Metodika STANOVENÍ OBSAHU FLUORU VE VEDLEJŠÍCH PIVOVARSKO-SLADAŘSKÝCH PRODUKTECH

Metodika STANOVENÍ OBSAHU FLUORU VE VEDLEJŠÍCH PIVOVARSKO-SLADAŘSKÝCH PRODUKTECH

Metodika Stanovení obsahu fluoru ve vedlejších pivovarsko-sladařských produktech Autoři: Mgr. Tomáš Horák. Ing. Karel Štěrba, Ph.D. RNDr. Jana Olšovská, Ph.D. Zástupce autorského týmu: RNDr. Jana Olšovská, Ph.D. 1

Poskytovatel: TAČR TE02000177 Centrum pro inovativní využití a posílení konkurenceschopnosti českých pivovarských surovin a výrobků Recenzenti: RNDr. Jiří Zbíral, Ph.D, ÚKZUS NRL, Hroznová 2, 65 606 Brno Prof. Ing. Pavel Dostálek, CSc., Ústav biotechnologie, VŠCHT Praha, technická 5, 16628 Praha Osvědčení o uznání uplatněné certifikované metodiky vydal: MZe, Úsek potravinářských výrob Úřad pro potraviny, Odbor bezpečnosti potravin, Těšnov 17, 117 05 Praha 1, V Praze dne xx.x.2016, osvědčení č. x/2016. Uživatel metodiky: Menedelova univerzita v Brně Číslo interní metodiky VÚPS VÚPS/2016/005-FL Autoři: Ing. Tomáš Horák, Výzkumný ústav pivovarský a sladařský, a.s., Lípová 15, Praha 2, 120 44 Ing. Karel Štěrba, Výzkumný ústav pivovarský a sladařský, a.s., Lípová 15, Praha 2, 120 44 RNDr. Jana Olšovská, Ph.D., Výzkumný ústav pivovarský a sladařský, a.s., Lípová 15, Praha 2, 120 44 Výzkumný ústav pivovarský a sladařský, a.s., 2016 ISBN 978-80-86576-70-1 2

OBSAH Problematika 4 I CÍL METODIKY 4 II VLASTNÍ POPIS METODIKY 5 1. Použitelnost metody 5 2. Princip metody 5 3. Terminologie a definice 5 4. Rušivé vlivy 6 5. Přístroje a zařízení 6 6. Chemikálie, roztoky a materiály 6 7. Odběr a přechovávání vzorků 8 8. Postup stanovení 8 9. Výpočet a vyhodnocení 11 10. Parametry metody 11 III SROVNÁNÍ NOVISTI POSTUPU 13 IV POPIS UPLATNĚNÍ METODIKY 14 V EKONOMICKÉ ASPEKTY METODIKY 14 VI SEZNAM POUŽITÉ SOUVISEJÍCÍ LITERATURY 14 VII SEZNAM PUBLIKACÍ, KTERÉ PŘEDCHÁZELY METODICE 14 3

Problematika Vzhledem k možným škodlivým účinkům nadměrného příjmu fluoru na zdraví zvířat a lidí je obsah fluoru ve vedlejších pivovarsko-sladařských produktech, které jsou používány pro přípravu hospodářských krmiv, (mláto, sladový květ, kvasnice), limitován v souladu s nařízením č. 356/08 právního řádu České republiky. Nařízení odráží pokyny Evropského výboru 2008/76/ES ze dne 25. července 2008 a nařízení Komise EU č. 574/2011 ze dne 16. června 2011, a stanovuje jeho limit v těchto matricích na 150 mg/kg. Producenti krmiv, včetně výše zmíněných pivovarsko-sladařských produktů, musí věnovat pozornost obsahu fluoru v těchto komoditách, neboť u nich může docházet i k překročení tolerovaných mezí. Z tohoto důvodu je nutné mít k dispozici vhodnou metodiku pro stanovení fluoru v těchto matricích. I CÍL METODIKY Cílem metodiky je předložit rutinní, reprodukovatelný postup pro stanovení obsahu fluoru v pivovarsko-sladařských produktech jako je mláto, sladový květ a kvasnice pomocí metody plynové chromatografie, který bude reflektovat pro tyto komodity stanovený legislativní limit 150 mg/kg. 4

II VLASTNÍ POPIS METODIKY 1. Použitelnost metody Metodou lze stanovit obsah fluoru v mlátu, sladovém květu a pivovarských kvasnicích. 2. Princip metody Zvířata jsou vystavena iontové formě prvku, fluoridovému aniontu (F - ), který může být přítomen v krmivech. Ionty fluoru, uvolněné ze snadno rozpustných sloučenin, jsou téměř zcela vstřebatelné z gastrointestinálního traktu monogastrických druhů pasivní difúzí. Extrakční postup této metody proto zahrnuje mírně kyselé působení pomocí 1 mol/l roztoku kyseliny chlorovodíkové, která by měla vyjadřovat koncentraci žaludeční kyseliny chlorovodíkové 0,1 mol/l 0,3 mol/l. Poté jsou fluoridové ionty derivatizovány a extrahovány pomocí trimethylchlorosilanu (TMCS) v toluenu. Fluoridové ionty jsou pomocí tohoto činidla převedeny na trimethylfluorosilan (TMFS). Průběh reakcí ukazuje následující schéma: (CH3)3-Si-Cl + H2O (CH3)3-Si-OH + HCl (CH3)3-Si-OH + H + + F - (CH3)3-Si-F + H2O K přesné kvantifikaci se používá n-pentan jako vnitřní standard. K vlastnímu stanovení se využívá metoda plynové chromatografie za použití plamenoionizačního detektoru. Díky své jednoduchosti, přesnosti a citlivosti je právě plynová chromatografie vhodná pro stanovení i stopových množství fluoru. 3. Terminologie a definice TMCS trimethylchlorosilan TMFS trimethylfluorosilan GC plynová chromatografie FID plamenoionizační detektor 5

4. Rušivé vlivy Odezvy sledovaných látek v chromatogramu jsou čistě separované a nebyly zjištěny interferující látky rušící stanovení. 5. Přístroje a zařízení kádinka 250 ml, 150 ml odměrný válec o objemu 100 ml, 50 ml, 25 ml pipeta o objemu 100 ml, 20 ml, 10 ml, 5 ml, 2 ml stříkačka o objemu 250 µl, 100 µl odměrná baňka o objemu 50 ml a 1 000 ml se zábrusem a skleněnou zátkou papírový filtr Erlenmayerova baňka o objemu 100 ml a 250 ml Büchnerova nálevka s membránovou vývěvou pasterka sušárna laboratorní mlýnek umožňující mletí na velikost částic menší nebo rovné 0,5 mm ultrazvuková lázeň lednice s mrazničkou váhy s přesností 0,0001 g ph metr třepačka kapilární kolona J&W DB-5 (20 m, 0,18 mm, 0,18 mm) nebo ekvivalent od jiného výrobce plynový chromatograf s nástřikem split/spitless, plamenoionizačním detektorem a datastanicí pro sběr a vyhodnocení naměřených dat. 6. Chemikálie, roztoky a materiály trimethylchlorsilan fluorid sodný kyselina chlorovodíková n-pentan toluen 6

redestilovaná voda síran sodný bezvodý helium v kvalitě 5,0 syntetický vzduch vodík v kvalitě 5,0. Příprava roztoku A 50 µl n-pentanu se přidá do 100 ml toluenu. Příprava 1 M kyseliny chlorovodíkové 83 ml kyseliny chlorovodíkové se přidá do odměrné baňky o objemu 1 000 ml a doplní se redestilovanou vodou po rysku. Příprava zásobního a pracovních roztoků standardů Fluorid sodný se suší při teplotě 105 C po dobu 2 h. Zásobní roztok standardu se připraví navážením 0,222 g NaF do 100 ml odměrné baňky a rozpuštěním v redestilované vodě. Pracovní roztok standardu 1 se připraví rozpuštěním 0,1 ml zásobního roztoku v 100 ml odměrné baňce doplněné po rysku redestilovanou vodou. Pracovní roztok standardu 2 se připraví rozpuštěním 0,5 ml zásobního roztoku v 100 ml odměrné baňce doplněné po rysku redestilovanou vodou. Příprava kalibračních standardů Ke 20 ml roztoku pracovního roztoku 1 nebo 2 se přidají 2 ml kyseliny chlorovodíkové a intenzivně se v ruce protřepe po dobu 1 min. Poté se přidají 2 ml chlorotrimethylsilanu. Baňka s touto směsí se umístí do ledové tříště na dobu 15 min. Následně se přidají 3 ml roztoku A a baňka se umístí na třepačku na dobu 20 min. při 250 otáček/min. Po skončení třepání se baňka opět umístí do ledové tříště, což napomůže k oddělení vodní a organické fáze. 2 µl toluenového extraktu se poté nastříknou na kolonu plynového chromatografu k analýze. 7

7. Odběr a přechovávání vzorků Vzorky mláta a pivovarských kvasnic se před stanovením uchovávají uzavřené v láhvi v chladničce, pokud doba do stanovení je delší než 2 dny, tak v zamrazeném stavu. 8. Postup stanovení Příprava vzorku Mláto Vzorek mláta se nejprve suší při teplotě 60 C po dobu 18 h, a poté se umele a homogenizuje. Do Erlenmayerovy baňky se přesně naváží 3 g výše upraveného mláta, přidá se 120 ml 1 M kyseliny chlorovodíkové a baňka se umístí do ultrazvukové lázně na dobu 20 min. Během sonifikace se kontroluje, aby hodnota ph byla stále menší 4, v případě nutnosti se přidá 1 M kyselina chlorovodíková. Po skončení sonifikace se vzorek zfiltruje a získaný filtrát se převede do baňky společně s kyselinou chlorovodíkovou v množství odpovídající desetině objemu získaného filtrátu. Reakční směs se intenzivně protřepe v ruce po dobu 1 min. V následujícím kroku se přidá trichlorotrimethylsilan v množství odpovídající desetině zfiltrovaného objemu, krátce protřepe a ponechá na ledové tříšti po dobu 15 min. Derivatizací vzniklý trimethylfluorosilan se extrahuje 3 ml roztoku A třepáním při 250 otáček/min po dobu 20 min. Následně se baňka umístí do lázně s ledovou tříští k oddělení vodné a toluenové fáze. V případě, že se vytvoří urputná emulze, k jejímu rozrušení se přidá bezvodý síran sodný v množství na špičce lžičky. Následně se odebere toluenová fáze a 2 µl se nastříknou na chromatografickou kolonu. Pivovarské kvasnice Pivovarské kvasnice se zbaví přebytku vody pomocí Büchnerovy nálevky. Poté se přesně naváží 10 g kvasnic do baňky o objemu 250 ml, přidá se 120 ml 1 M kyseliny chlorovodíkové a vzorek se umístí na dobu 20 min do ultrazvukové lázně. Další postup je shodný jako v případě mláta. 8

GC podmínky teplota injektoru: 200 C teplota detektoru FID: 250 C teplotní program: 42 C po dobu 2 min, 20 C/min do 150 C, 150 C po dobu 1 min split: 1:10 tlak na hlavu kolony (helium 5.0): 200 kpa při 80 C. Obrázek 1. Chromatogram vzorku mláta obohaceného fluoridem 9

9. Výpočet a vyhodnocení Jednotlivé látky ve vzorku jsou identifikovány podle retenčních časů. Přibližné retenční časy jsou uvedeny v tab. 1. Tab. 1. Přibližné retenční časy TMFS a n-pentanu jako vnitřního standardu Látka Přibližný retenční čas (min) TMFS 0,98 n-pentan 1,10 Výsledek se vypočte podle následujícího vzorce: c = Avz * AISst * cst * V A * A * m st ISvz vz st c koncentrace fluoridů ve zkušebním vzorku (mg/kg); Avz AISst cst Vst Ast AISvz mvz plocha TMFS ve zkušebním vzorku; plocha n-pentanu v kalibračním standardu; koncentrace fluoridů kalibračního standardu (mg/l); objem pracovního roztoku použitého ke kalibraci (l); plocha TMFS v kalibračním standardu; plocha n-pentanu ve zkušebním vzorku; hmotnost vzorku použitého k extrakci (kg). Vzhledem k dohodě, kde Vst = 0,02 l, se c vypočítá následovně: c hmvz A = vz * A A st ISst * A * c ISvz st * m * 0,02 vz 10

10. Parametry metody Správnost Správnost metody byla stanovena pomocí hodnot výtěžnosti. Nejprve byl stanoven obsah fluoru v pěti vzorcích mláta a pivovarských kvasnicích. Potom byly stejné vzorky obohaceny fluoridem sodným na čtyřech koncentračních úrovních (2,27; 41,66; 504 a 1515 mg F - /kg) a obsah fluoru byl stanoven opakovaně. Každý pokus byl opakován pětkrát. Výsledky jsou uvedeny v tab. 2. Tab 2. Výtěžnost metody stanovení fluoru ve vedlejších pivovarsko-sladařských produktech Hladina obohacení (mg/kg) Výtěžnost (%) RSD a (%) 2.27 99 12 41.66 99 11 504 97 8 1515 96 5 a RSD, relativní směrodatná odchylka Opakovatelnost Opakovatelnost metody byla stanovena pomocí pětkrát opakovaných analýz jednoho a téhož vzorku mláta a pivovarských kvasnic během jednoho dne. Výsledky jsou uvedeny v tab. 3. Mez detekce a mez stanovení Mez detekce byl stanoven jako trojnásobek standardní odchylky získané analýzou 7 totožných vzorků o nízkém obsahu fluoru (0,1 mg/kg). Mez stanovení byl určen jako desetinásobek standardní odchylky získané analýzou 7 totožných vzorků o nízkém obsahu fluoru (0,1 mg/kg). Výsledky uvádí tab. 3. 11

Linearita Byla proměřena pětibodová kalibrační křivka v rozsahu koncentrací 0 2 000 mg/kg. Hodnota koeficientu lineární regrese je uvedena v tab. 3. Tabulka 3. Validační charakteristiky stanovení fluoru ve vedlejších pivovarsko- sladařských produktech r a Výtěžnost (%) Opakovatelnost RSD (%) Mez detekce (mg/kg) Mez stanovení (mg/kg) 0.9995 >96 13 0.007 0.02 a r, regresní koeficient kalibrační křivky. b RSD, relativní standardní odchylka. Nejistota metody Tabulka 4. Rozšířená nejistota (mg/kg) Rozšířená nejistota (mg/kg) 0,04 12

III SROVNÁNÍ NOVOSTI POSTUPU Ke stanovení obsahu fluoridů se obvykle používá metoda iontově selektivní elektrody. Odečítání elektrodového potenciálu roztoku vzorku musí být v lineární oblasti kalibrační křivky. V opačném případě se doporučuje stanovení koncentrace fluoridů pomocí interpolačních hodnot potenciálu v nelineární oblasti kalibrační křivky. Výše popsaná metodika stanovení fluoridu využívá oproti tomu dostupnou a více univerzálně použitelnou instrumentaci, a to plynovou chromatografii. Postup se vyznačuje rozsáhlou lineární oblastí kalibrační křivky. Při použití dávkovače vzorků lze navíc vlastní stanovení na plynovém chromatografu zautomatizovat. Shrnutí: Nově vyvinutá metodika umožňuje stanovení fluoridů ve vedlejších pivovarskosladařských produktech a to v koncentracích hluboko pod limitem vyjádřeným legislativním předpisem a je jí možné používat pro rutinní kontrolu. 13

IV POPIS UPLATNĚNÍ METODIKY Metodika bude uplatněna pro stanovení obsahu fluoru v mlátu a pivovarských kvasnicích. Tyto informace využijí pivovary pro možné využití těchto vedlejších produktů ke krmným nebo potravinářským účelům. V EKONOMICKÉ ASPEKTY METODIKY Ekonomické aspekty nelze jednoznačně vyčíslit. Metodiku využije uživatel výsledku zejména pro výuku, a dále společně s poskytovatelem metodiky pro monitoring obsahu fluoru v krmivech pocházejících z pivovarských surovin v ČR. VI SEZNAM POUŽITÉ SOUVISEJÍCÍ LITERATURY 1. Česká technická norma, ČSN EN 16279: Krmiva Stanovení obsahu fluoridů po extrakci kyselinou chlorovodíkovou metodou iontově selektivní elektrody (ISE), UNMZ, 2014. 2. Nařízení komise (EU) č. 574/2011 ze dne 16. června 2011. Brusel, 2011. 3. Lipka, R., Sobezak, M., Kuś, S., Oszwaldowski, S., Jarosz, M.: Determination of fluoride impurities in Leuprolide. Comparison of analytical methods. Microchem. J. 65, 2000, 51-58. 4. Yuwono, M., Ebel, S.: Determination of fluoride impurities in calcium ascorbate comparison of gas chromatography and ion selective electrode potentiometry. Arch. Pharm. Med. Chem. 330, 1997, 348-352. VII SEZNAM PUBLIKACÍ, KTERÉ PŘEDCHÁZELY METODICE 1. Horák, T., Štěrba, K., Olšovská, J.: The effect of fluorine on animal and human health. Kvasny Prum. 61, 2015, 2-6. 2. Horák, T., Štěrba, K., Olšovská, J.: Quantitative determination of fluorine in spent grain and brewery yeast. J. Inst. Brew., 121, 2015, 193-196. 14

DEDIKACE: Metodika vznikla v rámci řešení projektu TAČR TE02000177, Centrum pro inovativní využití a posílení konkurenceschopnosti českých pivovarských surovin a výrobků. OPONENTI METODIKY: Oponentní posudek odborníka v daném oboru zpracoval: prof. Ing. Pavel Dostálek, CSc., Ústav Biotechnologie, VŠCHT, Technická 5, Praha, 166 28. Oponentní posudek ze státní správy zpracoval: RNDr. jiří Zbíral, Ph.D., ÚKZÚS, Hroznová 63/2, Brno, 60300. PODÍL PRÁCE AUTORŮ METODIKY: Mgr. Tomáš Horák 40 % Ing. Karel Štěrba, Ph.D. 30 % RNDr. Jana Olšovská, Ph.D. 30 % UŽIVATEL METODIKY: Uživatelem metodiky je Mendelova univerzita v Brně, Zemědělská 1/1665, 613 00 Brno, Česká republika. 15

Metodika: Stanovení obsahu fluoru ve vedlejších pivovarsko-sladařských produktech Autoři: Tomáš Horák, Karel Štěrba, Jana Olšovská Vydal Výzkumný ústav pivovarský a sladařský, a.s., jako svou 85. publikaci Redakce: Kvasný průmysl, Lípová 15, 120 44 Praha 2 Tel. 224 915 530, fax 224 920 618 e-mail kvas@beerresearch.cz www.beerresearch.cz, www. kvasnyprumysl.cz Odpovědný redaktor: František Frantík Tisk: Studio SV, s.r.o., Praha Náklad: 50 výtisků ISBN 978-80-86576-70-1 Výzkumný ústav pivovarský a sladařský, a.s., 2016