NMR spektr (obr. ). Jk již bylo zmíněno, ve zvláštních přípdech se používá loužení huminových kyselin v 3% HF, při kterém se snižuje obsh jílových příměsí, popřípdě i Fe 3+ Al 3+ iontů z humusojílových komplexů. Přitom se rovněž snižuje obsh některých frkcí fosforu, zejmén orthofosforečnnu (viz. tb. I), popř. dlších frkcí fosforu vázných n minerální podíl. Toho lze využít ke stnovení minoritních frkcí P org, je-li obsh orthofosforečnnů v HK extrémně vysoký jejich signál překrývá osttní signály v 31 P NMR spektru. Vliv doby měření n kvlitu spekter Ztímco Newmn Tte se domnívli, že lklické extrkty půd (roztoky humusových kyselin) pro měření 31 P NMR spekter mohou být bez zntelných změn ve spektrech uloženy po dobu několik dnů, je dnes zřejmé, že se huminové látky v lklickém prostředí hydrolyzují. Hydrolýzu lze omezit zkrácením doby potřebné k příprvě čištění extrktu i zkrácením doby měření NMR spektr, největší význm všk má lyofilizce vzorku jeho rozpuštění v ND bezprostředně před měřením. Dob extrkce je dnes zprvidl 4 hodiny, krtší by již zřejmě vedl k neúplné extrkci. Jediným způsobem, jk dále omezit zkreslení výsledků eventuální hydrolýzou, je proto zkrácení doby měření. Toho lze teoreticky docílit zkrácením relxční prodlevy (viz níže) nebo snížením počtu kumulcí. b tyto postupy byly vyzkoušeny, ob všk přinesly více problémů než eventuální změny ve spektrech v důsledku hydrolýzy. Velmi mlý počet 500 kumulcí použili npř. Pnt spol. 1 Při kvntittivním vyhodnocení spekter všk ptrně v důsledku nepříznivého poměru signál/šum dospěli k obtížně interpretovtelným výsledkům. Pokud totiž měřili vzorek delší dobu (3648 kumulcí), získli spektrum s lepším poměrem signál/šum, součsně se všk podsttně zvýšil intenzit signálu, utory připisovného fosfoenolpyruvátu, poklesl intenzit signálů nukleosidmonofosfátů polynukleotidů. Pokud byl do roztoku před měřením přidán toluen, užívný v biochemii k zmezení růstu množení bktérií, intenzit signálu žádné formy fosforu se nezměnil. Autoři se pokusili vysvětlit jev biologickou ktivitou v silně lklickém extrktu během měření, nicméně ponechání roztoku po dobu h při pokojové teplotě před měřením spektr se očekávnými změnmi v intenzitě jednotlivých signálů fosforu neprojevilo. Z těchto výsledků je zřejmé, že dob měření musí být tk dlouhá, by se získlo dosttečně kvlitní spektrum, umožňující spolehlivé kvntittivní vyhodnocení; přitom je b br. 3. Vliv hydrolýzy HK v lklickém prostředí n zstoupení jednotlivých typů P v 31 P NMR spektru; vzorek měřený ihned po rozpuštění v ND, b týž vzorek, měřený 7 dnů po rozpuštění; N vloženém obrázku je detil obou spekter b 39
ovšem nezbytné, by měření neprobíhlo zbytečně dlouho, neboť by se vzorek mohl hydrolyzovt. Vliv přípdné hydrolýzy n změny v 31 P NMR spektru jsme testovli n vzorku huminové kyseliny rozpuštěné v 0,5 M-ND. Vzorek byl změřen ihned po rozpuštění poté znovu po 7 dnech. Srovnání obou spekter je n obr. 3. Hydrolýz se projevil v oblsti fosfonátů monoesterů kyseliny fosforečné. V oblsti fosfonátů (15 0,1 ppm) klesá v důsledku hydrolýzy intenzit signálu při 18,7 ppm úměrně tomu roste intenzit signálu při 0,1 ppm. Součet intenzit obou signálů všk při této změně zůstává stejný (tb. I) protože ob signály přísluší téže frkci P org, nemá hydrolýz v této oblsti vliv n informce získné ze spektr. Význm může mít při srovnávání spekter různých utorů, kdy lze indikovt výrznější stupeň rozkldu vzorku při izolci nebo před měřením, jestliže intenzit signálu u vyšších posunů je srovntelná nebo dokonce vyšší než intenzit sousedního signálu. U tkto rozloženého vzorku lze očekávt mnohem závžnější hydrolýzu mono- zejmén diesterů kyseliny orthofosforečné. Výrzně se hydrolýz HK projevuje v oblsti monoesterů kyseliny orthofosforečné. Jejich zstoupení ve spektru studovné HK se po hydrolýze snížilo ze 60, n 36,6 % při součsném nárůstu obshu orthofosforečnnů prkticky o stejnou hodnotu z 6,3 n 50,0 %. Z toho je zřejmé, že hydrolýz vzorku může velmi výrzně zkreslit získné výsledky že je nezbytné usilovt o mximální zkrácení doby, po kterou může hydrolýz probíht buď při příprvě vzorku, nebo při vlstním měření. Vzhledem k čsu, nezbytnému pro získání kvlitního spektr, lze povžovt dobu 1 h mezi rozpuštěním lyofilizovného vzorku ukončením měření spektr nvrženou pro roztok 9 v 0,5 M-ND z přijtelný kompromis. Autoři, kteří hydrolýzu u měřených vzorků nepozorovli, npř. Mkrov spol. 8, ptrně měřili vzorky při izolci ntolik hydrolyzovné, že v průběhu několikhodinového měření se již dlší rozkld neprojevil. Nše výsledky ukzují, že celý postup příprvy extrktu musí být velmi šetrný poměrně rychlý, vzorky je třeb ihned po izolci zmrzit, vysušit lyofilizcí v ND rozpouštět ž krátce před měřením spektr. Vliv ph roztoku n polohu 31 P NMR signálů Hodnot ph měřeného roztoku výrzně ovlivňuje polohu signálů v 31 P NMR spektrech. Tohoto efektu se někdy využívá v biochemii ke stnovení nitrobuněčného ph z polohy 31 P NMR signálu orthofosforečnnu. Pro měření 31 P NMR spekter HK FK v roztoku ND je optimální ph ~ 13. Pokud se vzorek HK (solí) před měřením rozpouští v poměrně koncentrovném roztoku 3 5% ND, je nezbytné po rozpuštění vzorku snížit ph roztoku přídvkem několik kpek 0,5 M-HCl n 1,8 13. Výhodnější je rozpouštět humáty sodné v 0,1 M-ND, by ph nepřekročilo hodnotu 13, protože při úprvě ph roztoku připrveného v komerčně dostupném 3 5% ND mohou nstt komplikce vyplývjící z omezené životnosti skleněné elektrody, obtížné dostupnosti pufrů pro klibrci při vysokém ph i z mlého objemu roztoku. Při ph ~ 1,8 b br. 4. Vliv ph roztoku n 31 P NMR spektrum fulvokyselin; vzorek rozpuštěný v D, ph ~ 3,8; b vzorek rozpuštěný v ND, ph ~ 1,5 jsou 31 P NMR signály monoesterů orthofosfátu poměrně dobře odděleny od signálu orthofosforečného iontu; nižší ph má nvíc příznivý vliv n zpomlení eventuální hydrolýzy vzorku v lklickém prostředí. Při ph < 1,5 se mohou signály některých inositol-fosfátů překrývt se signálem orthofosfátu. 31 P NMR spektr téže fulvokyseliny, měřená v D při ph ~ 4 v 5% ND při ph přibližně 1,5, jsou porovnán n obr. 4. Vliv relxč ní prodlevy n zstoupení jednotlivých typů fosforu Získání NMR spektr použitelného pro kvntittivní účely vyžduje dodržet zákldní podmínku úplnou relxci spinu tomů fosforu v průběhu měření. Protože splnění tohoto poždvku znmená úměrné prodloužení doby měření, volí řd utorů relxční prodlevu krtší než 1 s, v extrémních přípdech 8,13 jen 0, s, což se všk negtivně promítá do intenzit jednotlivých signálů, snižuje přesnost stnovení poměrného zstoupení jednotlivých typů fosforu prkticky znemožňuje srovnání výsledků různých utorů. Pro stnovení vhodné relxční prodlevy jsme použili vzorek velmi čisté huminové kyseliny, jejíž 31 P NMR spektrum bylo chrkteristické přítomností signálů většiny význmných frkcí i velmi nízkým šumem, což je nezbytný předpokld pro kvntittivní vyhodnocení. Homogenizovný vzorek huminové kyseliny byl rozdělen n tři podvzorky, které byly postupně rozpuštěny v 5% ND byl měřen jejich 31 P NMR spektr při relxční prodlevě 0, s, 0,6 s nebo,0 s. Reltivní intenzity jednotlivých pásů v 31 P NMR spektru HK se s rostoucí relxční prodlevou T d zvyšují 40
rel. intenzit, % rel. intenzit / % 150 100 50 3-5,5ppm 0 - (-) ppm 5,5-7,5 pp 15-0 ppm 1-3 ppm 0 0,0 0,5 1,0 1,5,0,5 T d /s T d, s br. 5. Závislost reltivní intenzity jednotlivých signálů v 31 P NMR spektru velmi čisté HK, izolovné z podzolové půdy, n zvolené relxční prodlevě T d; 3-5,5 ppm, 0-(-) ppm, 5,5-7,5 ppm, 15-0 ppm, 1-3 ppm (viz obr. 5) je tedy zřejmé, že použití prodlev T d < s vede k nerovnoměrnému zkreslení obshu jednotlivých typů fosforu. Protože měření HK bylo u všech tří relxčních prodlev prováděno po stejnou celkovou dobu (tedy s různým počtem kumulcí), výsledky nejsou ovlivněny přípdnou hydrolýzou vzorku. Měřená HK všk byl připrvován trdičním postupem, v jehož průběhu je vzorek zbven znčné části prmgnetických iontů. Tím lze dosáhnout kvlitnějšího spektr, neboť nedochází k rozšiřování linie, součsně se všk s vyšší čistotou preprátu prodlužuje čs spin-mřížkové relxce T 1. Protože používání různých extrkčních činidel vede u různých půd k znčně odlišné koncentrci prmgnetických iontů v měřeném extrktu, je obtížné doporučit univerzální relxční prodlevu pro měření 31 P NMR spekter lklických půdních extrktů. ptimální postup by měl zhrnovt vedle stnovení koncentrce prmgnetických iontů v extrktu rovněž stnovení relxční prodlevy pro nově studovný půdní typ nebo horizont. Při velmi nízkém obshu těchto iontů ve vzorku lze dosáhnout zkrácení relxční prodlevy přídvkem iontů Cr 3+, tento postup se všk u huminových látek nepoužívá. Je-li nopk obsh prmgnetických iontů vysoký, je třeb zvolit jiné extrkční činidlo nebo úprvu extrktu před měřením. Práce různých utorů se liší rovněž v dlších prmetrech měření spektr, zejmén dobou kvizice [0,1 s (cit. 8,13 ), 0,8 s (cit. 14 ), 1,63 s (cit. 9 )], úhlem pulsu (30, 45 nebo 90 ), přípdně použitím širokopásmového 1 H decouplingu rozšíření linie při zprcování spektr (0 0 Hz). P ř i ř zení signálů v 31 P NMR spektru huminových látek N rozdíl od 13 C NMR spekter huminových látek, u nichž se jednotlivé signály (pásy) vzájemně překrývjí, je v 31 P NMR spektrech huminových látek při vhodně zvoleném ph většin pásů dobře seprovných. Chemické posuny se u 31 P NMR spekter huminových látek zprvidl vzthují k externímu stndrdu 85 % H 3 P 4. Přiřzení jednotlivých signálů (pásů) se provádí podle literárních údjů, přípdně se ověřuje přídvkem stndrdu (obshujícího si 1 mg P) do měřeného vzorku, by se vyloučil vliv ph nebo iontové síly, n něž jsou některé signály citlivé. Hlvními frkcemi fosforu v HK FK jsou především monoestery diestery kyseliny orthofosforečné (fosfátu) norgnické orthofosforečnny. Méně zstoupeny bývjí difosforečnny, fosfonáty, polyfosforečnny diestery kyseliny orthofosforečné vázné n schridy. Ve spektrech některých HK se vyskytují mxim, která dosud nebyl přiřzen, nebo přiřzení není jednoznčné. Podobně není zcel jednoznčné ni přesné rozdělení integrčních mezí pro překrývjící se pásy, především kvůli závislosti chemického posunu n podmínkách měření (ph). Tto nejednoznčnost může znesndnit srovnávání výsledků různých utorů, při nlýze srovnání vlstních spekter se všk neprojeví. Přehled signálů v 31 P NMR spektrech huminových kyselin jejich přiřzení jsou shrnuty v tbulce II. Signály 31 P NMR spekter huminových kyselin ( obecně půdního orgnického fosforu) se ncházejí v oblsti posunů, přibližně vymezené intervlem 1 ppm ž 1 ppm. Většinou nepříliš intenzívní mxim v intervlu posunů 15 0 ppm přísluší fosfonátům, sloučeninám s vzbou fosforu n tom uhlíku. Kyselin (-minoethyl)fosfonová (obr. 6, I) s mximem při 0 ppm je ptrně produktem hydrolýzy složitějších fosfonátů, nejspíše lipidů obshujících tuto kyselinu (fosfonolipidů), které se ve spektrech HK projevují signálem okolo 19 ppm. V důsledku této hydrolýzy jsou pro fosfonáty typická dvě ostrá mxim při uvedených posunech, někteří utoři všk pozorovli pouze jedno mximum. stré nepříliš intenzívní mximum při 1 ppm bývá pozorováno vzácně dosud nebylo přiřze- Tbulk II Přiřzení 31 P NMR signálů v roztocích huminových kyselin v ND; ph ~ 1,8 Signál [ppm] Přiřzení 15 0 fosfonáty ~1 vyskytuje se vzácně, ptrně romtické fosfonáty 5,5 7 norgnický orthofosforečnn 3 5,5 monoestery kyseliny orthofosforečné (inositolfosfáty, estery kyseliny orthofosforečné se schridy, mononukleotidy) 1,5 3 neidentifikováno, zřejmě mono- diestery kyseliny orthofosforečné 1,5 (-) převážně diestery kyseliny orthofosforečné (fosfolipidy, DNA RNA) -3,5 (-5) difosforečnny koncové tomy P norgnických polyfosforečnnů -6 (-3) norgnické orgnické (ATP, ADP) polyfosforečnny 41
P(H) P(H) (H) P P(H) H N ( ) P(H) 1 P(H) H H 3 H H H I H H 5 6 4 H H P(H) P(H) II III H N ( ) P(H) IV H CR P R C H 4 P R C H VII (H) P C CH 1 R C C R P(H) V CR 3 1 R C HN R C C R 1 P + N(CH 3 ) 3 1 C R - N N N VI P VIII C CH NH 3 + IX H γ P H β P H α P H H NH N N N N H H H H H (H) P H H H H H H X H P H P H n P H H XI XII br. 6. Strukturní vzorce studovných látek: kyselin (-minoethyl)fosfonová (I), myo-inositol-hexkis(fosfát) (kys. fytová) (II), D- glukos-6-fosfát (III), -minoethyl-dihydrogenfosfát (IV),, 3 -dicylglycerol-1-fosfát (kyseliny fosftidové) (V), L-α-fosftidylcholin (L -α-lecithin) (VI), difosftidylglycerol (krdiolipin) (VII), fosftidylserin (VIII), fosfoenolpyruvát (IX), inosin-5 -monofosfát (X), denosin-5 -trifosfát (ATP) (XI), kyselin polyfosforečná (XII) 4
c b STD HK br. 7. Vliv ph HK n posun signálu orthofosforečnnů v 31 P NMR spektru; 31 P NMR spektrum HK s přídvkem KH P 4 v roztoku ND při ph 1,5; b 31 P NMR spektrum KH P 4 při ph ~ 7; c 31 P NMR spektrum KH P 4 při ph ~ 1,5; STD externí stndrd (85% H 3 P 4 ) no, snd jde o fosfonáty romtické povhy. Intenzívní signál s vrcholem při posunu 6 ppm přísluší norgnickému orthofosforečnnu. Guggenberger spol. 13 pozorovli mximum signálu orthofosforečnnu při 6,5 ppm, ptrně vlivem vyššího ph roztoku. Pnt spol. 1 přiřdili toto mximum fosfoenolpyruvátům, tento názor je všk ve světové litertuře ojedinělý. Přiřzení tohoto pásu, význmného z interpretčních důvodů, jsme ověřili přídvkem dihydrogenfosforečnnu sodného do roztoku HK v ND. dpovídjící signál měl mximum při 6,0 ppm (obr. 7). Signál orthofosforečnnu se obvykle integruje v oblsti posunů 5,5 7 ppm. Přesná hrnice se sousedním pásem (signálem) monoesterů kyseliny orthofosforečné se obvykle volí v minimu mezi oběm signály; npříkld Mkrov spol. 8 zvolili tuto hrnici u 5,8 ppm. Jiným řešením je softwrová dekonvoluce jednotlivých pásů, rozlišených druhou derivcí spektr, u 31 P NMR spekter HK se všk ztím používá ojediněle. Sm přítomnost orthofosforečnnů v huminových kyselinách je do jisté míry překvpivá, neboť extrkce HK i FK je poměrně drstická zhrnuje mj. důkldnou dilýzu proti destilovné vodě nebo nnofiltrci n membránách z vyššího tlku, při nichž je většin nízkomolekulárních látek vyloučen do dilyzátu (filtrátu). Protože hydrolýzu esterů kyseliny fosforečné n orthofosforečnn v lklickém roztoku můžeme při rychlé izolci i měření znedbt, je přítomnost orthofosforečnnu v HK zřejmě důsledkem vzby (sorpce) iontů P 4 3 mkromolekulmi humusových kyselin, ptrně z tvorby komplexních vzeb s ionty Fe 3+, C + nebo Al 3+, které tvoří součást humusojílových komplexů. N podobný způsob vzby můžeme soudit i ze smotného chemického posunu signálu P 4 3 v přítomnosti HK, který je vyšší než posun orthofosforečnnu v ND při stejném ph (obr. 7). V této oblsti mohou omezeně přispívt tké některé monoestery kyseliny orthofosforečné, signál při 5,8 5,9 ppm poskytuje npříkld tom fosforu, vázný v poloze myoinositol-hexkis(fosfátu) (obr. 6, II). Zprvidl všk lze obě ostrá mxim dobře oddělit, nebo je příspěvek monoesterů k signálu orthofosforečnnů nevýznmný. Výrzný pás v oblsti 3 ž přibližně 5,5 ppm, obvykle s několik mximy, přísluší monoesterům kyseliny orthofosforečné, zejmén jejím esterům s cyklickými hexitoly (inositol-fosfátům) se schridy, dále rovněž mononukleotidům pod. Tyto monoestery jsou poměrně rezistentní vůči rozkldu mohou se v půdě kumulovt; někdy bývjí hlvní frkcí půdního orgnického fosforu. Exktní identifikce látek, jimž přísluší pásy v této oblsti, nebyl dosud u půdních extrktů proveden, zstoupení uvedených skupin monoesterů se pro různé HK liší. Podle čsto citovných trdičních prcí Anderson 15 Islm Ahmed 1 byl z dominntní orgnickou sloučeninu fosforu v půdách povžován myo-inositol-hexkis(fosfát) (obr. 6, II, kyselin fytová), jejíž smíšená vápento-hořečntá sůl je znám pod triviálním názvem fytin. Dlším v půdě běžným stereoizomerem je scyllo-inositol-hexkis(fosfát), syntetizovný řdou půdních mikroorgnismů. Inositol-fosfáty, zejmén hexkisfosfáty inositolu, převžují v HK z hlubších horizontů podzolu 14, v jiných HK se všk mohou vyskytnout tké nukleosid-monofosfáty (denosinmonofosfát, 4,5 ppm), D-glukos-6-fosfát (obr. 6, III, 5,3 ppm), glycerol-1-fosfát (4,7 ppm) pod., přípdně mohou inositol-hexkisfosfáty chybět 1. V této oblsti poskytují signál rovněž některé produkty štěpení diesterů kyseliny fosforečné, npř. (-minoethyl)-fosfát (obr. 6, IV, 4,7 ppm). Nepříliš výrzné signály tvořící pás v oblsti 1,5 3 ppm nebyly některými utory ve spektrech HK vůbec pozorovány 14 ; jiné práce signály v této oblsti popisují, všk jednoznčná identifikce tohoto typu tomů fosforu v HK dosud nebyl proveden. Fosftidylethnolmin poskytuje signál při 1,6 ppm, některé monoestery H 3 P 4 se schridy mjí signál mezi 1,5 3 ppm. Kyseliny teichoové (diestery kyseliny orthofosforečné), význmné složky npř. buněčných stěn bkterií, poskytují rezonnční mxim mezi 1 ppm 13, spíše jim všk přísluší mximum při 1,9 ppm, ztímco signály pozorovné při 1,5 1,7 ppm ptří fosfolipidům mikrobiálního nebo rostlinného původu 16. Hrniční hodnot signálu mezi touto frkcí frkcí zhrnující monoestery kyseliny fosforečné zřejmě závisí n ph roztoku tké snd n povze huminové kyseliny. Rndll spol. 17 povžují z hrnici mezi signály těchto frkcí,5 ppm, Cde-Menun Preston 7 jiní hodnotu 3,0, kterou používáme ve svých prcích. Diesterům kyseliny orthofosforečné, k nimž ptří fosfolipidy nukleové kyseliny, náleží mxim v oblsti posunů cc 1,5 ž. Molekul fosfolipidů (fosftidů) 43
obshuje lkoholickou složku (glycerol), n níž je vázán kyselin orthofosforečná v podobě kyseliny fosftidové (obr. 6, V; R 1, R = lkyly s 9 ž 17 tomy C), dále je přítomn vyšší mstná kyselin zásditá orgnická složk (nejčstěji cholin nebo kolmin). Do této skupiny složených lipidů, esterů vícesytných lkoholů s mstnými kyselinmi kyselinou fosforečnou, ptří důležité přírodní látky: lecithiny (obr. 6, VI), krdiolipin (obr. 6, VII), kefliny, fosftidylserin (obr. 6, VIII), sfingomyeliny plzmlogeny. Asi 1 % fosfolipidů připdá n inositolfosfolipidy, npř. fosftidylinositol-4,5-bisfosfát, přítomný v buněčných membránách. Nejběžnějšími fosfolipidy v půdě 18 jsou fosftidylcholin rostlinného původu s 31 P NMR signálem při 0,7 ppm fosftidylethnolmin původu mikrobiálního se signálem při 1,7 ppm. V roztoku CHCl 3 /CH 3 H jsou jejich 31 P chemické posuny nižší (fosftidylethnolmin 0,03 ppm, fosftidylcholin 0,84 ppm) 3. Kyseliny ribonukleové (RNA, posun při 0,5 ppm) nejsou v půdním prostředí zvláště v lklických extrktech stbilní, v průběhu lklické extrkce se rozkládjí n mononukleotidy, proto k signálům diesterů kyseliny orthofosforečné nepřispívjí 16. Stbilnější kyseliny deoxyribonukleové (DNA, posun při 0,3 ppm) jsou prvděpodobně hlvními sloučeninmi, jimž v lklických extrktech přísluší mximum při 0 ppm. Středně intenzívní signál s mximem při 1,5 ppm, pozorovný ve spektrech některých HK 8, se nevyskytuje v extrktech mikrobiálních kultur ni rostlinného mteriálu 16 nebyl ztím přiřzen. Z nepříliš početné množiny monoesterů kyseliny orthofosforečné, jejichž 31 P NMR signály neleží v oblsti 3 5,5 ppm, jsou význmnější fosfoenolpyruvát (obr. 6, IX) s posunem okolo 0,1 0, ppm inosin-fosfát (obr. 6, X, posun 0,7 ppm). V oblsti posunů 3,5 ž 5 ppm poskytují chrkteristický středně intenzívní signál difosforečnny; ve spektrech HK všk nebývá pozorován prvidelně. Do této oblsti mohou zshovt tké signály P α orgnických polyfosfátů i koncových tomů P z řetězců norgnických polyfosforečnnů, jejich příspěvek všk zprvidl nebývá výrzný. Minoritní signály v oblsti od 6 do 3 ppm ptří polyfosforečnnům, z nichž nejznámější denosin-trifosfát (ATP) denosin-difosfát (ADP) všk v mimobuněčné formě podléhjí v půdě rychlému rozkldu ve spektrech HK nebo lklických extrktů bývjí pozorovány vzácně. Zdá se, že n stbilizci ATP v půdě by se mohl podílet tvorb komplexů s ktionty kovů 19. Pro ATP jsou chrkteristická tři mxim s posuny okolo 4,7, 9,8 0,3 ppm. Pokud někteří utoři přiřdili pozorovný izolovný signál při 0 ppm P β denosin-trifosfátu, jde o evidentní omyl, neboť u ATP by tento signál byl doprovázen dvojicí stejně intenzívních signálů s posuny okolo 4,7 9,8 ppm (P α P γ, obr. 6, XI). V 31 P NMR spektrech norgnických polyfosforečnnů (obr. 6, XII) chybí signál chrkteristický pro orgnicky vázný fosfát (P C, posun 9 ž 10 ppm), v závislosti n délce řetězce se v nich vyskytuje několik signálů s posuny 19 ž 1 ppm i signály skupin P (H) n koncích polyfosfátových řetězců v oblsti chrkteristické pro difosforečnny ( 4 ž 5 ppm). Závěr Souhrnně lze konsttovt, že součsná úroveň znlostí činí z 31 P NMR spektroskopie spolehlivý nástroj pro nlýzu sloučenin (forem) fosforu v huminových kyselinách i lklických půdních extrktech, který při dodržení stndrdních podmínek izolce měření poskytuje reprodukovtelné kvntittivní výsledky. Dlší výzkum zřejmě přinese upřesnění informcí o složení jednotlivých frkcí fosforu, což může znčně npomoci při interpretci 31 P NMR spekter huminových kyselin nebo lklických extrktů pro potřeby studi koloběhu fosforu v přírodě. Součsně s přesnější interpretcí spekter lze očekávt tké jejich preciznější kvntittivní vyhodnocování zejmén náhrdu prosté integrce jednotlivých oblstí spektr dekonvolucí pásů. Tto práce vznikl jko součást projektu č. 06/0/1504, podporovného Grntovou genturou České republiky, výzkumného plánu ÚPB AV ČR č. Z6 066 911. LITERATURA 1. Novák F., Klčík J., Klousková N., v knize: Metody studi fosforu dlších elementů (K, C, N, Mg) v půdě. (Klčík J., Mcháček V., ed.), str. 51. ÚPB AV ČR, České Budějovice 1995.. Newmn R. H., Tte K. R.: Commun. Sci. Plnt Anl. 11, 835 (1980). 3. gner G.: Geoderm 9, 15 (1983). 4. Sommers L. E., Nelson D. W.: Soil Sci. Soc. Am. Proc. 36, 90 (197). 5. Murphy, J., Riley, J. P.: Anl. Chim. Act 7, 31 (196). 6. Wtnbe F. S., lsen S. R.: Soil Sci. Soc. Am. Proc. 9, 677 (1965). 7. Cde-Menun B. J., Preston C. M.: Soil Sci. 161, 770 (1996). 8. Mkrov M. I., Mlyshev T.I., Humier L., Alt H.G., Zech W.: Geoderm 80, 61 (1997). 9. Robinson J. S., Johnston C. T., Reddy K. R.: Soil Sci. 163, 705 (1998). 10. Chen Z., Pwluk S.: Geoderm 65, 173 (1995). 11. Novák F., Klčík J., Hrbl R.: Silv Gbret 5, 7 (000). 1. Pnt H. K., Wrmn P. R., Nowk J.: Commun. Soil Sci. Plnt Anl. 30, 757 (1999). 13. Guggenberger G., Christensen B. T., Rubek G., Zech W.: Eur. J. Soil Sci. 47, 605 (1996). 14. Di, K. H., Dvid, M. B., Vnce, G. F., Krzyszowsk, A. J.: Soil Sci. Soc. Am. J. 60, 1943 (1996). 15. Anderson G., v knize: 8 th Interntionl Congress Soil Science, Buchrest, Romni, sv. IV, str. 563, Buchrest 1964. 16. Mkrov M. I., Humier L., Zech W.: Soil Biol. Biochem. 34, 1467 (00). 17. Rndll E.W., Mhieu N., Ivnov G. I.: Geoderm 44
80, 307 (1997). 18. Kowlenko C. G., Mc Kerchner R. B.: Cn. J. Soil Sci. 51, 19 (1971). 19. Meller-Hrel Y., Argmn A., Ben-Bsht D., Nvon G., Ahronowitz Y., Gutnick D.: Cn. J. Microbiol. 48, 835 (1997). 0. Ponomrev V. V., Plotnikov T. A.: v knize: Agrochimičeskije metody issledovnij počv. (A. V. Sokolov, ed.), str. 47. Nuk, Moskv 1975. 1. Islm A., Ahmed B.: J. Soil Sci. 4, 193 (1973).. Pvlíková H., Černý J.: Chem. Listy 89, 403 (1995). 3. Glonek T., v knize: Phosphorus-31 NMR Spectrl Properties in Compound Chrcteriztion nd Structurl Anlysis. (Quin L. D., Verkde J. G., ed.), str. 83. VCH Publishers, New York 1994. F. Novák, R. Hrbl b, I. Brtošová b, nd J. Klčík ( Institute of Soil Biology, Acdemy of Sciences of the Czech Republic, České Budějovice, b NMR Lbortory, Institute of Chemicl Technology, Prgue): Quntittive 31 P NMR Spectroscopy of Humic Acids The pper dels with quntittive spects of solution 31 P NMR spectr of soil humic cids (HA). The present level of knowledge mkes the 31 P NMR spectroscopy relible tool for nlysis of P types in HA nd/or lkline soil extrcts. bserving stndrd conditions of HA isoltion nd spectr mesurement, the 31 P NMR spectroscopy gives reproducible nd quntittive results, importnt for studying phosphorus trnsformtions in ecosystems. Further reserch will probbly provide more ccurte informtion on composition of individul P frctions of HA, which cn be substntilly helpful in interprettion of 31 P NMR spectr. Simultneously, with more exct interprettion of the spectr, we cn expect more precise quntittive nlysis of their spectr in prticulr replcement of integrtion of spectrl bnds by their deconvolution. Ústv lékřské chemie biochemie LF UP nbízí doktorské studium poždovné vzdělání zkušenosti: VŠ s titulem Mgr., práce v lbortoři, znlost ngličtiny, vážný zájem o vědeckou práci, smosttnost, týmová práce; nástup 1.9.005 n zákldě výsledků přijímcího řízení, které proběhne v červnu 005; stipendium n zákldě pltných předpisů. Uzávěrk přihlášek n míst doktorndů je 31.5.005. Doktorndi budou vybráni pouze n zákldě výsledků přijímcího řízení. Přihlášky n míst doktorndů jsou k dispozici n webovských stránkách LF UP. Podrobnější informce o vypsných témtech jsou n www.medchem.upol.cz ve složce PhD progrm. Prof. RNDr. MUDr. Vilím Šimánek, DrSc. přednost Ústvu lékřské chemie biochemie Hněvotínská 3 775 15 lomouc 45