CHARAKTERIZACE LIPOFILNÍCH ANTIOXIDANTŮ V LUPINĚ (Lupinus sp.)

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI Fakulta přírodovědecká Katedra analytické chemie CHARAKTERIZACE LIPOFILNÍCH ANTIOXIDANTŮ V LUPINĚ (Lupinus sp.) DIPLOMOVÁ PRÁCE Autor práce: Studijní obor: Vedoucí diplomové práce: Jitka Čamková Analytická chemie doc. RNDr. David Jirovský, Ph.D. Olomouc 2014

SOUHRN Tato práce se zabývá charakterizací lipofilních antioxidantů v lupině (Lupinus sp.). Analyzován byl olej získaný z bobů lupiny andské (Lupinus mutabilis sweet), která se vyznačuje vysokou výživnou hodnotou jedlých semen. V lupinovém oleji byly stanoveny karotenoidy (β-karoten, lutein, zeaxantin) a tokoferoly (α-tokoferol, γ-tokoferol, δ-tokoferol). Tyto látky jsou významnými antioxidanty poskytující buněčným strukturám ochranu proti volným radikálům a nežádoucím reakcím. Pro úpravu vzorku oleje byly testovány dvě extrakční metody, a to extrakce kapalina-kapalina a extrakce tuhou fází (SPE). Pro předběžnou identifikaci karotenoidů a tokoferolů v získaných extraktech byla použita tenkovrstvá kapalinová chromatografie (TLC). K separaci byla použita mobilní fáze o složení hexan : aceton : triethylamin; 10 : 4 :1 (v/v/v). Skvrny po TLC separaci byly identifikovány pod UV lampou při vlnových délkách 366 nm (karotenoidy) a 254 nm (tokoferoly). K analýze antioxidantů byla použita vysokoúčinná kapalinová chromatografie v systému reverzních fází (RP-LC), která umožňovala použití coulometrické detekce. Pro analýzu karotenoidů byla použita kolona Macherey-Nagel (3 µm) 125 x 2 mm a mobilní fáze o složení 50 mmol/l dihydrogenfosforečnan sodný (ph 4,4) : acetonitril; 55 : 45 (v/v). Pro analýzu tokoferolů byla použita kolona Zorbax C8 (5 µm) 150 x 4,6 mm a mobilní fáze o složení 20 mmol/l mravenčan amonný (ph 4,47) : metanol; 95 : 5 (v/v). K detekci byl použit elektrochemický detektor Coulochem III (ESA, Inc.), který se sestával z coulometrické cely (Model 5010, ESA Inc.) s dvěma průtočnými elektrodami z porézního grafitického uhlíku. Pracovní potenciály byly zvoleny +550 a +600 mv (vs. Pd/H 2 ) pro karotenoidy a +650 a +700 mv (vs. Pd/H 2 ) pro tokoferoly. Mimo RP-LC byl pro analýzu studovaných látek použit také systém normálních fází (NP-LC). Pro separaci analytů byla použita kolona Tessek Separon (7 µm) 250 x 4 mm, mobilní fáze o složení hexan : isopropylalkohol; 95 : 5 (v/v) pro karotenoidy, resp. hexan : isopropylalkohol; 97 : 3 (v/v) pro tokoferoly. Analyty byly detekovány pomocí UV-VIS detektoru (Shimadzu SPD 10-A VP) při vlnových délkách 450 nm pro karotenoidy a 200 nm pro tokoferoly. Tokoferoly byly také detekovány pomocí fluorescenčního detektoru (Agilent 1200 Series) při vlnových délkách 295 nm (excitační) a 330 nm (emisní). Na základě získaných dat byly jednotlivé analyty identifikovány a kvantifikovány v lupinovém oleji.

SUMMARY This diploma thesis is focused on the characterization of lipophilic antioxidants in lupine (Lupinus sp.). An analyzed oil was obtained from the seeds of Andean Lupine (Lupinus mutabilis sweet), which has been characterized by high nutritional value. In lupine oil were analyzed carotenoids (β-carotene, lutein, zeaxanthin) and tocopherols (α-tocopherol, γ-tocopherol, δ-tocopherol), that rank among the important antioxidants providing protection against free radicals and undesirable reaction. The sample pretreatment was carried on by using two pre-concentration methods including liquid-liquid and solid phase extraction (SPE). Preliminary experiments were based on the using of the thin layer chromatography (TLC) working in normal phase system with mobile phase composed of hexane : acetone : triethylamine; 10 : 4 : 1 (v/v/v). Separated spots were detected under UV light at 366 nm for carotenoids and 254 nm for tocopherols. Carotenoids and tocopherols were analyzed by using RP-LC with electrochemical detection. A Macherey-Nagel column (125 x 2 mm, 3µm), mobile phase consisting of monosodium phosphate (c=50 mmol/l, ph 4,4) : acetonitrile 55:45 (v/v) were used for separation of carotenoids. Zorbax C8 column (150 x 4,6 mm, 5µm) and mobile phase composed of ammonium formate (c=20 mmol/l, ph 4,47) : methanol; 95 : 5 (v/v) were used for separation of selected tocopherols. A Coulochem III electrochemical detector equipped with a coulometric cell (Model 5010, Esa Inc.) containing two flow-through electrodes made of porous carbon were used. The potential setting on channels were either + 500 mv and 650 mv (vs. Pd/H2) for carotenoids or +650 mv and +700 mv (vs. Pd/H2) for tocopherols detection. The antioxidants were also separated in normal phase system, consisting of Tessek Separon column (250 x 4 mm, 7µm) and two mobile phases. Mobile phase composed of hexane : isopropyl alcohol; 95:5 (v/v) were used for carotenoids and mobile phase consisting of hexane : isopropyl alcohol; 97:3 (v/v) were used for tocopherols separation. The analytes were detected by using UV-VIS detector (Shimadzu SPD 10-A VP) at 450 nm for carotenoids and 200 nm for tocopherols, that were also detected by fluorescence detector (Agilent 1200 Series) at 295 nm excitation and 330 nm emission wavelenght. According to the obtained data, the particular analytes were identified and quantified in lupine oil.

Prohlašuji, že jsem tuto práci vypracovala samostatně. Veškeré literární prameny a informace, které jsem v práci využila, jsou v seznamu použité literatury. Souhlasím s tím, že práce je prezenčně zpřístupněna v knihovně Katedry analytické chemie, Přírodovědecké fakulty, Univerzity Palackého v Olomouci. V Olomouci dne... vlastnoruční podpis

Děkuji svému vedoucímu diplomové práce, doc. RNDr. Davidovi Jirovskému, Ph.D. za poskytnutí zajímavého námětu práce, odborné vedení, cenné rady, připomínky a čas, který mi věnoval při konzultacích. Poděkování patří také Mgr. Zdence Bartošové za cenné rady a čas, který mi věnovala při práci v laboratoři.

OBSAH 1. Úvod... 1 2. Teoretická část... 2 2.1 Lupina (Lupinus sp.)... 2 2.1.1 Chemické složení lupiny a její účinky... 3 2.1.2 Využití... 4 2.2 Stanovované lipofilní antioxidanty... 6 2.2.1 Karotenoidy... 6 2.2.2 Vitamín E... 14 2.3 Metody izolace lipofilních látek... 16 2.3.1 Extrakce kapalina kapalina... 16 2.3.2 Extrakce tuhou fází (SPE)... 16 2.4 Metody stanovení lipofilních látek... 21 2.4.1 Kapalinová chromatografie... 21 3. Experimentální část... 34 3.1 Chemikále... 34 3.2 Přístrojové vybavení... 34 3.3 Vzorek... 35 3.4 Pracovní postupy... 35 3.4.1 Příprava standardů... 35 3.4.2 Metody extrakce lupinového oleje... 36 3.4.3 Metody stanovení... 37 4. Výsledky a diskuze... 40 4.1 Tenkovrstvá kapalinová chromatografie (TLC)... 40 4.2 Separace v systému reverzních fází (RP-LC)... 43 4.3 Separace v systému normálních fází (NP-LC)... 46 4.3.1 NP-LC s UV-VIS detekcí... 46 4.3.2 NP-LC s fluorescenční detekcí... 51 4.4 Porovnání SPE extrakcí... 53 5. Závěr... 54 6. Seznam použitých zkratek... 55 7. Literatura... 56

1. Úvod Lupina, patřící do čeledi bobovitých rostlin, se stala díky vysokému obsahu bílkovin a vlákniny důležitou součástí výživy nejen zvířat, ale i zdravé lidské stravy. Vzhledem k tomu, že je lupina nenáročná na pěstování a má vysokou výživovou hodnotu, mohla by v budoucnu hrát významnou roli při řešení problémů s nasycením obyvatelstva třetího světa 1,2. Předkládaná práce se zabývá charakterizací hlavních lipofilních antioxidantů v lupině (Lupinus sp.). Analyzovanými lipofilními antioxidanty jsou karotenoidy (lutein, zeaxantin, β-karoten) a tokoferoly (α-tokoferol, γ-tokoferol, δ-tokoferol). Experimentální část diplomové práce se zabývá identifikací a stanovením hlavních antioxidantů v lupinovém oleji. K tomuto účelu byla využita celá řada analytických přístupů a metod. Dílčím úkolem zadané práce byla volba vhodné extrakční techniky. Izolace analytů ze vzorku je totiž důležitou a nedílnou součástí téměř každé analýzy. Při řešení úkolu byly testovány extrakce typu kapalina-kapalina a extrakce tuhou fází (SPE), jenž se řadí mezi běžně užívané extrakční postupy. Významná část diplomové práce se zabývá hledáním vhodných podmínek pro separaci analytů vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) s odlišnými typy detekčních technik. K výběru podmínek přispěla také tenkovrstvá kapalinová chromatografie (TLC), která sloužila k základní charakterizaci jednotlivých vzorků před samotnou HPLC analýzou. HPLC separace byla prováděna jednak v systému reverzních fází ve spojení s coulometrickou detekcí, a také v systému normálních fází za použití UV-VIS a fluorescenční detekce. 1

2. Teoretická část 2.1 Lupina (Lupinus sp.) Lupina je rostlina z čeledi bobovitých (Fabaceae), dorůstající výšky 50 až 160 cm. Listy má dlanitě dělené do 9 až 18 četných úzkých lístků, které jsou na rubu chlupaté. Jejím květem je asi 40 cm dlouhý hrozen barvy tmavě modré, fialové, růžové, žluté nebo bílé. Plodem je lusk 2,5 cm dlouhý obsahující několik zploštělých semen. Semena jsou kruhově nepravidelná mající krémovou barvu. Lupinu lze členit na trvalky a jednoletky, kvetoucí v období od června do září 1,2,3,4. Rod lupiny je velmi rozsáhlý, existuje asi čtyři sta druhů této byliny. Mezi nejznámější druhy patří: lupina úzkolistá (Lupinus angustifolius) Obr. 1, lupina žlutá (Lupinus luteus), lupina bílá (Lupinus albus) a lupina mnoholistá (Lupinus polyphyllus) 5,6. Obr. 1 Lupina úzkolistá 7 2

Lupina pochází z oblasti Středozemního moře, Ameriky a východní Afriky. Postupem času se z ní stala planá rostlina rostoucí téměř všude. Jelikož má lupina schopnost ve svých kořenech zadržovat vodu, může přežít i ve špatném životním prostředí, jako jsou např. neplodné půdy, hluboká písčitá prostředí a špatné klima. Roste převážně na okrajích lesů a cest, mýtinách, řídkých lesních porostech a v suchých polích. Preferuje půdy neutrální až kyselé, nevápnité a vyžaduje přímé světlo 2,6. 2.1.1 Chemické složení lupiny a její účinky Lupina se vyznačuje vysokým obsahem bílkovin, přibližně 37 %, a touto hodnotou se vyrovnává sóji. Její semena obsahují pouze 10 % tuků, zatímco sója až dvojnásobek. Hmotnost lupiny je navíc z 13 % tvořena zdravou vlákninou, což je zdaleka nejvyšší množství ve srovnání s ostatními luštěninami 2. Semena lupiny obsahují vyšší množství rozpustných cukrů než jiné luštěniny. Je v nich také přítomno nepatrné množství škrobu a vyšší koncentrace nerozpustných neškrobových polysacharidů 5. Hlavními zásobními proteiny lupiny jsou globuliny a albuminy tvořící asi jednu čtvrtinu proteinu 8. Semena také obsahují nezbytné aminokyseliny, zejména jsou považovány za dobrý zdroj lysinu a obecně jsou chudé na methionin, cystein a treonin. I když lupina patří k luštěninám, má ve svých semenech značné množství oleje. Vyznačuje se vyváženým složením mastných kyselin, kdy 10 % tvoří nasycené mastné kyseliny, a dalších 90 % je tvořeno nenasycenými mastnými kyselinami (olejová, linolová, linolenová). Lupina má v porovnání s ostatními luštěninami nižší úroveň přítomnosti nežádoucích složek, jako je kyselina fytová, oligosacharidy, inhibitory trypsinu, saponiny a lektiny 5. Lupina je také bohatá na minerály (draslík, hořčík, fosfor, sodík, vápník, mangan) a vitamíny (thiamin, riboflavin, vitamín C) 9. Semena lupiny obsahují i fytochemikálie s antioxidační aktivitou, jako jsou polyfenoly, především taniny a flavonoidy 5. Dále obsahuje průměrné množství karotenoidů: lutein a zeaxantin, β-karoten, tokoferoly a jiné důležité bioaktivní složky významné pro člověka a zvířata 9. Lupina se vyznačuje obsahem chinolizidinových alkaloidů, které způsobují hořkost a toxicitu semen. Jsou to například: lupanin, lupinin, spartein, hydroxylupanin, monolupanin, arginin a další 5,10. Tyto alkaloidy mohou způsobovat akutní toxicitu nebo mohou mít teratogenní účinky na hospodářská zvířata. Silně poškozují játra, ledviny, nervový systém 3

i srdce. Příznakem otravy je slinění a nevolnost provázená zvracením. Dalšími příznaky jsou obtížné polykání, křeče, neklid a poruchy srdečního rytmu. Smrt při otravě nastává ochrnutím dýchacích svalů a udušení oběti za plného vědomí 7,11,12. Avšak některé odrůdy obsahují i velmi malá množství hořkých alkaloidů. Jsou známé jako sladké lupiny a patří mezi ně: lupina bílá, úzkolistá, žlutá a vyšlechtěná lupina andská (Lupinus mutabilis). Vzhledem k jejich nízkému obsahu hořkých a potenciálně toxických alkaloidů neexistuje riziko toxicity u zvířat a lidí 2,6. 2.1.2 Využití Lupina je ekonomicky a zemědělsky cenná rostlina. Mnohdy je pěstována kvůli zlepšení kvality půdy, protože má schopnost ji obohacovat dusíkatými sloučeninami. Je schopna během jednoho pěstebního období dát do půdy přes 200 kg dusíku na hektar, řadí se tedy mezi významné zelené hnojivo 1,7. Absorbuje také velké množství pesticidů a dalších jedů obsažených v půdě 2,5. Lupina je považována za cennou přísadu lidské stravy, hlavně kvůli vysokému obsahu bílkovin a nízkému obsahu oleje. Pro své nutriční a dietní vlastnosti může vyhovovat lidem snažících se o zdravý životní styl. Má schopnost snižovat hladinu cholesterolu a požívání potravin obsahující lupinu je spojeno s prevencí diabetu, obezity a kardiovaskulárních onemocnění. Také se s lupinou počítá jako s bylinou, která může pomoci nasytit populaci zemí třetího světa 2,9,13. Velkou výhodou lupiny je její schopnost odstraňovat nežádoucí toxiny, proto je široce používána v potravinářství 1. Některé druhy semen se praží a používají se jako mouka nebo náhražka kávy. Mouka je vhodná do pekařských směsí či k výrobě těstovin. Její další výhodou je, že neobsahuje lepek, tudíž se používá jako přísada do bezlepkových potravin. Z vlčího bobu se dále vyrábí náhražka kravského mléka, kojenecké výživy nebo bílkovinná náhražka masa tofu 2,5. Lupina se také přidává do živočišné výživy, kdy čtyřicet procent sklizně semen této byliny se používá jako přísada do krmiv pro hospodářská zvířata. Dále se lupiny využívá v kosmetickém průmyslu k výrobě pleťových masek pro oživení unavené pleti a na mastnou pleť 1,5,6. 4

V současnosti je největším světovým producentem a vývozcem semen lupiny Austrálie, která zajišťuje 80 až 85 % světové produkce. Mezi nejvýznamnější pěstitelské oblasti v Evropě patří Francie, Německo, Polsko, Španělsko, Rusko a Ukrajina 9. 5

2.2 Stanovované lipofilní antioxidanty Antioxidanty jsou látky, které si organismus může vytvářet sám (jejich aktivita a množství je dáno geneticky), avšak nejčastěji jsou získávány z potravin. Antioxidační kapacita je definována jako schopnost sloučenin řídit oxidační pochody v organismu, poskytovat buněčným strukturám ochranu proti volným radikálům (zejména kyslíku a dusíku) a zabraňovat nežádoucím reakcím. Antioxidanty převádějí aktivní kyslíkové radikály na nereaktivní nebo méně reaktivní formy 14,15. Mezi antioxidační systémy patří antioxidační enzymy, tj. katalázy, glutathionperoxidázy, glutathion-s-transferázy, superoxiddismutázy a neenzymatické substráty (kyselina lipoová, koenzym Q, bilirubin, vitamín C, vitamín E, flavonoidy, karotenoidy, ). Úlohu v antioxidačním působení mají i některé prvky např. železo, měď, zinek a jiné 15. Antioxidanty dělíme na hydrofilní (vitamín C, selen, kyselina močová, bioflavonoidy, ) a lipofilní (vitamín E, ubichinon Q 10, ). Mezi lipofilní antioxidanty se také řadí vitamín A, který se v přírodě vyskytuje ve dvou formách: retinol a β-karoten. Retinol lidský organismus získává z živočišné potravy (játra, tučné ryby, sýr, žloutek, máslo). Je nezbytný pro buněčný vývoj, růst, imunitní funkce a zrak 16. Jak již bylo zmíněno, lidské tělo získává antioxidanty potravou. Největší množství těchto látek je v čaji, vínu, mase, vejcích, ovoci, zelenině, celozrnných obilovinách a dalších komoditách. Antioxidační látky v potravinách hrají důležitou úlohu z hlediska ochrany zdraví. Snižují riziko chronických onemocnění, včetně rakoviny a srdečních onemocnění 17. Funkci antioxidantů je nezbytné chápat jako celek. Konečný efekt je dán řadou interakcí jednotlivých složek, tedy pokud bude mít tělo dostatek například zniku, selenu či vitamínu E a nedostatkové množství vitamínu C, nebude antioxidační systém dostatečně funkční 14,15. 2.2.1 Karotenoidy Karotenoidy jsou skupina přírodních barviv obsažených v rostlinách, kterým poskytují jejich charakteristické zbarvení: žluté až červené (α-karoten a β-karoten), oranžové (β-kryptoxantin), tmavě zelené (lutein) a tomatové (lykopen) 18,19. Avšak nejsou zodpovědné jen za barevnost rostlin, ovoce a zeleniny, ale také zbarvují například korýše, hmyz, ryby a 6

peří ptáků. V současné době je známo okolo 700 karotenoidů, nicméně pouze 40 z nich je přítomno v typické lidské stravě 20,21. Karotenoidy jsou v tucích rozpustné sloučeniny, jejichž základem je acyklický isoprenoidní skelet lykopenu C 40, který je klasifikován jako tetraterpen 18,21. Odlišnost karotenoidů závisí na základní struktuře, která zahrnuje systém konjugovaných dvojných vazeb. Centrální řetězec může nést cyklické koncové skupiny, které mohou být substituované funkční skupinou obsahující kyslík. Struktura karotenoidů ovlivňuje jejich antioxidační aktivitu. Karotenoidy mají své charakteristické barvy díky schopnosti absorbovat světlo o určité vlnové délce. Dělíme je do dvou skupin a to na karoteny, které obsahují pouze atomy uhlíku a vodíku (α-karoten, β-karoten, δ-karoten, 15-cis-β-karoten, 13-cis-β-karoten, 9-cis-β-karoten, lykopen, ) a xanthofyly, mající ve své struktuře alespoň jeden atom kyslíku (lutein, zeaxantin a β-kryptoxantin, astaxanthin, kapsanthin, kantaxantin, echinenon, ) (Obr. 2). Karotenoidy α-karoten, β-karoten a β-kryptoxantin jsou prekurzory vitamínu A 19,20,22. Karotenoidy mohou syntetizovat pouze bakterie, rostliny, řasy a houby 20. Hlavní úlohou karotenoidů v rostlinách je ochrana chlorofylu před jeho oxidací 21. V rostlinách se vyskytují ve formě trans- geometrických izomerů, ale tepelné zpracování může vyvolat izomeraci trans-karotenoidů na cis-karotenoidy. U karotenoidů obsažených v potravinách může docházet vlivem ph, teploty a slunečního záření ke změnám, které vedou ke změně barvy potraviny, ale hlavně ke změně nutričních hodnot potraviny 18. Jelikož lidský organismus není schopen karotenoidy syntetizovat, je odkázán na jejich přísun pouze potravou. 90 % karotenoidů v potravě tvoří β-karoten, α-karoten, lykopen, lutein a kryptoxantin 18. Vysoké koncentrace luteinu a zeaxantinu jsou obsažené i ve vaječném žloutku 22. Antioxidační aktivita karotenoidů je v důsledku reaktivity se singletním kyslíkem a volnými kyslíkovými radikály schopna potlačit oxidativní stres u lidí, který je vyvolán právě reaktivními kyslíkovými radikály (ROS) 18. Karotenoidy jsou zodpovědné za prospěšné vlastnosti ovoce a zeleniny v prevenci proti nemocem, jako jsou kardiovaskulární onemocnění (β-karoten, lykopen), různé druhy rakoviny (β-karoten, lykopen), poruchy vidění (lutein, zeaxantin) a ostatní chronická onemocnění 19,20,21,23. 7

Obr. 2 Strukturní vzorce karotenoidů 2.2.1.1 β-karoten β-karoten je rostlinný pigment a je jedním z nejvýznamnějších karotenoidů. Je významným antioxidantem a od ostatních karotenoidů se liší funkčně i strukturálně. Chemický vzorec β-karotenu je C 40 H 56 se systematickým názvem β,β-karoten 24,25 (Obr. 3). H 3 C CH 3 CH 3 CH 3 H 3 C CH 3 Obr. 3 Strukturní vzorec β-karotenu CH 3 CH 3 H 3 C CH 3 8

Molekulová hmotnost β-karotenu je 536,88 g/mol. Je to oranžově-červená látka, vyskytující se ve formě krystalů nebo ve formě krystalického prášku. Teplota tání tohoto karotenoidu je 178 179 C a skladuje se při teplotě 4 C. Rozpouští se v hexanu, benzenu, chloroformu, cyklohexanu, etheru a olejích. Naopak špatně rozpustný je ve vodě. Patří mezi nejznámější a technologicky nejdůležitější barvivo 29,25,26. β-karoten se nachází v mnoha druzích ovoce (meruňky, mango, grapefruit, švestky ) a zeleniny (mrkev, špenát, brokolice, paprika, cibule ). V listových zeleninách je β-karotenu 10-20 % a vysoký obsah tohoto karotenoidu se nachází i v palmovém oleji, a to až 0,2 % 29. Avšak lépe využitelný je β-karoten z tepelně zpracovaného špenátu nebo mrkve, než ze syrové zeleniny 6,27. V biologických systémech převládá isomer all-trans-β-karoten, nicméně cis- isomery byly také nalezeny v živých organismech a ve vzorcích potravin. All-trans-β-karoten je prekurzorem pro vitamín A a je nejvýznamnějším provitamínem A. A to především díky jeho symetrické struktuře. Mezi přirozeně se vyskytujícím a syntetickým β-karotenem není žádný rozdíl 29,24. β-karoten zabraňuje fotooxidativnímu poškození rostlin tím, že inhibuje tvorbu singletního kyslíku. Tento singletní kyslík hasí a vychytává reaktivní formy kyslíku. Tímto se β-karoten rozkládá a nelze ho regenerovat 24. Lidské tělo získává β-karoten z potravin (ovoce, zelenina, doplňky stravy, ) a mění jej na vitamín A (retinol). Je hlavním karotenoidem chránícím lidskou kůži před intenzivním slunečním zářením a UV zářením, a také chrání před některými druhy rakoviny. Doporučená denní dávka je 1 6 mg 29. V nedávné době bylo zjištěno, že příliš velký přísun β-karotenu může na lidský organismus působit i negativně. Některé výzkumy tvrdí, že nadbytek β- karotenu může vést ke zvýšení rizika nádorových onemocnění nebo urychlování jejich rozvoje 27,28. 9

2.2.1.2 Lutein Lutein je rostlinný pigment mající žlutou barvu a řadí se do skupiny karotenoidů, resp. xanthofylů. Je velmi důležitým antioxidantem. Jeho chemický vzorec je C 40 H 56 O 2 se systematickým názvem 3,3 -dihydroxy-α-karoten 29 (Obr. 4). H 3 C CH 3 CH 3 CH 3 C H 3 OH HO CH 3 CH 3 CH 3 H 3 C CH 3 Obr. 4 Strukturní vzorec luteinu Lutein má molární hmotnost 568,88 g/mol a teplotu tání 190 C. V čisté formě je to červeno-oranžová krystalická látka, která je ve vodě nerozpustná. Naopak dobře se rozpouští v polárních organických rozpouštědlech a v tucích. Snadno se oxiduje na světle a vzduchu. Řadí se mezi potravinářská barviva s označením E161b 23,29. Lutein je obsažen v několika druzích ovoce a zeleniny. Jeho největší zastoupení je hlavně v listové zelenině a vaječném žloutku. V poslední době je cenným zdrojem této látky i lupina 30. V rostlinných materiálech se vyskytuje ve dvou formách, a to jako volný lutein (kapusta, brokolice, špenát, ) nebo jako ester luteinu s mastnými kyselinami (papája, pomeranč, mango, žlutá kukuřice, paprika, ). Koncentrace luteinu závisí na odrůdě, druhu, části plodu, stupni zralosti, ale také na způsobu skladování, konzervace nebo na tepelné úpravě potraviny 29. Obsah luteinu v čerstvém ovoci a zelenině znázorňuje Obr. 5. Rostlinné materiály obsahují kromě all-trans-isomerů luteinu i cis-isomery, které vznikají působením tepla, světla a dalších faktorů v průběhu extrakce a analýzy vzorků. Zajímavostí je, že sladkovodní ryby dokážou lutein přeměnit na anhydrolutein, který se dále štěpí na příslušné aldehydy. Z nich redukcí vznikají all-trans-3,4-didehydroretinol, známý jako vitamín A 2 a all-trans-3-hydroxyretinol, ze kterého mohou dehydratací vzniknout další molekuly vitamínu A 2 (cit. 29 ). 10

Obsah luteinu (ppm) Obr. 5. Obsah luteinu ve vybraném čerstvém ovoci a zelenině 29 Chemická syntéza luteinu je obtížná a časově náročná. Může vzniknout až osm stereoizomerů luteinu, protože jeho molekula obsahuje tři centra chirality. Lidský organismus není schopen lutein syntetizovat, tudíž je jeho příjem zcela závislý na přírodních zdrojích, kterými jsou zelenina, ovoce nebo doplňky stravy. Lutein se v lidském těle nemění ve vitamín A, ale působí jako účinný antioxidant. Je důležitý pro zrak, protože snižuje riziko šedého zákalu a makulární degenerace 29. Hromadí se v oční čočce a v tzv. žluté skvrně na sítnici. Jeho specifickou vlastností je schopnost chránit oči před volnými radikály, které neutralizuje. Tyto radikály vznikají vlivem působení ultrafialových paprsků na oční sítnici. Je schopen také zastavit degenerativní změny na žluté skvrně, které bývají příčinou slepoty 30. Lutein hraje významnou roli v percepčním jevu, označovaném Haidingerův snop. Tento jev umožňuje člověku spatření a určení roviny polarizovaného světla nebo určení směru rotace kruhově polarizovaného světla 29. Lutein také chrání lidský organismus proti rakovině a nemocem srdce. Přenáší jej jedna z forem tzv. cholesterolu, tj. lipoprotein o nízké hustotě. Některé studie ukazují, že dokáže chránit vitamín E před oxidací, a také může přispět k funkčnosti imunitního systému 29. Komise pro potravinářské přídatné látky (JECFA) určila, že denní přijatelný příjem luteinu je až 2 mg/kg tělesné hmotnosti člověka 30. Jak již bylo řečeno, lidský organismus lutein získává hlavně z potravin. Nejvíce se ho do organismu dostává z vaječného žloutku a o něco méně z listové zeleniny. Přísun luteinu je možný i z komerčních přípravků, jako jsou doplňky stravy podávané ve formě olejové, práškové nebo enkapsulované 29. 11

2.2.1.3 Zeaxantin Zeaxantin je rostlinný pigment řadící se do skupiny karotenoidů, resp. xantofylů, které nemají provitamin A aktivitu. Jeho chemický vzorec je C 40 H 56 O 2 se systematickým názvem 3, 3 -dihydroxy-β-karoten (Obr. 6). Je isomerem luteinu, kdy dva karotenové alkoholy se od sebe liší posunem jedné dvojné vazby tak, že zeaxantin má všechny dvojné vazby konjugované 31,32. H 3 C CH 3 CH 3 CH 3 C H 3 OH HO CH 3 CH 3 CH 3 H 3 C CH 3 Obr. 6 Strukturní vzorec zeaxantinu Molekulová hmotnost zeaxantinu je 568,88 g/mol. Je to oranžově-červený krystalický prášek, rozpustný v chloroformu, etheru, sirouhlíku, pyridinu, kyselině sírové a ve vroucím metanolu. Naopak nerozpustný je ve vodě, hexanu a petroletheru. Zeaxantin má dvě chirální centra, a tudíž i čtyři stereoizomerní formy. Může se vyskytovat v cis- nebo transkonformaci, ale obvyklejší je forma trans-, protože ukládá menší počet stérického omezení než cis- forma 31,32. Přirozeně se zeaxantin nachází v kukuřici, vaječném žloutku, špenátu, medovici a také v ovoci a zelenině nesoucí žlutou barvu. Je také hlavním karotenoidem v za studena lisovaných ostružinách, malinách, borůvkách a rostlinných olejích. V následujícím obrázku jsou uvedeny obsahy zeaxantinu ve vybraném ovoci a zelenině 31 (Obr. 7). 12

Obsah zeaxantinu (ppm) Obr. 7 Obsah zeaxantinu v zelenině a ovoci 31 Průmyslová výroba čistého zeaxantinu využívá kvašení bakteriálních buněk z kmene Flavobacterium multivorum. Tento kmen může syntetizovat jako jediný karotenoid zeaxantin se zanedbatelným množstvím ostatních karotenoidů v rámci řádných podmínek fermentace. Výrobu zeaxantinu zahrnuje několik reakcí podle výrobního postupu, ve kterém je posledním krokem dvojitá Wittingova kondenzace symetrického dialdehydu, jako centrálního stavebního bloku se dvěma ekvivalenty vhodné fosfoniové soli 31,32. Jelikož je zeaxantin velmi fotocitlivý, uchovává se ve tmě pod argonem po dobu jednoho měsíce při teplotě -40 C. Pokud jej uchováváme déle, je nutné udržovat teplotu v rozmezí -3 až 5 C 31. Zeaxantin poskytuje ochranu rostlinám proti fotooxidaci, kdy chrání membránu přímo proti peroxidaci lipidů reaktivními radikály, které byly vytvořeny jako toxické vedlejší produkty při fotosyntetických reakcí 31. Lidský organismus získává zeaxantin potravou, jednak z přírodních zdrojů nebo může být přidáván do potravin. Zeaxantin se v lidském těle nachází v makule sítnice a společně s luteinem má důležitou roli v prevenci věkem podmíněné makulární degenerace. Zatímco lutein je distribuován po celé sítnici, zeaxantin je soustředěn hlavně v makule. Také stejně jako lutein chrání proti rakovině. Komise pro potravinářské přídatné látky (JECFA) určila, že denní přijatelný příjem zeaxantinu je až 2 mg/kg tělesné hmotnosti člověka 31. 13

Zeaxantin se v potravinářském průmyslu používá jako barvivo a nutriční doplněk v široké škále potravin (nápoje, cereálie, žvýkačky, vaječné výrobky, tuky, oleje, cukroví, kojenecké potraviny, mléčné výrobky, polévky, ). Zeaxantin se používá jako doplněk stravy pro ryby, prasata, ptáky. Přidává se do krmiva slepic, aby bylo dosaženo sytého žlutého zbarvení vaječného žloutku. Má také využití v kosmetické oblasti, kdy se přidává do přípravků na opalování 31,32. 2.2.2 Vitamín E Strukturním základem vitamínu E jsou tokotrienol (2-methyl-2-(4,8,12- trimethyltrideka-3,7,11-trien-1-ylchroman-6-ol) a tokol (2-methyl-2-(4,8,12-trimethyltridecylchroman-6-ol), které obsahují chromanový kruh buď s nenasyceným (tokotrienoly) nebo s nasyceným (tokoferoly) isoprenoidním postraním řetězcem. Tokotrienoly a tokoferoly se od sebe liší počtem a polohou methylových skupin v chromanovém kruhu. Dále se také liší svou biologickou účinností. Existují čtyři isomery tokotrienolů a čtyři isomery tokoferolů. Největší význam mají α-, β-, γ-, δ-tokoferoly 33,34,35 (Obr. 8). a b CH 3 CH 3 HO H 3 C O CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 HO O CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 c d HO CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 HO CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 H 3 C O CH 3 O CH 3 CH 3 CH 3 Obr. 8 Struktury tokoferolů (a) α-tokoferol, b) β-tokoferol, c) γ-tokoferol, d) δ-tokoferol) Vitamín E je slabě nažloutlý nebo bezbarvý viskózní olej. Je velmi dobře rozpustný v tucích. V kyselém prostředí je stálý i při 100 C, naopak v zásaditém prostředí se při vyšších teplotách rozkládá 33,36. 14

Obsah vitamínu E (ppm) V přírodě se nacházejí jen (+)-tokoferoly a synteticky vyrobené jsou vždy racemické (±). Vitamín E je obsažen hlavně v potravinách rostlinného původu a v menší míře v živočišných tucích. Následující obrázek prezentuje průměrný obsah vitamínu E v některých potravinách 33,35,36 (Obr. 9). 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Obr. 9 Průměrný obsah vitamínu E ve vybraných potravinách 36 1 olej z obilných klíčků, 2 sojový olej, 3 řepkový olej, 4 hlávkový salát, 5 olivový olej, 6 hovězí maso, 7 vejce, 8 máslo, 9 ryby, 10 mléko Pro lidský organismus je nejvýznamnější a nejdůležitější α-tokoferol. Denní potřeba vitamínu E pro člověka je dostatečně pokryta příjmem pestré stravy. Je významným antioxidantem. Lipidy buněčných membrán chrání před volnými radikály a s velkou pravděpodobností se na struktuře membrán podílí. Jeho největší množství se nachází v membránách buněk, které jsou vystaveny kyslíku (v membránách červených krvinek, plasmě a v dýchacím systému). Preventivně působí proti vzniku rakoviny a kardiovaskulárních chorob. Vhodnou formou vitamínu E přidávanou domácím a hospodářským zvířatům do krmiv je zejména acetát α-tokoferolu 33,34,35. 15

2.3 Metody izolace lipofilních látek 2.3.1 Extrakce kapalina kapalina U této extrakce se uplatňuje rozdělovací rovnováha. Jedna z fází je organická (rozpouštědlo nemísitelné s vodou) a druhá je vodná. Do organické fáze přecházejí pouze elektroneutrální složky. Povaha sil, jež způsobuje distribuci složky (skutečnost, že se složka v jedné fázi rozpustí více než ve fázi druhé), je různá, závisející na typu distribuující složky. Uplatňují se disperzní síly (tvorba vodíkových vazeb, vzájemné působení dipólů, ). Při rovnosti chemických potenciálů složky v organické i vodné fázi dosáhne tato soustava rovnováhy. Z této podmínky se odvozuje tzv. Nernstův rozdělovací zákon, který říká 37 : Při konstantní teplotě je poměr aktivit složky v obou fázích konstantní za předpokladu, že rozdělující se složka je přítomna v obou fázích v téže formě. poměr aktivit se nazývá rozdělovací konstanta K D. V obou fázích v téže formě je rozdělující složka přítomna jen tehdy, když se v roztoku nezúčastní žádné interakce s molekulami rozpouštědla nebo s jinými složkami v roztoku 37. Praktické aplikace extrakce kapalina-kapalina karotenoidů a tokoferolů z různých matric jsou dále uvedeny v kapitolách literární rešerše 2.4.1.2.1 a 2.4.1.2.2. 2.3.2 Extrakce tuhou fází (SPE) Extrakce tuhou fází je v současné době velmi rozšířená metoda rychlé a selektivní přípravy vzorku umožňující jeho čištění, odsolování, prekoncentraci, frakcionaci a derivatizaci. Princip SPE je podobný jako u extrakce kapalina-kapalina, avšak namísto dvou nemísitelných kapalných fází SPE zahrnuje rozdělení mezi kapalnou (vzorek matrice nebo rozpouštědla s analyty) a pevnou fázi (sorbentem). Extrakce je dosaženo prostřednictvím interakce tří složek: sorbentu, analytu a rozpouštědla, z nichž analyt musí být přitahován sorbentem silněji než matrice. Obecný postup pro SPE spočívá v kondicionaci sorbentu, nanesení vzorku, odstranění nežádoucích složek a v následné eluci prekoncentrovaných analytů elučním rozpouštědlem do zkumavky (Obr. 10). Úprava vzorku touto technikou umožňuje koncentrovat a čistit analyty z roztoků sorpcí na pevný sorbent a čištění extraktu 38. 16

Obr. 10 SPE extrakční postup 38 Při použití extrakce tuhou fází se musí dbát na vhodný výběr extrakčního SPE sorbentu. Výběr závisí na mechanismu interakce mezi sorbentem a analytem, a také na hydrofobních, polárních a ionogenních vlastností rozpuštěné látky a sorbentu. Retenční mechanismy SPE jsou založeny na vodíkových vazbách, van der Waalsových silách (nepolární interakce), dipól-dipólových silách (polární interakce) a kation-aniontových interakcích (iontové interakce). V následující tabulce jsou uvedeny nejčastěji používané separační módy 38 (Tab I). 17

Tab. I Sorbenty a separační mechanismy pro SPE 38 Fáze Sorbent Typ analytu Oktadecyl (C 18 ) Oktyl (C 8 ) Reverzní Ethyl (C 2 ) Nepolární Cyklohexyl Fenyl Kyano (CN) Normální Mírně až silně Amino (NH 2 ) (vázané) polární Diol (COHCOH) Křemelina Normální Silikagel Mírně až silně (adsorpční) Florisil polární Al 2 O 3 Amín Anex - Iontová Kvartérní amín kyselina Iontoměničová Karboxylová kys. Katex - Iontová Sulfonová kys. báze Kondicionace SPE sorbentu Metanol/voda Acetonitril/voda Hexan Chloroform Hexan Chloroform Voda, pufr (ph=pka +2) Voda, pufr (ph=pka 2) Eluční rozpouštědlo Hexan Chloroform Metanol Metanol (v závislosti na typu analytu) Pufr (ph=pka +2), rozpouštědlo s vysokou iontovou silou Pufr (ph=pka 2), rozpouštědlo s vysokou iontovou silou Extrakce tuhou fází je alternativou k extrakci kapalina kapalina. Je to metoda jednoduchá, snadno automatizovatelná a minimálně finančně náročná. SPE technika má v porovnání s tradičnějšími technikami mnoho výhod: vysoká výtěžnost analytu, zakoncentrování analytu, vysoce čisté extrakty, schopnost současně extrahovat analyty v širokém rozsahu polarit, snadná automatizace a kompatibilita s instrumentálními technikami 38. SPE patří mezi nejvhodnější a nejčastěji používané metody pro extrakci lipofilních antioxidantů. Touto extrakcí je možné zpracovat jakoukoli matrici, ať už mléko, lidské sérum 18

nebo právě olejové matrice. V následujícím textu je uveden literární přehled SPE extrakcí karotenoidů a tokoferolů z různých matric. Shen a kolektiv porovnávali vhodnost použití SPE kolonek naplněných různými sorbenty (CLEAN-UP-C 30, Prep Sep C 18, Envi-C 18 CLEAN-UP-Diol a ProElut Silica) pro prekoncetraci luteinu a β-karotenu z lidského séra a mateřského mléka 39. Kolonky byly kondiciovány 3 ml acetonu a 3 ml směsného rozpouštědla (isopropylalkohol : ethylacetát : voda; 1:1:1(v/v/v)). Po nanesení vzorku byly kolonky propláchnuty 5 ml směsného rozpouštědla a karotenoidy byly eluovány 1 ml acetonu, obsah β-karotenu a luteinu byl stanoven pomocí HPLC-DAD. Z uvedených výsledků vyplývá, že pro současnou prekoncentraci karotenoidů jsou vhodné kolonky naplněné C 30 a C 18 sorbentem a lutein vykazoval dobrou retenci i na diolové a silikagelové kolonce. Výtěžnost luteinu byla v rozmezí 91,3 96,8 % v lidském séru a 92,1 93,8 % v mateřském mléce, výtěžnost β-karotenu byla v rozmezí 92,9 98,1 % v lidském séru a 90,7 95,7 % v mateřském mléce na C 18 a C 30 sorbentech. Irakli a kolektiv testovali vhodnost tří SPE kolonek (Oasis HLB, Abselut Nexus a Lichrolut C 18 ) a tří elučních činidel (dichlormethan, etanol, hexan) pro extrakci tokoferolů, tokotrienolů a karotenoidů 40. Jako nejhodnější prekoncentrační systém byla vybrána Oasis HLB kolonka a eluce dichlormethanem, kolonka Nexus poskytovala nižší výtěžky extrakce a kolonka Lichrolut C18 se ukázala jako méně vhodná pro izolaci karotenoidů, přičemž pro tokoferoly a tokotrienoly poskytovala vysoké výtěžky. Pro prekoncentraci karotenoidů a chlorofylů ze slunečnicového oleje Mateos a kolektiv využili SPE extrakci s kolonkou naplněnou diol-vázaným sorbentem 41. Kolonka byla kondiciována 6 ml metanolu a 6 ml hexanu, po nanesení vzorku byla kolonka propláchnuta hexanem, ve kterém byl zadržen β-karoten, a následně byly anlytu eluovány 3 ml acetonu. Aplikovaná metoda byla porovnávána s klasickou kapalina-kapalina extrakcí a s SPE extrakcí s kolonkou naplněnou C 18 sorbentem. Při použití extrakce kapalina-kapalina byl výtěžek pigmentů 96,4 %, zatímco u C 18 -SPE byl výtěžek jen 51,3 % obsahu pigmentů vzhledem k provedené diol-spe extrakci. 19

Ke stanovení luteinu a zeaxantinu v hovězí sítnici Dachtler a kolektiv použili on-line spojení SPE extrakce s HPLC s UV-VIS detekcí 42. Předem připravený extrakt luteinu a zeaxantinu v hexanu byl nanesen na PLRP-S kolonku, která byla součástí dávkovacího systému HPLC, po nanesení vzorku byla kolonka propláchnuta 500 µl vody a karotenoidy byly následně eluovány mobilní fází složenou z acetonu a vody (85:15 (v/v). 20

2.4 Metody stanovení lipofilních látek 2.4.1 Kapalinová chromatografie Kapalinová chromatografie byla objevena ruským botanikem M. S. Cvětem již v roce 1903. Tato metodika se vyvíjela řadu let, až dospěla do podoby dnešní, metody často používané ve vědě a výzkumu s názvem vysokoúčinná kapalinová chromatografie neboli HPLC (High performance liquid chromatography) 43. Kapalinová chromatografie je založena na dělení látek mezi dvě a více fází, kdy dochází k opakovanému vytváření rovnovážných stavů. Mobilní fází je kapalina nesoucí přes stacionární fázi separované látky. Stacionární fáze může být umístěna v koloně nebo v ploché vrstvě. Mezi plošně uspořádané metody patří papírová a tenkovrstvá chromatografie. U sloupcové a vysokoúčinné kapalinové chromatografie je sorbentem naplněna kolona 44. Pomocí kapalinové chromatografie lze analyzovat až 80 % převážně organických sloučenin. Umožňuje analyzovat látky jak s nízkou molekulovou hmotností, tak i látky mající molekulovou hmotnost několik set tisíc 44,45. 2.4.1.1 Tenkovrstvá kapalinová chromatografie (TLC) Principem tenkovrstvé chromatografie je vzlínání mobilní fáze vrstvou stacionární fáze, kdy dochází k separaci látek. TLC vyvíjení může být prováděno ve vzestupném nebo v kruhovém (radiálním) uspořádání 44,46. U TLC je stacionární fáze umístěná v ploše ve vrstvách různé tloušťky na tuhé podložce, kterou může být hliníková fólie nebo skleněná deska. Nejčastěji používanými stacionárními fázemi jsou: oxid hlinitý, křemelina, práškový polyamid, celit, škrob, silikagel a další. Mobilní fázi volíme podle typu stacionární fáze, nejčastěji používané jsou: cyklohexan, toluen, dichlormetan, chloroform, etanol, kyselina octová, metanol, amoniak, aceton a jejich směsi 44,46. Tenkovrstvá kapalinová chromatografie je výhodnou metodou pro velkosériové kvantitativní nebo orientační analýzy. Má velké využití při organických syntézách. Dále se používá k čištění a identifikaci látek, k analýze nečistot v surovinách, výrobcích a v jiných materiálech 44. 21

Detekce u TLC Detekce (vizualizace) rozdělených látek na chromatogramu se provádí následujícími způsoby 44 : Fyzikální detekce - využívá záření (infračervené, ultrafialové a viditelné). Chemická detekce využívá vhodná detekční činidla, která po nanesení na chromatogram vyvolají barevnou reakci se separovanými látkami. U TLC se používají jednak univerzální detekční činidla s agresivními vlastnostmi (kyselina sírová, dusičná, roztok manganistanu draselného aj.), ale i selektivní činidla, které detekují jen určitou skupinu látek (Ehrlichovo činidlo, acidobazické indikátory aj.). Vyhodnocování kvality u TLC Látky v tenkovrstvé chromatografii se vyhodnocují pomocí hodnot retardačního faktoru (R F ) a jejich porovnání se standardy. R F je definovaný jako poměr vzdálenosti středu skvrny od startu (d i ) ku vzdálenosti čela mobilní fáze od startu (d m ) 46,47 : (1) Obr. 11 Výpočet R F 46 Vyhodnocování kvantity u TLC Vyhodnocení TLC chromatogramu se provádí přímými metodami (denzitometrie, radiochemická metoda, měření plochy skvrny). Také jedním z postupů vyhodnocení kvantity je vyškrábnutí skvrny ze stacionární fáze, následná extrakce vhodným rozpouštědlem a stanovení koncentrace analytu v extraktu vhodnou metodou 47. 22

V následující tabulce (Tab. II) jsou shrnuty nejčastěji používané podmínky pro TLC separace vybraných karotenoidů a tokoferolů s příslušnými odkazy na literaturu. Tab. II TLC vybraných karotenoidů a tokoferolů Sorbent Analyt Mobilní fáze Ref. Silikagel β-karoten, lutein, petrol-ether : aceton : diethylamin; 48,49 GF 254 violaxantin, neoxantin 10:4:1 (v/v/v) β-karoten, lutein, hexan : ethylacetát : aceton : metanol; Silikagel G60 50 violaxantin, neoxantin 27:4:2:2 (v/v/v/v) Silikagel 60F 254 Silikagel α-tokoferol cyklohexan : diethylether; 4:1 (v/v) 51,52 α-tokoferol, ergokalciferol oktan-diethylether; 7:1 (v/v) tetrachlormethan : diethylether; 4:1 (v/v) Silikagel α-tokoferol trichlormethan 54 Silikagel F 254 β-karoten, lykopen benzen : petrolether; 10:90 (v/v) 55 β-karoten, lykopen, lutein, Silikagel F 254 retinol, astaxantin, metanol : benzen : ethylacetát; zeaxantin, α-, γ-, δ- 5:75:20 (v/v/v) 55 tokoferol Silikagel F 254 Silikagel Silikagel β-karoten, lykopen, α-, γ-, δ-tokoferol β-karoten, kryptoxantin, zeaxantin, violaxantin, kapsantin, kapsorubin, neoxantin β-karoten, lutein 53 benzen : petrolether; 90:10 (v/v) 55 aceton : petrol-ether; 1:1 (v/v) 56 petrolether : diethylether : kys. octová; 80:20:1 (v/v/v) 57 2.4.1.2 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) Vysokoúčinná kapalinová chromatografie se běžně používá pro přesnou kvantitativní analýzu a pro výzkumné účely. Výhodou této metody je její automatizovatelnost i s vyhodnocením výsledků 44. HPLC systém pracuje tak, že vysokotlaké čerpadlo čerpá mobilní fázi ze zásobníku. U složitějších směsí je možné mobilní fázi čerpat ze dvou nebo více zásobníků, proto je mobilní fáze vedena přes směšovač, ve kterém dochází podle nastaveného programu k jejímu smíchání. Směšovač je zařazen buď před, nebo za vysokotlaké čerpadlo. Tlumič tlakových rázů je do toku mobilní fáze zařazen v závislosti na použitém čerpadle. Poté je mobilní fáze vedena přes dávkovací zařízení do kolony. Kolona je propojena s detektorem, jehož signál je 23

veden přes zesilovač do počítače. Blokové schéma kapalinového chromatografu je znázorněno na Obr. 12. Součástí kapalinového chromatografu mohou být i doplňková zařízení, jako jsou ochranné filtry, ventily, předklonky a odplyňovač mobilní fáze. Často se k detekci využívá zapojení dvou i více detektorů za sebou 44. 1 2 10 5 3 4 9 11 6 7 8 12 13 14 16 15 Obr. 12 Schéma kapalinového chomatografu 44 1, 2 zásobníky mobilní fáze, 3 programování gradientu, 4 směšovač, 5 odplyňovač, 6 vysokotlaké čerpadlo, 7 tlumič tlakových pulzů, 8 dávkovací zařízení, 9 kolona, 10 detektor, 11 jímač frakcí,12 zesilovač, 13 zapisovač, 14 počítač Mobilní fáze Při nastavování parametrů separace je nejdůležitějším rozhodnutím výběr mobilní fáze. Složení mobilní fáze se může během analýzy měnit, pak mluvíme o gradientové eluci. Nebo její složení může v průběhu analýzy být neměnné, potom se jedná o izokratickou eluci. Složení mobilní fáze se volí podle toho, zda se pracuje v systému normálních nebo reverzních fází 43. Normální fáze Stacionární fázi tvoří polární sorbent (oxid hlinitý, silikagel) a mobilní fáze je složena z nepolárního rozpouštědla, do kterého je přidána polární složka. V tomto systému dochází k sorpci polárních látek a nepolární mobilní fáze tuto sorpci podporuje. O aktivní místa na 24

povrchu sorbentu soutěží analyt s mobilní fází a retence látek je dána výsledkem jejich rozdílné polarity 44. Reverzní fáze V reverzních fázích se používá nepolární stacionární fáze, kterou je např. chemicky vázaná nepolární fáze (C 8 H 17, C 18 H 37 ) na silikagelu jako nosiči nebo méně často na uhlíku či organickém polymeru. Mobilní fáze se sestává ze směsi vody a organického rozpouštědla. Čím je délka nepolární části molekuly větší, tím se zvyšuje retence látek. Avšak mechanismus retence látek v tomto systému není ještě jednoznačně vyřešen, je zde předpoklad o uplatnění solvofobního efektu 44. Detektory Detektory slouží k detekci látek vycházejících z chromatografické kolony. Detektor je vybaven snímačem, který sleduje danou vlastnost eluátu a poskytuje signál, který se následně převádí do počítače. Počítač ukáže záznam separace v závislosti intenzity signálu na čase 44. Ve vysokoúčinné kapalinové chromatografii se používají hmotnostní nebo koncentrační detektory. Koncentrační detektory mohou být univerzální (nespecifické) nebo selektivní a poskytují signál úměrný koncentraci látky v analytu. Mezi nejčastěji používané detektory pro stanovení lipofilních antioxidantů patří 44 : 1. Spektrofotometrické detektory Selektivní detektory schopny detekovat látky, které jsou schopné absorbovat záření o určité vlnové délce použité k detekci. Spektrofotometrické detektory se dělí na dva typy, podle počtu nastavených vlnových délek použitých k měření: detektor diodového pole a spektrofotometrický detektor s monochromátorem 44. 2. Fluorometrický detektor Velmi citlivý a selektivní detektor, schopný detekovat pouze látky vykazující fluorescenci. Detekovaná látka absorbuje ultrafialové excitační záření v cele detektoru. Část pohlcené energie se vyzáří ve formě fluorescenčního záření, které má nižší energii než záření excitační. Následně dopadne emitované záření na fotoelektrický násobič, který poskytne proud úměrný koncentraci látky a toku emitovaného záření v cele detektoru. Pro dobrou 25

funkci detektoru je nutné oddělit emitované záření od budícího. Z toho důvodu je fotoelektrický násobič umístěn kolmo na směr průchodu budícího záření celou a také se to systému řadí vhodné filtry 44. 3. Elektrochemický detektor Elektrochemické detektory detekují látky schopné elektrochemické reakce, které probíhají na fázovém rozhraní roztok (mobilní fáze) elektroda. Elektrochemické detektory měří danou elektrickou veličinu (kapacita, proud, elektrodový potenciál), která je vyvolána při průchodu analytu průtokovou celou detektoru. V cele jsou uloženy elektrody, na něž je vkládáno pracovní napětí nezbytné k průběhu elektrochemické reakce v tříelektrodovém nebo dvouelektrodovém systému zapojení 58. Amperometrický detektor Amperometrický detektor měří proud vyvolaný průchodem oxidované nebo redukované látky průtokovou celou detektoru. Jako měrné elektrody se používají tuhé elektrody vyrobené z grafitových vláken, uhlíku, platiny, zlata, aj. Amperometrické cely se podle umístění pracovní elektrody a konstrukce dělí na: tubulární, wall jet a tenkovrstvou celu. Jako srovnávací elektroda se většinou používá kalomelová nebo argentochloridová elektroda 58. Coulometrický detektor Coulometrický detektor měří náboj, který je potřebný k redukci či oxidaci celkového množství látky při průtoku měrnou celou detektoru. Citlivost detekce tohoto detektoru je vyšší než u amperometrických detektorů. Při použití tzv. elektrody fritového typu (porézní grafitová pracovní elektroda, kterou protéká mobilní fáze), je možné zvýšit účinnost elektrochemické reakce. Tato coulometrická elektroda má výhodu ve vysoké účinnosti, selektivitě a stabilitě (snižuje poměr signálu k šumu). Má daleko větší povrch než klasické elektrody a oxidačně redukčním reakcím na povrchu elektrody podléhá přes 90 % přítomného analytu 58. Výhodou coulometrické elektrody je možnost zapojení dvou a více elektrod za sebou, na nichž je vloženo rozdílné napětí. Tímto dochází i ke zvýšení selektivity. Jelikož je analyt na coulometrické elektrodě 100 % elektrolyzován, efluent neobsahuje žádnou elektroaktivní komponentu, která může podléhat elektrochemické reakci při vloženém napětí. Zapojením až 26

šestnácti coulometrických elektrod můžeme získat detektor, který je obdobou detektoru diodového pole tzv. CoulArray. Z mobilní fáze se nečistoty odstraňují použitím porézní grafitové elektrody, na kterou je vloženo dané napětí, tzv. guard cela. Odstraňuje elektroaktivní nečistoty z mobilní fáze před vstupem do injektoru, kolony a cely 58. 2.4.1.2.1 Metody stanovení lipofilních antioxidantů metodou HPLC s UV-VIS a fluorescenční detekcí Pro simultánní a selektivní stanovení karotenů (β-karoten), tokoferolů (α-, β-, γ-, δ-tokoferol) a retinolu (cis-retin-13-ol, trans-retinol) v italských sýrech Panfili a kolektiv použili metodu HPLC s následnou UV-VIS a fluorescenční detekcí 59. Příprava vzorků spočívala v homogenizaci, alkalickém zmýdelnění s přídavkem antioxidantu a následné extrakci směsí hexan : diethylether (9:1). Vzniklý extrakt byl odpařen do sucha a rekonstituován ve 2 ml mobilní fáze. Analyty byly děleny v systému normálních fází s gradientovou elucí, mobilní fáze A: 0,1 % propan-2-ol v hexanu, mobilní fáze B: hexan. Karotenoidy byly detekovány UV-VIS detektorem při 450 nm, tokoferoly a retinol fluorescenčním detektorem s nastavenými vlnovými délkami při měření 280 a 325 nm (excitační), 335 a 475 nm (emisní). Lietz a kolektiv publikovali v roce 1997 stanovení karotenoidů v červeném palmovém oleji po předchozí enzymatické hydrolýze s využitím Candida cylindracea lipázy 28. Následně byla reakční směs extrahována třikrát 20 ml směsí diethylether : petrolether (2:1, v/v) s obsahem 0,1 % butylovaného hydroxytoluenu. Směsný extrakt byl promyt 50 ml 10 % roztoku NaCl, sušen přídavkem bezvodého síranu sodného a nakonec bylo organické rozpouštědlo odpařeno pomocí rotační odparky. Odparek byl rozpuštěn v 5 ml acetonu, přefiltrován a 10 µl vzorku bylo přímo dávkováno do HPLC. Antioxidanty byly separovány podle metody publikované Hartem a Scottem 60 a rozseparované karotenoidy (α-karoten, cis-α-karoten, β-karoten, cis-β-karoten) byly detekovány UV-VIS detektorem při 450 nm a tokoferoly (α-,γ-,δ-tokoferol) byly detekovány fluorescenčním detektorem s excitační (298 nm) a emisní (328 nm) zvolenou vlnovou délkou. Pro analýzu karotenoidů a vitamínu E ve slunečnicovém a řepkovém oleji využili Franke a kolektiv metodu HPLC s UV-VIS a fluorescenční detekcí 61. Vzorky oleje byly spolu s přídavkem interních standardů a MgO dvakrát extrahovány 35 ml směsi metanol : tetrahydrofuran (1:1, v/v) s přídavkem 0,1 % butylhydroxytoluenem. Sloučené 27