KVANTIFIKACE ZMĚN GENOVÉ EXPRESE
Northern bloty Genové čipy pracné a zdlouhavé nákladné Semikvantitativní RT-PCR nepřesné qpcr vysoké dynamické rozpětí metodiky real-time PCR Vysokoučinné sekvenování transkriptomu
problém: precizní kvantifikace mrna spektrofotometrické stanovení koncentrace RNA nemusí být dostatečné řešení: stanovení koncentrace RNA pomocí fluorescenčního barviva RIBOgreen - 1000x citlivější, nereaguje s nukleotidy a krátkými fragmenty. Pracnější elektroforetické stanovení (Agilent bioanalyzer čipy) nebo relativní stanovení pomocí qpcr
control expt NORTHERN BLOT cílový gen GOI referenční gen aktin, GAPDHetc korigovaný nárůst exprese = 10/2 = 5
PCR: Co to je? Polymerase Chain Reaction: znamená amplifikace (mnohonásobná replikace) relativně krátkých úseků specifické DNA Základní nástroj molekulární biologie se vzrůstájícím významem i v dalších oborech (botanika, kriminalistika) The idea Ghobind Khorana 1971 Kary Mullis 1983 Nobelova cena 1993 poprvé provedená mnohonásobná in vitro replikace ve zkumavce
Thermus aquaticus Pyrococcus furiosus Taq Pfu
aplikace REAL-TIME PCR 1) absolutní kvantifikace množství DNA ve vzorku k externímu standardu, detekce virální či bakteriální DNA, forenzní chemie 2) koncová detekce SNP genotypizace, detekce mutací a polymorfismů 3) relativní kvantifikace srovnání úrovně exprese mrna nebo mikrorna mezi různými tkáněmi či biologickými podmínkami
princip měření vznikající fluorescence po každém cyklu PCR, stanovení křivek tání
chemismus 1) interkalační barviva SYBRgreen interkalace barviva na dvoušroubovici vznikající (amplifikované) DNA precizní výběr primerů nesmí vytvářet dimery nutná kontrola amplifikovaného produktu na křivku denaturačních teplot
chemismus 2) hybridizační sondy (TAQman) uvolňování fluorescence po degradaci sondy nutná 5-3 exonukleasová aktivita Taq polymerasy fluorescenční značka: VIC, FAM (fluorescein) zhášeč: Tamra (Tetramethyl-6-Carboxyrhodamine ) FRET = Förster/fluorescence resonance energy transfer Försterův rezonanční přenos energie - mechanismus nezářivého přenosu energie mezi dvěma molekulami prostřednictvím dipól-dipólové interakce
srovnání TaqMan SybrGreen specifita primery proba PCR podmínky primery PCR podmínky flexibilita singleplex multiplex (max.4) singleplex aplikace kvantifikace SNP detekce kvantifikace cena vysoká nízká
kontaminace největší problém PCR aerosol, pipety, staré amplikony částečné řešení URACIL N-GLYKOSYLASA štěpí ss a dsdna s inkorporovaným deoxyuracilem (dutp) termolabilní, 0% aktivita nad 55 C nereaguje s templátem (dttp) dutp v qpcr mixu místo dttp pracuje během nastavení PCR reakce
chyby v pipetování templát (cdna) premix (primery, proba, polymerasa, dntp, pufr, srovnávací fluorescenční barvivo) částečné řešení - ROX (Karboxy-X-Rhodamin) fluorescence se nemění během PCR cyklů a vzrůstající fluorescence v každé zkumavce vzorku je extrapolována na srovnávací DVOJÍ PIPETOVÁNÍ REAKČNÍ SMĚSI pracujeme s premixy 1) pufr, Mg 2+,dNTP, ROX, SybrGreen, TaqPol, primery 2) vzorek (cdna, genomická DNA)
CYCLE NUMBER AMOUNT OF DNA 0 1 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 7 128 8 256 9 512 10 1,024 11 2,048 12 4,096 13 8,192 14 16,384 15 32,768 16 65,536 17 131,072 18 262,144 19 524,288 20 1,048,576 21 2,097,152 22 4,194,304 23 8,388,608 24 16,777,216 25 33,554,432 26 67,108,864 27 134,217,728 28 268,435,456 29 536,870,912 30 1,073,741,824 31 1,400,000,000 32 1,500,000,000 33 1,550,000,000 34 1,580,000,000 AMOUNT OF DNA AMOUN T OF D NA 1600000000 1400000000 1200000000 1000000000 800000000 600000000 400000000 200000000 0 10000000000 1000000000 100000000 10000000 1000000 100000 10000 1000 100 10 1 lineární vynesení 0 5 10 15 20 25 30 35 PCR CYCLE NUMBER logaritmické vynesení 0 5 10 15 20 25 30 35 PCR CYCLE NUMBER
lineární ~20 do ~1500
C T hodnoty threshold treshold je třeba nastavit tak aby u každého vzorku procházel lineární části křivky C T počet cyklů při kterém fluorescence vzorku překročí threshold (prahovou hodnotu)
před každou kvantifikací je třeba vždy udělat standardní křivku threshold templát: 10x ředění buď přímo cdna, nebo plasmid s naklonovaným genem, který stanovujeme C T koncentrace templátu
PARAMETRY STANDARDNÍ KŘIVKY směrnice: ideální -3,32 = 100% efektivita reakce %EFF kolik kopii templátu je zkopírováno v každém cyklu R 2 korelační koeficient (tolerovat se dá ještě 0,995) Eff=10 (-1/slope) 1
CYCLE AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA 100% EFFICIENCY 90% EFFICIENCY 80% EFFICIENCY 70% EFFICIENCY 0 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 4 4 3 3 3 8 7 6 5 4 16 13 10 8 5 32 25 19 14 6 64 47 34 24 7 128 89 61 41 8 256 170 110 70 9 512 323 198 119 10 1,024 613 357 202 11 2,048 1,165 643 343 12 4,096 2,213 1,157 583 13 8,192 4,205 2,082 990 14 16,384 7,990 3,748 1,684 15 32,768 15,181 6,747 2,862 16 65,536 28,844 12,144 4,866 17 131,072 54,804 21,859 8,272 18 262,144 104,127 39,346 14,063 19 524,288 197,842 70,824 23,907 20 1,048,576 375,900 127,482 40,642 21 2,097,152 714,209 229,468 69,092 22 4,194,304 1,356,998 413,043 117,456 23 8,388,608 2,578,296 743,477 199,676 24 16,777,216 4,898,763 1,338,259 339,449 25 33,554,432 9,307,650 2,408,866 577,063 26 67,108,864 17,684,534 4,335,959 981,007 27 134,217,728 33,600,615 7,804,726 1,667,711 28 268,435,456 63,841,168 14,048,506 2,835,109 29 536,870,912 121,298,220 25,287,311 4,819,686 30 1,073,741,824 230,466,618 45,517,160 8,193,466 AMOUNT OF DNA %EFF 100% = 2.00x 90% = 1.90x 80% = 1.80x 70% = 1.70x 10,000,000,000 1,000,000,000 100,000,000 10,000,000 1,000,000 100,000 10,000 1,000 100 10 1 100% EFF 90% EFF 80% EFF 70% EFF 0 10 20 30 PCR CYCLE NUMBER relativní kvantifikace je možná pouze pokud sledovaný gen a referenční gen má srovnatelnou a vysokou efektivitu > 90% 3%
tolerance efektivity
Chemismus SybrGreen Nutná kontrola výsledných amplikonů na teplotní křivky tání teplota
REFERENČNÍ GEN musí mít stabilní expresi ve všech studovaných vzorcích nejčastěji provozní geny (house-keeping) aktin, GAPDH, cyklofilin, 18S RNA, EF1
TaqMan Human Endogenous Control Plate C T
C T = 2 čtyřnásobný rozdíl v expresi změna v jednom cyklu při 100% efektivitě je rovna dvojnásobné změně ve výchozí koncentraci cdna 18S ribosomální RNA přepisována jinou RNA polymerasou než mrna byly popsány výkyvy mezi množstvím rrna a mrna nelze použít pokud se vychází z mrna
vyhodnocení kalibrátor sample 1 sample 2 izolace celkové RNA (mrna) přepis do cdna navržení primerů a sond pro referenční gen a studovaný (GOI) určení standardních křivek pro oba geny a stanovení efektivity GAPDH GOI GAPDH GOI GAPDH GOI
vyhodnocení kalibrátor sample A kalibrátor sample B sample A sample B GAPDH GOI
1 vyhodnocení změny exprese pro sample 1 metoda delta delta cé té 1. určíme C T pro všechny křivky 2. určíme C T GOI - C T GAPDH pro kalibrátor C T kalibrátor 3. určíme C T GOI - C T GAPDH pro sample 1 C T sample 1 4. C T sample 1 - C T kalibrátor C T výsledek (kolikrát je gen více či méně exprimován) 2 - CT
2 vyhodnocení počítá se i s efektivitou Sample A - kalibrátor Sample B - vzorek
3 vyhodnocení pomocí standardů o známe koncentraci se spočítají počty kopií ve vzorcích
příklad linie živočišných buněk byla podstoupena umlčení (silencing) genu pkg2 s linie transfekované a netransfekované (kalibrátor) byla izolována RNA, přepsana do cdna a provedeno qpcr s primery a probou na gen pkg2 a GAPDH (referenční gen). Snížila se exprese genu pkg2 po umlčení? pkg2 Eff 86% cdna kalibrator C T 22,48 cdna silencing C T 22,3 GAPDH Eff 77% cdna kalibrator C T 20,05 cdna silencing C T 16,97 2 - CT pkg2 cdna kalibrator cdna silencing 1,1x10 4 kopií 1,23x10 4 kopií 2 (5,33-2,43) (1+0,86) 0,18 /(1+0,77) 3,08 cdna kalibrator cdna silencing GAPDH 0,134 0,192 0,194 Gen snížil expresi 7,5x 5,2x 5,2x 1,55x10 4 kopií 8,92x10 4 kopií
navrhování primerů velikost amplikonu 50-150 bp délka primerů 20 bp primery se nesmí překrývat s próbou Tm 58-60 C optimální teplota pro degradaci proby exonukleasovou aktivitou GC obsah 50-70%, GC-clamps on the 5 end žádné vlásenky žádné dimery (self-dimery, cross-dimery)
navrhování proby délka proby 13-25 bp primery se nesmí překrývat s próbou Tm 68-70 C o 10 C vyšší než Tm primerů GC obsah 50-70% žádné G na 5 konci zháší fluorescenci FAM barvy
navrhování primerů a proby
kontaminace genomickou DNA 1) ošetření vzorků před RT DNasou 2) navržení primerů do dvou exonů mezi nimiž je dlouhý intron 3) navržení primeru nebo proby na přechod intron/exon
MGB PROBY minor groove binding stabilizuje vazbu proby na ssdna výrazně zvyšuje Tm můžeme navrhovat krátké proby při zachování vysoké Tm
MGB PROBY využití pro alelické diskriminace
kolik replikací a kdy replikovat? sample extrakce RNA přepis do cdna qpcr 3X 6X
kolik replikací a kdy replikovat? ideální 3x sample extrakce RNA přepis do cdna qpcr 18X
instrumentace 7500 Real Time PCR System 7900HT Real Time PCR System StepONE Real Time PCR System
halogenová lampa emisní filtry zesilovač ccd kamera excitační filtry zkumavky se vzorky v peltierovém bloku
instrumentace
http://www.youtube.com/watch?v=k16wgeu1kvm
HRM ANALYSA (HIGH RESOLUTION MELT) detekce SNP bez specifických sond díky kvalitní instrumentaci Corbett ( 0.02 C) a nové generaci interkalačních barviv (LC Green Plus)
pro amplikony do 200bp HRM ANALÝZA
ddpcr droplet digital PCR
ddpcr droplet digital PCR PCR reakce je rozdělená do olejových kapiček, v každé je žádná až několik molekul templátu Po proběhnutí PCR, kapičky jsou analyzovány na průtokovém cytometru a je detekován signál PCR pozitivní/pcr negativní kapičky Absolutní kvantifikace určení koncentrace templátu ve výchozím vzorku bez nutnosti přípravy kalibrační křivky (c) = -ln (1 - p) koncentrace = c/v c počet kopií na kapičku p frakce pozitivních kapiček V objem kapičky Stanovení CNV (copy number variance) v kolika kopiích je daný gen ve vzorku, proti referenci (rozlišení homozygot/heterozygot) Stanovení mutací či SNP dvě různě značené próby (FAM a VIC)
Detekce mutace a stanovení její penetrace ve vzorku pomocí ddpcr citlivost až 0.1% mutované formy z celkového množství izolované DNA (např. několik nádorových buněk ve zdravé tkáni)