II Mikroskopie II M. Viková LCAM DTM FT TU Liberec, martina.vikova@tul.cz
Osvětlovac tlovací soustava I Výsledkem Köhlerova nastavení je rovnoměrné a maximální osvětlení průhledného preparátu, ležícího v předmětové rovině. Současně by měla být dosažena nejlepší kombinace mezi rozlišovací schopností a kontrastem. August Köhler (1866-1948) Příklad nastavení KÖHLEROVA osvětlení 1. Umístíme preparát na stolek mikroskopu a zaostříme s objektivem 20x. 2. Uzavřeme polní clonu světelného pole 3. Kondenzor zvyšujeme nebo snižujeme tak dlouho, až vidíme obraz clony světelného pole ostře ohraničený. To nastává většinou v případě, když je kondenzor značně vysoko. 4. Clonu světelného pole pak otevřeme co nejvíc, aby se okraje jejího obrazu dotýkaly okraje zorného pole. 5. Pokud obraz clony neleží uprostřed světelného pole, posunujeme jej (centrovacími šrouby kondenzoru) do středu zorného pole tak dlouho, až se všemi svými vrcholy dotýká obvodu. 6. Vyjmeme z tubusu okulár. V otvoru vidíme osvětlenou výstupní pupilu objektivu. Uzavíráme aperturní clonu kondenzoru, aby zůstalo osvětleno ještě 2/3 průměru výstupní pupily objektivu. Má-li kondenzor stupnici numerické apertury, nastavíme na ní hodnotu přibližně ¾ numerické apertury objektivu.
Osvětlovac tlovací soustava II
Koherentní osvětlen tlení I 2) Koherentní osvětlení (osvětlení rovnoběžným svazkem) F P 1) Z každého bodu preparátu se šíří intenzivní paprsky v původním směru a slabé rozptýlené záření do ostatních směrů. 2) Pro vyvolání kontrastu je vhodná metoda temného pole na průchod a různé modifikace interferenčního kontrastu. 3) Jako zdroj světla slouží často štěrbina, kterou lze ovládat prostorovou koherenci pro interferenční kontrast, ale jen ve směru kolmém na štěrbinu.
Temné pole I Princip metody temného pole v procházejícím světle π terčík π P1 P1 P2 koherentní osvětlení preparátu slabě rozptylující preparát objektiv P2 stínítko 1) Když vložíme terčík do ohniska bez preparátu, nebude stínítko osvětleno. Vznikne temné pole. 2) Když vložíme do předmětové roviny preparát (terčík mimo ohnisko), vznikne jeho obraz ve světlem poli, ale s malým kontrastem. Kontrast teď pomáhají vytvářet jen rozptýlené paprsky, jdoucí objektivem. 3) Vložením terčíku do ohniska vznikne kontrastní obraz preparátu v temném poli. Vytvářejí jej jen rozptýlené paprsky, které prošly čočkou. 4) Když terčík neabsorbuje, ale jen posune fázi o 1/4 periody, pak na stínítku vznikne tzv. fázový kontrast (interferují rozptýlené paprsky s nerozptýlenými).
Temné pole II Abbeův kondenzor s clonou Světlé pole Temné pole Kardioidní kondenzor
Fázový kontrast Použití na preparáty způsobující fázovou modulaci světla (vliv indexu lomu). V ohniskové rovině kondenzoru je prstencová fázová clonka V obrazové ohniskové rovině objektivu je prstencová fázová destička Použití na velmi tenké preparáty Seřízení splynutí obrazu clonky s fázovou destičkou
Polarizační mikroskop I Schéma polarizačního mikroskopu je v podstatě stejné jako projektoru (zařízení pro fotoelasticimetrii). Kontrast obrazu vzniká interferencí řádného a mimořádného paprsku. π σ π P P kondenzor polarizátor p1 dvojlomný preparát objektiv p2 analyzátor rovina σ pro názorné sledování amplitud vlny E 1) Použije se koherentní osvětlení preparátu. 2) U polarizátorů p1 a p2 jsou známy směry propustnosti vektorů E. 3) Optická osa leží přibližně v rovině povrchu preparátu.
Polarizační mikroskop II Elementární vlákno lnu při natočení o 45 Elementární vlákno lnu při natočení o 90
Polarizační mikroskop III Klasické PET vlákno Krystalické PET vlákno pro fotonické aplikace Vlákna azbestu
Polarizační mikroskop IV Fragment bavlněného vlákna - úplně zkřížené polarizační filtry Fragment bavlněného vlákna - částečně zkřížené polarizační filtry Snímky nahoře dokumentují využití polarizační mikroskopie ve výzkumu, v tomto případě Turínského plátna.
Nomarského diferenciáln lní interferenční kontrast DIC I Uspořádání optických prvků - Rozdíl oproti klasickému SM: Vložení páru Wollastonových hranolů a páru zkřížených polarizátorů. Přednosti: Kolem detailů předmětu není v obraze rušivá aura jako u Fázového kontrastu Při malých hloubkách ostrosti lze rozlišit stupňovité vrstvy ~ nm Chod paprsků: 1. Lineární polarizace světla polarizátorem 2. Chod paprsků dvojlomým děličem Wollastonova typu (směr polarizace svírá s optickými osami hranolu 45 o ) 3. Druhý Wollastonův hranol, shodně orientovaný s prvním je umístěn v zadní ohniskové rovině objektivu 4. Druhý (zkřížený) polarizátor
Popis funkce Wollastonova hranolu Hranol rozdělí původně lineárně polarizované zobrazující světlo na dvě vzájemně kolmo polarizované složky (řádný a mimořádný paprsek), které z děliče vystupují různým směrem. Úhlový rozdíl paprsků bývá 10-4 radiánu. Světlé pole DIC Laterální posuv obrazů (bez horního W. hranolu) je velmi malý ~ 0,1 μm (pod rozlišovací mezí). V důsledku změny tloušťky preparátu je efekt Wollastonova hranolu různý (různé fázové rozdíly mezi řádnými a mimořádnými paprsky). Úkolem kompenzačního Wollastonova hranolu (horní) je učinit fázový rozdíl řádného a mimořádného paprsku stejný v celé ploše obrazu (Φ 0 ). Tuto hodnotu lze měnit posouváním hranolů vůči sobě (vodorovně)
Nomarského diferenciáln lní interferenční kontrast DIC II 5x 10x 20x 50x
Hoffmanův modulační kontrast - HMC Výhody oproti Nomarského DIC: podobné zobrazení při nižší ceně doplňkových komponent možnost pozorovat objekty i na dvojlomných podložkách (např. buněčné kultury v plastových kultivačních kyvetách) Modulátor = maska s TG = 15% (kryje se s obrazem štěrbiny), TD < 1 %, TB = 100%. V místech gradientu optických tlouštěk se paprsky odchylují a jednotlivé příspěvky vytvoří v zadní ohniskové rovině dílčí obrazy štěrbiny.
Mikroskopie v dopadajícím m světle světl tlé pole Köhlerovo nastavení pro mikroskopii v dopadajícím světle (světlé pole) Osvětlovací soustava použití pro větší zvětšení, světlo dopadá na preparát přes objektiv; v tubusu je umístěno excentricky sklíčko nebo hranol. Ideální je Köhlerovo uspořádání. Použití pro neprůhledné vzorky, luminiscenční mikroskopie.
Horní osvětlení preparátu Viková, M. : MIKROSKOPIE II Duté osvětlovac tlovací svazky-temn temné pole v dopadajícím m světle I kondensor obrazotvorný svazek zrcadlo s otvorem posuv zdroje objektiv mikroskopu preparát P 1) Tato modifikace horního světlení využívá k osvětlení okrajových svazků a zrcadla s otvorem (duté osvětlovací svazky). 2) Jiné soustavy používají pro horní osvětlení polopropustná zrcadla. 3) Osvětlení preparátu bývá částečně koherentní (závisí na velikosti plošného zdroje a jeho poloze vzhledem k ohnisku kondenzoru).
Duté osvětlovac tlovací svazky-temn temné pole v dopadajícím m světle II Příze s krystalky vysrážené finální úpravy EPI světlé pole Příze s krystalky vysrážené finální úpravy EPI temné pole
Fluorescenční mikroskopie I Luminiscencí se nazývá emise světla látkou, která je způsobená světlem, teplem nebo chemicky, při které se neuvolňuje teplo. Tento jev nastává, když pomocí stimulace elektronů v látce, přejdou tyto elektrony do vyšších energetických stavů (excitované stavy). Po této excitaci dojde při přechodu elektronů na základní úroveň k uvolnění světelné energie.
Studium materiálů vyvolávaj vajícíchch fluorescenci v přirozeném stavu (autofluorescence) chlorofyl a další přírodní složky po dodání fluorescenční značky (fluorochromu) sekundární fluorescence - využití v imunologii apod. - v textilu např. studium kvality směsování a distribuce vláken, kontaminace směsí
Fluorescenční mikroskopie II
Fluorescenční mikroskopie III
Nevýhody fluorescenční mikroskopie Obecnou komplikací fluorescenční mikroskopie je to, že fluorofory jsou intenzivním zářením rozkládány a ztrácejí schopnost absorpce a emise tzv. fotobleaching.
Fluorescence lifetime microscopy (FLIM) I Doba trvání fluorescence 2 Metody: Porovnání časových intervalů Porovnání frekvencí
Fluorescence lifetime microscopy (FLIM) II Fluorescenční mikroskopie FLIM mikroskopie
Fluorescence lifetime microscopy (FLIM) III 12 snímků časového záznamu dohasínání fluorescence Výsledný obraz vzniklý složením intenzitního a časového záznamu