Využití Sequence Capture v diagnostice svalových onemocnění Kristýna Stehlíková Daniela Skálová Lenka Fajkusová Centrum molekulární biologie a genové terapie IHOK, FN Brno Sekce vrozených genetických poruch
Diagnostika svalových onemocnění - postižení kosterního svalstva Neuromuskulární onemocnění vzácná onemocnění (<1:2000), která postihují některou z částí neuromuskulárního systému: - svaly, periferní nervy, spojení mezi nervy a svaly, motorické neurony - Všechna onemocnění jsou progresivní, vedou ke svalové slabosti a úbytku svalů - Nástup onemocnění od narození až do pozdějšího věku - Délka přežití - různorodá - Pacienti často trpí respiračními a srdečními obtížemi - Výsledná svalová slabost vede ke křečím, ztuhlosti, deformitám kloubů a chronické bolesti
Diagnóza svalové dystrofie je založena na klinických nálezech, EMG, MR, výsledcích svalové biopsie, biochemických nálezech (zvýšená hodnota kreatin fosfokinázy) IH: Normální exprese α-dystroglykanu v kontrolní vzorku IH: Sekundární deficit α-dystroglykanu v LGMD2I 1. Fenotypové projevy neuromuskulárních chorob mohou být společné pro nemoci asociované s mutacemi v různých genech a často nelze rozlišit, o jaký konkrétní typ svalové dystrofie se jedná. 2. Mutace v jednom genu různé fenotypové projevy u pacienta je vyšetřováno několik genů bez detekované mutace možnosti: Sangerovo sekvenování dalších genů časová a finanční náročnost jiná metoda NGS + Sequence Capture
Vybrané nemoci (geny): - Duchennova svalová dystrofie (gen DMD) - Emery-Dreifussova svalová dystrofie (geny EMD, FHL1, LMNA) - pletencové svalové dystrofie, dominantní (geny MYOT, LMNA, CAV3) - pletencové svalové dystrofie, recesivní (geny CAPN3, DYSF, SGCG, SGCA, SGCB, SGCD, TCAP, TRIM32, FKRP, TTN, POMT1, ANO5, FKTN, POMT2, POMGNT1) - kongenitální svalové dystrofie (LAMA2, LARGE, SEPN1, COL6A1, COL6A2, COL6A3, ITGA7, DNM2) - kongenitální myopatie, distální myopatie, and další myopatie (NEB, TPM3, ACTA1, TPM2, TNNT1, CFL2, RYR, MTM1, BIN, CRYAB, DES, LAMP2, PABPN1) 42 genů, 1020 exonů V případě analýzy všech exonů a přilehlých intronových oblastí vybraných genů je potřeba sekvenovat cca 300 000 bází na pacienta.
Sequence Capture 1. Třídenní hybridizace + sekvenování GS Junior 2. Double capture + sekvenování GS Junior 3. Double capture + sekvenování MiSeq NimbleGen SeqCap EZ Library LR User s Guide SeqCap EZ Library SR User s Guide
Příprava knihovny NimbleGen SeqCap EZ Library LR User s Guide SeqCap EZ Library SR User s Guide 1. Štěpení gen. DNA (nebulizace, sonikace) 2. Fragment End Polishing 3. Ligace Adaptorů 4. Odstranění krátkých fragmentů 5. Pre-Captured LM-PCR 6. Hybridizace 3 dny double capture hybridizace přes noc, PCR, hybridizace přes noc 7. Odstranění nenavázaných úseků DNA SeqCap EZ Capture Beads Streptavidin Dynabeads 8. Post-Captured LM-PCR 9. Přečištění 10. Kontrola knihovny
Sekvenování GS Junior 1.Třídenní hybridizace 2. Double capture protokol NimbleGen SeqCap EZ Library LR User s Guide Příprava knihovny před hybridizací štěpení + 1 den Příprava vzorku pro sekvenování 1,5 dne Třídenní hybridizace 3 pacienti coverage: 20x - 95%; 100x - 12% ready v cílové oblasti: 58 %; prům.coverage: 70x 2 dvojice pacientů v hybridizační reakci: ready v cílové oblasti: 40 % nedostatečná coverage nutno sekvenovat 2x Double capture protokol 2 pacienti coverage 20x 95;94 %; 100x 53;63 % ready v cílové oblasti: 89;90 %; prům.coverage: 107x;126x 12 dvojic pacientů v hybridizační reakci: coverage 20x 65 %; 100x 5 % ready v cílové oblasti: 83 %; prům.coverage: 33x Sekvenování GS Junior DNA: wells 0,3:1 Passed Filter Wells: 144 000 217 000
Sekvenování MiSeq Double capture protokol SeqCap EZ Library SR User s Guide Příprava knihovny před hybridizací štěpení + 1 den Příprava vzorku pro sekvenování 0,5 dne 1. sekvenační běh 24 pacientů 6 pacientů v jedné hybridizační reakci coverage: 20x - 99%; 100x - 95% ready v cílové oblasti: 98 %; prům.coverage: 393x Smíchání před hybridizací koncentrace knihovny (Nanodrop) Smíchání před sekvenací - qpcr -KAPA quantification kit, Roche lightcycler II - Mgr. Filip Párdy (CEITEC MU)
Vyhodnocení SeqPilot (JSI medical systems) Dosud: 57 pacientů 27 s uzavřeným výsledkem
Library LR + GS Junior Library SR + MiSeq Obsah GC párů 70,5 %
Poděkování Roche Dr. Jaroslav Vohánka Dr. Xavier Miró Dr. Viktor Horváth CEITEC MU Brno Centrální laboratoř - Genomika Dr. Boris Tichý Mgr. Filip Párdy Mgr. Nikola Tom
Děkuji za pozornost