BAKTERIÁLNÍ GENETIKA Lekce 12 kurzu GENETIKA Doc. RNDr. Jindřich Bříza, CSc.
-dědičnost u baktérií principiálně stejná jako u komplexnějších organismů -genom haploidní a značně menší
Bakteriální genom -ve velké většině případů je představován chromozómem tvořeným jedinou cirkulární molekulou DNA velikosti v řádu miliónů bází párů (E. coli 4,6 Mbp) -není uložen v jádře a není spojen s histony -některé baktérie (např. Vibrio cholerae) obsahují více chromozómů a několik baktérií má lineární chromozóm -regulace genové exprese jiná než u eukaryot -geny bez intronů, uspořádány do operonů (skupina genů jedné metabolické dráhy seřazených na DNA za sebou a regulovaných společným promotorem; transkripcí operonu vzniká jediná tzv. polycistronická mrna) -životnost mrna minuty (u eukaryot hodiny až dny) -mnoho baktérií obsahuje ještě plazmidy (malé kruhové molekuly DNA), některé z nich jsou přítomny v buňce mnoha kopiích (relaxed plasmids, replikačně neomezené,10-500 kopií), některé naopak v jedné nebo několika (stringent plasmids, replikačně omezené); nesou geny, které nejsou pro baktérii esenciální, ale které jí dávají selekční výhodu; mají vlastní počátek replikace replikují se nezávisle na bakteriálním chromozómu
-u E. coli 4289 genů, u 1/3 z nich stále ještě funkce neznámá
Přenos DNA mezi baktériemi -tři mechanismy: i) konjugace ii) transformace iii) transdukce
i) Konjugace -přenos genetického materiálu přímo z jedné bakteriální (donorové) buňky do druhé (recipientní) -přenáší se buď plazmid nebo část chromozómu, vždy jednosměrně -po konjugaci může následovat homologní rekombinace -nezbytným předpokladem konjugace je přítomnost fertility faktoru F (epizómu) v donorové buňce (F plazmid má schopnost se integrovat do bakt. chromozómu a schopnost přenášet se do jiných baktérií a je-li integrován, přenáší s sebou bakteriální chromozóm)
-integrací F faktoru do chromozómu vznikne Hfr kmen (high frequency of recombination) vysoká frekvence konjugativního přenosu (1000 x častěji než F + kmeny) -místo integrace v chromozómu je náhodné, přenos začíná od místa lokalizace F faktoru (u různých kmenů je F faktor v různých místech genomu vytvoření přesné chromozomální mapy)
-plazmid se může z chromozómu prostřednictvím rekombinace opět vystřihnout; většinou přesně, někdy však dojde k tomu, že DNA F faktoru vezme s sebou i malou část bakteriálního chromozómu geny na tomto kousku jsou přenášeny spolu s celým F faktorem = F- dukce (sexdukce)
-využití pro mapování bakteriálního genomu:
ii) Transformace -bakteriální buňka přijímá DNA přímo z prostředí, ve kterém žije -po transformaci může následovat homologní rekombinace -první pokus Griffith (1928), ale vysvětlení, co je látkou, která vede k bakteriální transformaci, podali až v r. 1944 Avery, McLeod a McCarthy
-buňky přijímající DNA musí být kompetentní (některé druhy baktérií přijímají cizí DNA mnohem snadněji než jiné; kompetence je ovlivňována růstovou fází, složením média i koncentrací přijímané DNA) -přijímaná DNA nemusí být bakteriální, fakticky jí může být jakákoliv DNA
-využití pro mapování bakteriálních genů:
iii) Transdukce -příjem DNA do bakteriální buňky zprostředkován bakteriofágy (bakteriálními viry) -vnesená DNA může být včleněna rekombinací do bakteriálního chromozómu -dědičnou složkou fágů zpravidla dvouvláknová lineární DNA - temperátní fágy (např. λ) se mohou inkorporovat do bakteriálního genomu (lyzogenní infekce), zatímco virulentní fágy (T2, T4) baktérii vždy bezprostředně zabíjejí (lytická infekce, kdy fágová DNA zůstává na hostitelském genomu nezávislá) - obecná transdukce - do malé části fágových partikulí se balí bakteriální DNA místo fágové; tato bakteriální DNA má stejnou velikost jako fágová -možno využít k mapování bakteriálního genomu (čím častěji se spolu geny při obecné transdukci přenášejí, tím leží blíže sebe)
-mapování bakteriálního genomu:
- specializovaná transdukce -je založena na existenci lyzogenního cyklu a na možnosti chybného vystřižení (excize) bakteriofága z bakteriálního genomu při přechodu z lyzogenního cyklu na lytický přenáší se vždy jen malá část bakteriální DNA sousedící s integrovaným fágem -například bakteriofág λ se integruje do genomu E. coli vždy v místě att (attachment) mezi geny gal a bio při specializované transdukci se přenáší z celého genomu E. coli právě jeden z těchto genů - cis-trans test -slouží ke zjišťování, zda dvě mutace jsou součástí téhož cistronu (kódující sekvence) nebo různých cistronů (obdobný test v genetice eukaryot se nazývá test na alelismus) -test zavedl S. Benzer v 60. letech 20. stol. pokusy na fágu T4 (zavedl i termin cistron) -jsou-li mutace v různých cistronech dochází ke komplementaci a tedy ke vzniku normálního fenotypu; v opačném případě jsou všechny produkované fágy mutantní
Plazmidy -mají vlastní počátek replikace, některé mají geny nutné pro konjugaci (konjugativní x nekonjugativní plazmidy) -jsou nositeli mnoha vlastností (rezistence vůči antibiotikům či těžkým kovům, fixace vzdušného dusíku atd.) -např. schopnost baktérií rodu Rhizobium, Azorhizobium a Bradyrhizobium indukovat u některých druhů rostlin tvorbu dusík fixujících kořenových hlízek je spojeno s geny nod na plazmidu Sym -plazmid Ti z Agrobacterium tumefaciens podmiňuje u rostlin vznik nádorů (crown gall) a využívá se k transformaci rostlin
- plazmid Ri z Agrobacterium rhizogenes podmiňuje u rostlin vznik kořenových kultur (hairy roots) -plazmid typu F podmiňuje konjugaci -plazmidy typu R nesou geny pro rezistenci k antibiotikám a jiným růstovým inhibitorům; obvykle na každém plazmidu více genů rezistence (sdružená rezistence) nebezpečí u patogenních druhů; např. plazmid R100 s rezistencí vůči chloramfenikolu, streptomycinu, tetracyklinu, sulfonamidům a rtuťnatým sloučeninám je konjugativní s možností přenosu mezi rody Escherichia, Klebsiella, Proteus, Salmonella a Shigella; navíc mnoho genů rezistence leží na transpozonech, čímž ještě více stoupá možnost jejich přenosu
-existují plazmidy kódující toxiny a jiné faktory virulence (enzymy a jiné molekuly), např. u enteropatogenních kmenů E. coli jsou minimálně dva toxiny hemolyzin a enterotoxin kódovány geny na plazmidu; kromě toho některé geny pro faktory virulence leží na transpozonech, nebo jsou umístěny kombinovaně na chromozómu, bakteriofágu a plazmidu (např. kmen E. coli 0157:H7 nesoucí ze shigely přenesený gen pro shigatoxin -patří mezi enterohemorragické kmeny a způsobuje krvavé průjmy a v některých případech i těžké postižení ledvin, výskyt v ČR zatím jen 35 případů za rok 2003) -plazmidy E. coli typu Col nesou geny pro syntézu toxických proteinů (kolicinů), které jsou toxické pro určité jiné kmeny E. coli; je to příklad produkce bakteriocinů (proteinů inhibujících či zabíjejících blízce příbuzné druhy baktérií nebo dokonce kmeny téhož druhu) - inkompatibilita plazmidů (plasmid incompatibility) - neschopnost trvalého udržení plazmidu ve společném hostitelském klonu s jiným téže skupiny; příčinou je velká podobnost v represorech replikace, takže represor více omezuje v replikaci jeden zplasmidů, jenž poté v průběhu několika dělení z buňky zmizí
-plazmidy se stejným mechanismem replikace patří do téže inkompatibilní skupiny (v současnosti je známo více než 30 těchto skupin)
Operon a jeho regulace -operon je skupina funkčně příbuzných genů včetně sekvencí, které řídí jejich transkripci (promotor, operátor) -je přepisován do jediné polycistronické mrna -principiálně existují dva typy řízení transkripce operonu: negativní (regulační protein je represorem) a pozitivní (reg. protein je aktivátorem) -negativně i pozitivně regulovaný operon pak může být buď inducibilní nebo reprimovatelný lac operon -popsali Jacob a Monod v 60. letech 20. stol. (Nobelova cena 1965) -umožňuje utilizaci laktózy, obsahuje 3 geny: lacy galaktozid permeáza lacz β-galaktozidáza laca galaktozid transacetyláza
-jde o negativní inducibilní operon - induktorem vedle (allo)laktózy může být mj. i IPTG isopropylthiogalaktosid) g využití ve výzkumu -podléhá dále katabolické represi (v přítomnosti glukózy jsou geny podílející se na metabolismu jiných sacharidů reprimovány), která je odstraněna vazbou diméru CAP s navázaným camp na CAP místo těsně před promotor
-katabolická represe lac operonu (pozitivní regulace):
trp operon -jde o negativní reprimovatelný operon -5 strukturních genů g 3 enzymy řídící syntézu tryptofanu -represe transkripce dosaženo vazbou produktu reakce (tryptofanu = korepresoru) na represorový protein, který se tímto stane aktivním a váže se na operátor -vedle negativní represe zde také dochází k atenuaci -při atenuaci je transkripce sice iniciována, ale pak předčasně ukončena ještě dříve, než RNA polymeráza dosáhne strukturních genů