Inhibitory ATR kinasy v terapii nádorů J.Vávrová, M Řezáčová Katedra radiobiologie FVZ Hradec Králové UO Brno Ústav lékařské chemie LF Hradec Králové UK Praha
Cíl léčby: zničení nádorových buněk zachování normálních buněk Nádorové buňky p53 mutace Ras mutace ATM mutace 75% nádorů Normální buňky p53 +/+ Ras +/+ ATM +/+ Hledají se látky ovlivňující na základě molekulárních mechanismů především nádorové buňky
Strategie buňky v odpovědi na poškození DNA rotinádorová terapie Ionizující záření Cytostatika Poškození DNA Aktivace molekulárních mechanismů Rozpoznání poškození Zástava cyklu, reparace DNA Obrana opravou Smrt buňky, apoptóza, senescence Přežití buněk Obrana eradikací
Odpověď buněk na IR rodinou phosphoinositol 3 kinase like serine/threonine protein kinases (PIKK) ATM a ATR jsou zásadní (vrcholové kinasy) aktivované po gama záření (ATM/ATR) - vznik DSB, SSB a UV záření (ATR) a některých chemoterapeutik (cis platina) -vznik SSB Dochází k autofosforylaci kinas fosforylují řadu cílů důležitých pro zástavu buněk v buněčném cyklu Zásadní rozdíl : ATR kinasa je nezbytná pro přežití buňky knock-out ATR u myší je letální pro vývoj embrya ATM kinasa není nezbytná pro přežití buňky ATM-/- buňky jsou hypersenzitivní k IZ
DSB aktivace ATM P S 1981 Kolokalizace γh2ax a 53BP1 lymfocyty 2 Gy 1 h u lidí s mutovaným ATM genem - onemocnění ataxia-telangiectasia extremně zvýšen ená radiosenzitivita chybí blok v G2 fázi, neschopnost reparace radiačního poškození vstup do mitózy s nereparovanou DNA vysoce zvýšené riziko nádorových onemocnění
Model myší s nedostatkem ATR kinasy tzv. ATR-Seckel myši A,b/ myši ve stáří 3 měsíce C,D novorozené myši Přežití myší se Seckel syndromem urychlené stárnutí Umírají 30. týden po narození Neschopnost reparace DNA poškození akumulace gamah2ax foci Mají ATM - akumuluje se p53, apoptóza nemoci stáří Murga M., et al. Nat.Genet. 2009, 41, 891-898
ATR myši s nízkou hladinou ATR Seckel mice Při vzniku DSB vznikají i SSB Endogenní zdroj SSB je replikační stres (RS) Při každé replikaci vznikají SSB a musí být reparovány a odpověď ATR/ChK1 předchází akumulaci SSB, které by mohly být pro buňku letální V odpovědi na SSB pouze ATR DSB ATM, ATR, DNA-PK odlišná úloha aktivace ATM-Chk2 a ATR-Chk1
Buněčná odpověď na aktivaci ATM a ATR kinasy Poškození DNA DSB Poškození DNA SSB odifikace chromatinu DNA-PK ATRIP RPA ATR P Chk1 P reparace DNA 53BP1 Mre11/Rad50/Nbs1 γh2ax Blok v S fázi G2 blok apoptóza ATM p53 P Chk2 P p21 G1 blok reparace DSB - aktivují jak ATM, tak ATR SSB - aktivují pouze ATR
Selektivní zabití nádorových buněk cíl radioterapie, cytostatické léčby Základní problém je pořád stejný: jak zabít nádorové buňky a nezabít nenádorové Idea je nalézt látky toxické pro mutované (pozměněné) nádorové buňky Senzibilizace nádorových buněk k účinku radioterapie nebo cytostatické léčby Inhibitory ATM/ATR kinasy
Buňky HL-60 (promyelocytární leukémie) bez p53 ztráta G 1 bloku a indukce apoptózy brzy po ozáření prodloužení G 2 bloku, zvyšující jejich schopnost reparace poškození po ionizujícím záření zvýšená radiorezistence aktivace DSB ATM/ATR Kofein nespecifický inhibitor P Chk1 Chk2 P Nádorové supresory Funkční Cdc25 - cyklus Cdc25A Cdc25C protoonkogen Cdk2/ Cyclin E Cdk2/ Cyclin B1 G1 blok G2 blok
Cdc25 A fosfatasa protoonkogen regulující buněčný cyklus Kofein inhibitor ATM/ATR kinas ruší G2 blok po ozáření radiosenzibilizující efekt ruší pokles cdc25a fosfatasy po ozáření radiorezistentní syntéza DNA genomová nestabilita kofein % of cells in G2 phase 75 50 25 0 0 24 48 72 time after beginning of irradiation (h) 6 Gy 23 33 - + - + 2 16 16 7 3 4 LDR LDR+C Cdc25A apoptóza 6 Gy + kofein 3 9 33 36 39 37 36 26
Význam selektivní inhibice ATM a ATR kinasy Selektivní inhibitor ATM - KU55933 2-(morpholin-4-yl-6-thianthren-1-yl-pyran-4-one) relativně malý radiosenzibilizující efekt Selektivní inhibitor ATR - VE-821 3-amino-6-(4-(methylsulfonyl)phenyl-N-phenylpyrazine-2-carboxamide) má podobný efekt jako kofein??normální buňky není známo, zda budou schopny reparovat replikační chyby s malým množstvím ATR kinasy
Srovnání účinku inhibitoru ATM kinasy (KU55933) a inhibitoru ATR kinasy (VE-821) na buňky HL-60 (p53 0) ozářené dávkou 3 Gy G2 blok Apoptóza (sub G1)
VE-821 144 h inkubace s VE-821 (3-10 um) Zabití nádorových buněk Synergický efekt s carboxy-platinou 96 h MTS assay Podobně s cis-platinou Nádorové buňky Normální buňky Reaper PM. Et al. Nature chemical biology 7, 2011, 428-430.
IDEÁL Reaper PM. Et al. Nature chemical biology 7, 2011, 428-430.
Inhibice ATR a Chk1 kinas Zruší blok v S a G2 fázi Povede k senzibilizace především buněk P53-/- a ATM -/- Selektivní senzibilizace nádorových buněk Reparace u nádorových buněk přes Chk1 je nutná, nemají mnoho dalších cest k reparaci U normálních buněk se aktivují ještě další reparační mechanismy přes MAPK a především kinasu p38
Děkuji za pozornost