Kultivace bakterií na

Kultivace bakterií na pevných půdáchp Prezentace pro obor: Všeobecná sestra Jan Smíšek ÚLM 3. LF UK 2008

Základy kultivace Bakterie v mikrobiologii kultivujeme (pěstujeme) na tekutých a pevných živných půdáchp Tekuté půdy se skládaj dají ze směsi si živin rozpuštěných ve vodě Pevné půdy se skládaj dají ze směsi si živin obohacujících ch agarový gel

Základy kultivace Na tekutých půdáchp Jedná se o jednoduchém m i složit itější roztoky živin a růstových r faktorů Používaj vají se zejména k pomožen ení bakterií pro účely další diagnostiky Patří mezi něn bujón n (masový vývar), masopeptonová voda (pepton je směs natrávených AMK) a další

Základy kultivace Na pevných půdáchp Nejčast astěji uchovávaných vaných v Petriho miskách tvoří bakterie nakupení biomasy tzv. kolonie Kolonie je pomnožen ená skupina bakterií pocházej zející často z jedné bakterie nebo pevného seskupení několika bakterií (CFU colony formy unit) Taková skupina bakterií je nejen jednoho druhu, ale má i společné vlastnosti a tvoří reprezentativní vzorek populace mikroba Tato čistá kultura je nezbytná pro další vyšet etřování konkrétn tních vlastností izolovaného mikroba

Kolonie Ukázka kolonií Micrococcus luteus

Morfologie kolonií Kolonie na agaru mají často poměrn rně typickou morfologii v závislosti z na svém m druhovém m původup složen ení půdy a okolnostech kultivace

Hodnocení morfologie kolonií Velikost kolonií Drobné méně než 1mm Malé 1mm Středn ední 2-33 mm Velké 5mm a vícev

Hodnocení morfologie kolonií Tvar kolonií Okrouhlý Laločnatý Obláčkovitý Okraje kolonie Rovné Vroubkované Vykousané

Hodnocení morfologie kolonií Povrch Hladký Lesklý Matný Drsný Vrstevnatý Zrnitý

Hodnocení morfologie kolonií Barva kolonie Šedobílá většina baktéri rií

Hodnocení morfologie kolonií Barva kolonie Závisí na kultivační půdě diagnostické půdy obsahují indikátor, který difunduje do bakterií a v závislosti z na jejich ph mění svou barvu

Hodnocení morfologie kolonií Barva kolonie Závisí na pigmentech, které některé bakterie produkují

Hodnocení morfologie kolonií Konzistence kolonie Mazlavá hlenovitá Odpovídá tzv. M růstové fázi spojené s tvorbou pouzdra Drsná (suchá) Odpovídá R růstové fázi Hladká Odpovídá S růstové fázi (běž ěžný růst) r Kolonie je vrostlá do agaru Odpovídá D růstové fázi

Hodnocení morfologie kolonií Zápach kolonie Příjemná vůně (Pseudomonas) Fekáln lní zápach Amoniakový zápachz Plísňový zápachz Kyselý zápachz Indiferentní bez vůněv a zápachuz pachu

Hodnocení morfologie kolonií Okolí kolonie Obvykle beze změny Někdy změna barvy Hlavně u diagnostických půdp změna ph => změna barvy Krevní agar Rozklad hemoglobinu Alfa hemolýza viridace - tvoří se meziprodukty» Zelenohnědé zbarvení Beta hemolýza úplný rozklad projasnění půdy Gama hemolýza hemoglobin beze změny Hemolýza patří mezi významné diagnostické znaky

Souhrn morfologie kolonií Morfologie kolonií je geneticky determinována na Variace morfotypu však v závisz visí na vnější ších podmínk nkách, mezi něžn patří zejména Obsah živin v půděp A hustota půdy p (agaru) Bakterie žijící ve společenstv enství (kolonii) jsou více v rezistentní proti vnější ším nepříznivým podmínk nkám

Podmínky kultivace Dostatek živin (zdroj N, C) Vlhkost (pro příjem p živin) Ideáln lní teplota pro většinu v 37 C může e se pohybovat od velmi nízkých n aža po značně vysoké Optimáln lní ph běžné ph 7-7.27 7.2 (ale u laktobacilů 3 a např.. u cholery 8) Optimáln lní atmosféra vzhledem ke vztahu ke kyslíku ku aerobní,, anaerobní, striktně či i fakultativně

Rozdělení půd dle účelu Půdy univerzáln lní neboli základnz kladní Slouží pouze k pomnožen ení mikrobů Půdy diagnostické Obsahují indikátory, které obvykle měním barvu v závislosti z na změně podmínek okolí (nejčast astěji ph) v důsledku d pochodů vyvolaných mikroby Podle odlišných vlastností poté můžeme odlišovat ovat jednotlivé mikroby

Rozdělení půd dle účelu Půdy selektivní Potlačuj ují růst nežádouc doucích ch mikrobů Půdy selektivně diagnostické Sdružuj ují v sobě vlastnosti obou předchozp edchozích skupin Půdy speciáln lní Slouží pro kultivaci jediného konkrétn tního druhu mikroba

Rozdělení půd dle složení Definované syntetické půdy Přesné chemické složen ení jednotlivých půdp V budoucnu zřejmz ejmě převládnou snaha o standardizaci kultivačních postupů dodávaj vají se v práš ášku od výrobců Nedefinované polosyntetické půdy Vznikají přidáním m daného množstv ství materiálu přírodního původu p plné krve, krvinek, sérových bílkovin b atd.

Agar Je základnz kladní nosnou strukturou většiny v pevných půd) p Skládá se ze dvou složek Agarózy a Agaropektinu Vyrábí se z řasy Agar-Agar Chaluha, která roste v Pacifiku

Agar Příprava: Namočen ení,, uvařen ení a úprava ph přidávají se jednotlivé složky živné půdy Ještě horká tekutá směs s se nalévá na Petriho misky kde chladnutím m tuhne Po vychladnutí se na něj n j můžm ůže e očkovat o mikrobiáln lní preparát (V současn asné době se užu tímto způsobem agar nepřipravuje, je součást stí směsi si konkrétn tní půdy tato směs s se pouze rozvaří a vylévá na Petriho misky)

Očkování na pevné půdy Inoculum vytvoříme ho krouživým či rovnoběž ěžným pohybem bakteriologickou kličkou kou z kapky substrátu tu Průběž ěžně sterilizovanou kličkou kou rozočkujeme substrát do dlouhých čar Po několika n sterilizováních kličky ky je substrát t značně nařed eděn a na konci čar zůstz stávají pouze jednotlivé bakterie, které tvoří samostatné kolonie, které můžeme pozorovat

Živný agar Živný (masopeptonový) agar (ŽA,( MPA) Základní směs agar obohacený bujónem Pěstují se na něm n m nenáro ročné bakterie Obvykle se používá spíš íše e jako základ z pro přípravu pravu složit itějších půdp

Živný agar

Krevní agar Krevní agar (KA) Je nejpoužívan vanějším m pevnou půdoup Vyrábí se přidp idáním m beraních krvinek k chladnoucím m agaru (56ºC) Slouží pro zachycení Gram + bakterií Je částečně diagnostickou půdou mohou se na němn projevit hemolytické bakterie

Krevní agar

Čokoládový agar Čokoládový agar (ČA)( Vyrábí se podobně jako KA přidp idáním m beraních krvinek k agaru (ten mám však vyšší teplotu 80ºC) a tak dojde k hemolýze Ta způsob sobí čokoládové zbarvení Používá se pro pěstovp stování náročnějších baktéri rií Neisseria a Haemophilus

Čokoládový agar

Lewinthalův agar Lewinthalův v agar (LA) Připravuje se stejně jako ČA, ale před p nalitím m na Petriho misku se přefiltruje p přes p jemný filtr, který zachytí cytoplazmatické membrány zhemolyzovaných krvinek Tím m se pro bakterie přístup p k živinám usnadní,, což způsob sobí lepší růst LA patří mezi nejvýživn ivnější půdy obsahuje NAD a hemin je vhodný pro záchyt z Haemophilů

Lewinthalův agar

McConkyho agar McConkyho půda/agar p (MCA) Diagnostická půda pro enterobakterie Složen ení: ŽA A + laktóza + Na 2 SO 3 + indikátor Můžeme na nín rozdělit enterobakterie (Salmonely, Shigely) ) podle toho zda zkvašuj ují laktózu změna ph změna barvy kolonie z růžové na červenou

McConkyho agar

DC Agar Desoxycholátov tová půda/agar (DC) Selektivně diagnostická půda, určen ená pro enterobakterie. Gram + bakterie zde nerostou. Složen ení: ŽA A + citrátový tový roztok + desoxycholát t sodný + laktóza + neutráln lní červeň Bakterie zkvašuj ující laktózu vyrostou na DC agaru v jasně červených koloniích Bakterie produkující H 2 S vyrostou v černých koloniích

DC Agar

WB Agar Wilson-Blairova půda/agar p (WB) Selektivně diagnostická půda na které nerostou Gram + bakterie Složen ení: ŽA A + Bismut-sulfidový sulfidový roztok + brilantová zeleň Salmonely na této t to půděp vysráží Bi a rostou v černých koloniích Ostatní enterobakterie vyrostou v šedomodrých koloniích Gram + bakterie na tétot to půdě nevyrostou

WB Agar

Claubergova půda Claubergova půda/agar p (CA) Selektivně diagnostická půda Složen ení: ŽA A + glycerinovaná krev + cystein + vodní modř + metachromová žluť + teluričitan itan draselný (KTe 4 ) Slouží k záchytuz Corynebacterium diphtheriae Ta při p i růstu r vyredukuje Te z KTe 4 jasně černé zbarvení kolonií. Na podobném m principu funguje Tinsdalův v agar

Claubergova půda

Sabouraudův agar Sabouraudův v agar (SA) Speciáln lní půda používaj vající se pro kvasinkové mikroorganismy. Složen ení: ŽA A + maltóza (nebo dextróza) + pepton (AMK výtažek) Pěstujeme na nín Kandidy Smetanově bílé kolonie Jsou cítit c po droždí

Sabouraudův agar

LJHA Löwenstein-Jensen-Holmova půda p (LJHA) Speciáln lní půda pro pěstovp stování Mykobakterií Složen ení: ŽA A + asparagin + glycerin + škrob + čerstvé vejce + malachitová zeleň Na rozdíl l od jiných půd p d se nalévá většinou do zkumavek, kde se nechává šikmo ztuhnout Mycobacterium tuberculosis na této t to půděp roste v žlutavých koloniích