y x COSY 90 y chem. posuv J vazba 90 x : : inphase dublet, disperzní inphase dublet, disperzní antiphase dublet, absorpční antiphase dublet, absorpční diagonální pík krospík + - - + podmínky měření a zpracování dat ztráta rozlišení ve spektru
y x x DQF-COSY Pravidla fázových cyklů +2 +1 0-1 -2 Δ 1 Δ 3 Δ 1 1. Při změně fáze pulsu o získává koherenční cesta fázový posun Δ 2. Jestliže fázový cyklus používá kroky 360 /, je spolu s cestou Δ vybrány i cesty s Δ ( 1,2, Δ 2
y x x DQF-COSY +2 +1 0-1 -2 0 1 0 a 2 Δ 0 Δ 1 0 0 0 90 180 270
y x x DQF-COSY +2 +1 0-1 -2 0 a 2 2 2 1 2 2 2 sin Ω # $ % sin &'$ % 90 x 1 2 2 ( 2 ( sin Ω # $ % sin &'$ % krospík diagonální pík Oba se stejnou fází
korelace vodíkových signálů po vazbách COSY HO O O H O HO O H H OH H H OH OH H 3 C CH 3 5 krospík = existuje J vazba mezi danými vodíky, vidíme jen přímé sousedy
x TOCSY spinlock y Spinlock z spinlock y = x y magnetizace uzamčena v ose y chemický posuv se nevyvíjí J vazba zůstává aktivní všechny spiny efektivně cítí stejné magnetické pole a mají vyrovnané energetické hladiny polarizace se volně přelévá mezi všemi spiny spojenými J vazbou
COSY versus TOCSY identifikace spinových systémů postranní řetězce krospík = vodík patří do daného spinového systému, nepřerušené sítě J vazeb
Heteronukleární korelace HMQC x I (φ) (ψ) φ rec S dekapling HSQC x x y y x I x (φ) (ψ) x φ rec S dekapling φ = x, -x; ψ = x, x, -x, -x; φ rec = x, -x, -x, x
HMQC versus HSQC vývoj v nepřímé doméně ovlivněn J vazbami mezi vodíky
NMR biomolekul vysoce selektivní odezva, rozlišení jednotlivých atomů široký rozsah fyzikálně-chemických vlastností molekuly v roztoku, blíže fyziologickému prostředí peptidy a proteiny nukleové kyseliny oligosacharidy Dostupné informace identifikace substrátu prostorová struktura molekuly dynamické chování molekuly komplexační rovnováhy identifikace místa interakce ligand - substrát struktura komplexu...
Měřená jádra (R. Hrabal)
Řešení prostorové struktury NMR vzorek (izotopové obohacení) NMR spektrometr pulsní sekvence NMR spektra obecné informace o molekule (primární struktura, koval. vazby,...) extrahování experimentálních dat zpracování všech informací a predikce struktury validace konečného souboru struktur
Příprava vzorku proteinu Neznačený vzorek o příslušné koncentraci kontrola správného sbalení proteinu kontrola dostatečně vysoké koncentrace sledování dlouhodobé stability 15 N obohacený vzorek kontrola čistoty proteinu kontrola správného sbalení proteinu kontrola dostatečně vysoké koncentrace některé komplexační studie (např. titrace ligandem) 13 C/ 15 N ( 13 C/ 15 N/ 2 H) obohacený vzorek strukturní studie Koncentrace a objem 0.5 1.0 mm / 0.1 0.5 mm 250 500 µl Exprese proteinů v minimálním médiu ( 15 NH 4 Cl, 15 NH 4 SO 4 jediný zdroj dusíku, izotopově obohacené růstové médium 13 C-glukoza, 13 C-glycerol jediný zdroj uhlíku)
1 H spektrum Kontrola správného sbalení proteinu 15N-1 H korelace, HSQC čerstvý vzorek vzorek po 5 dnech (R. Hrabal)
Další požadavky na vzorek vzorek musí zůstat aktivní a nedenaturovaný po celou dobu NMR experimentů rozpouštědlo ph pufr teplota aditiva koncentrace stabilita H 2 O kompromis mezi minimalizací chemické výměny labilních vodíků s vodou a optimem pro studovaný protein (4-7) fosfátový pufr neobsahuje žádné vodíky acetátový pufr nutno připravit deuterovaný podle požadavků studovaného materiálu (5 40 C) nutno připravit deuterovaná, vyvarovat se vysokých koncentrací, omezit soli 0.1 1.0 mm vzorek nesmí podléhat agregaci, koagulaci, sebezničení,... alespoň několik týdnů (1 týden a opakovaná příprava)
Přiřazování signálů proteinu aminokyselina i-1 aminokyselina i Neznačené proteiny pouze 1 H experimenty (COSY, TOCSY, NOESY) pouze malé proteiny, pracné 13 C a 15 N obohacené proteiny série 3D experimentů (HNCA, HN(CO)CA, CBCANH,...) názvy podle korelovanýcj jader, přenos polarizace out-and-back, out-and-stay větší molekuly, snadněji interpretovatelná spektra
Strategie založené na J-vazbách HNCA HN(CO)CA HNCO HN(CA)CO CBCANH / HNCACB CBCA(CO)NH
HNCA experiment out-and-back H N N(t 1 ) Cα(t 2 ) N H N (t 3 )
HNCA experiment krospík na vlastní a předchozí reziduum www.protein-nmr.org.uk
HN(CO)CA experiment out-and-back H N N C Cα(t 1 ) C N(t 2 ) H N (t 3 )
HN(CO)CA experiment krospík pouze na předchozí reziduum www.protein-nmr.org.uk
Postup přiřazení signálů páteře Začátek: N-H souřadnice z 15 N, 1 H-HSQC i-2 i-1 i www.protein-nmr.org.uk
Postup přiřazení signálů páteře praxe
CBCANH experiment out-and-stay Hα,β Cα,β (t 1 ) N(t 2 ) H N (t 3 ) HNCACB experiment out-and-back H N N Cα,β (t 1 ) N(t 2 ) H N (t 3 )
CBCANH / HNCACB pozice Cβ bývá charakteristicná pro danou AA www.protein-nmr.org.uk
CBCA(CO)NH experiment out-and-stay Hα,β Cα,β (t 1 ) C N(t 2 ) H N (t 3 ) HN(CO)CACB experiment out-and-back H N N C Cα,β (t 1 ) C N(t 2 ) H N (t 3 )
CBCA(CO)NH / HN(CO)CACB pozice Cβ bývá charakteristicná pro danou AA www.protein-nmr.org.uk
Postup přiřazení signálů páteře www.protein-nmr.org.uk
Postranní řetězce 15 N, 1 H-HSQC-TOCSY H N (t 1 ) N(t 2 ) H N H i (t 3 ) relativně dlouhý mixing time www.protein-nmr.org.uk
Postranní řetězce HCCH-TOCSY H(t 1 ) C(t 2 ) C H(t 3 ) kratší mixing time HCCH-COSY méně signálů www.protein-nmr.org.uk
Experimentální protokol Rozhoduje: velikost proteinu stabilita proteinu požadované experimentální informace dostupnost experimentálního času... Příklad 1 HNCA, HN(CO)CA HCCH-TOCSY editované NOESY Příklad 2 HNCACB, CBCA(CO)NH 15 N, 1 H-HSQC-NOESY, 13 C, 1 H-HMBC-NOESY a další kombinace...