Sekvenace aplikace ve virologické diagnostice. Plíšková Lenka FN Hradec Králové

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Sekvenace aplikace ve virologické diagnostice. Plíšková Lenka FN Hradec Králové"

Milada Kovářová
před 6 lety
Počet zobrazení:

1 Sekvenace aplikace ve virologické diagnostice Plíšková Lenka FN Hradec Králové

2 Vývoj sekvenačních technik 2.generace sekvenování až tisíců molekul najednou 1.generace detekce DNA bazí za sebou Stratton et. al. 2009, Nature 458:

3 Sekvenování dle Sangera analýza 1 amplikonu citlivost %

4 Využití ve virologii Typizace, určení druhů - EV sp. (epidemie Náchod) - typizace chřipky Vyšetření rezistence na antivirotika - průkaz záměn nt (přirozené varianty virů, vznikající tlakem léčby) HIV CMV, HSV HBV, HCV chřipka

5 QCMD nezávislá organizace EQA HBV (RT) LiPA, SA - IH pilotní studie , , CMV (UL97 kináza, UL54 polymeráza) pilotní studie , výsl. 29 lab. pouze IH - SA pilotní studie , výsl. 32 lab. 6 komerční, 26 IH

6 QCMD nezávislá organizace EQA HSV 2016 pilotní studie (HSV1, HSV2) UL 23 gen TK UL 30 gen DNA polymeráza HCV 2014 pilotní studie proteáza (NS3/4A), 33, výsl. 21 lab.

7 DAA přímo působící antivirotika v léčbě chron. hepatitidy C V r.2011 zahájena léčba chronické virové hepatitidy C přímo působícími antivirotiky nové možnosti DAA přípravky přímo zasahují do replikačního cyklu HCV, replikace - inhibována v různých krocích replikačního cyklu v důsledku toho rezistence na léčbu Strukturální Nestrukturální Kapsida Obálkové glykoproteiny Sestavení viru Proteáza Serinová proteáza Tvorba membranózní sítě Virová replikace nebo agregace RNA dependentní RNA polymeráza Proteázové inhibitory simeprevir Inhibitory NS5A Daclatasvir,

8 Vznik rezistence U dosud neléčených pacientů preparáty DAA byly pozorovány i přirozené změny HCV NS3/4, NS5A a NS5B aminokyselin vedoucí k nižší citlivosti na léky, tzv. předléčebné rezistenční varianty RAV (resistance associated amino acid variants) akumulace variant viru, vykazujících různý stupeň rezistence k DAA Pro léčbu pacientů s chronickou hepatitidou C s genotypem 1a - uvolněn přípravek simeprevir - specifický inhibitor virové NS3/4A serinové proteázy. Před léčbou doporučeno vyšetřit NS3 polymorfismus Q80K (předléčebné rezistenční varianty RAV - resistance associated amino acid variants)

9 Prevalence Q80K v Evropě Země prevalence Q80K (%) Bulharsko 0 Polsko, Rumunsko, Španělsko, Norsko < 5 Francie, Itálie, Rakousko, Portugalsko, Belgie, Nizozemsko 5-10 Německo, Švédsko Velká Británie Česká republika, Slovensko, Maďarsko, Ukrajina, Dánsko, Švýcarsko, Irsko, Řecko, Turecko < 20

10 Vyšetření inhibitorů v genu pro proteázu NS3/4 (Q80K) Metodou sekvenační analýzy Vyšetření z nesrážlivé krve (EDTA) u pacientů s HCV infekcí s prokázaným genotypem 1a a virémií Nižší účinnost léčby simeprevirem je spojována i s dalšími variantami v kodonech: 36, 41, 43, 54, 55, 107, 122, 132, 138, 155, 156, 158, 168, 169, 170, 174, 175, ale jejich prevalence dosahuje pouze 1-2 %

11 Vyšetření rezistence na Q80K K sekvenační PCR byly použity primery F NS3-91, Vlastní sekvenační analýza byla provedena na sekvenátoru ABI 3130 / 3500 R NS3-504 Analýza získané sekvence se provádí pomocí dvou vyhodnocovacích programů

12 Hodnocení (využití několika hodnotících programů současně) hing/ - vyhledání klinicky významných variant či mutací porovnáním získané sekvence se sekvencí referenční (HCV NS3, CMV, HSV1,...) ulm.de/ni/ mitarbeiter/hkestler/ mra/app/index. php?plugin= form - propojení s aktuální databází publikací (HCV NS3, CMV, HSV1)

13 Q80K (CAG AAG) glutamin - lysin

14 Naše výsledky

CMV rezistence Klinická rezistence Neklesající virová nálož po dobu 1 3 týdnů řádně vedené terapie Fenotypové metody (kultivace na tkáňových kulturách s následnou plaque redukční metodou ) časově

15 CMV rezistence Klinická rezistence Neklesající virová nálož po dobu 1 3 týdnů řádně vedené terapie Fenotypové metody (kultivace na tkáňových kulturách s následnou plaque redukční metodou ) časově náročné Genotypové metody průkaz mutací v oblastech: UL97 kódující virovou thymidin kinázu, rezistence v % proti GCV UL54 kódující virovou DNA polymerázu méně; rezistence proti foscarnetu a cidofoviru

16 PCR sekvenace Izolace DNA z biolog. materiálu Kvantitativní stanovení real-time PCR citlivost: kopií/ml Standardní PCR UL bp, kodony UL54 doména IV a delta reg C 960 bp, kodony doména II až V 1129 bp, kodony

17 UL97 gen UL54 gen

18 Výsledky studie Grant IGA Rizikové faktory vzniku rezistence CMV vůči virostatikům u pacientů po alogenní transplantaci hematopoetických kmenových buněk 70 transplantovaných pacientů retrospektivně vyšetřených v letech U 10 % vysloveno podezření na klinickou rezistenci Ve 3 případech prokázána rezistence na ganciclovir v oblasti UL 97(mutace L595F, N510S, M460I)

19 Vývoj sekvenačních technik Stratton et. al. 2009, Nature 458:

20 Sekvenátory nové generace Masivní paralelní sekvenování až tisíců molekul DNA současně (oproti Sanger sekvenování detekují nt báze jednu po druhé) Dnes na trhu dominují firmy Illumina a Life Technol., Roche na ústupu Společné kroky - příprava templátu (knihovny) k sekvenování - sekvenování a detekce inkorporovaných nt - analýza dat

22 Přínos NGS do virologické diagnostiky zvýšení citlivosti oproti normálnímu sekvenování 1 % oproti % sledování změn v čase (procentuální kvantifikace) nebo informace navíc vzorek přečten x 100 % záměna nt 5000 x 5 % záměna nt x 50 %

23 Porovnání možností NGS Sanger u CMV rezistence Cíl srovnání 2 metod sekvenování (Sanger a NGS) při detekci dvou vybraných mutací CMV způsobujících rezistenci na GCV Provedli jsme SA genu UL97 u dvou pacientů s rezistencí na GCV v čase. Jednalo se o mutace L595F a M460I. U pacienta č.1 (mutace L595F) jsme provedli sekvenci dle Sangera na sekvenátoru ABI 3130 a platformy NGS MiSeq Illumina ve 12 odběrech v čase, u pacienta č. 2 (mutace M460I) v 8 odběrech

24 Výsledky sekvenování MiSeq x Sanger pacient č. 1 - L595F 120% MiSeq Illumina Porovnání výsledků MiSeq x Sanger (%) 100% 80% 60% 40% 20% 83 dnů od HSCT max.virémie cp/ml klinická rezistence 130 dnů od HSCT Sanger 0% cp CMV DNA/ml odběry krve

25 Výsledky sekvenování MiSeq x Sanger pacient č. 2 - M460 porovnání výsledků MiSeq x Sanger (%) 120% 100% 80% 60% 40% 20% 140 dnů od HSCT klinická rezistence 168 dnů od HSCT MiSeq Illumina Sanger 0% odběry vzorků cp CMV DNA/ml

26 Experimentálně jsme ověřili vysokou citlivost záchytu mutací pomocí NGS oproti sekvenování dle Sangera NGS v čase umožnilo získat data o procentuálním zastoupení mutovaných kmenů u pacientů s rezistencí na GCV

27 Nedostatky NGS brání používání ve virologické dg. Poměrně náročná příprava templátu /pracovní postup Bioinformatika, chybí programy pro vyhodnocování dat obrovský objem dat, jak s nimi naložit? dlouhé časy vydání výsledku ( TAT ) Správná interpretace (ve vztahu ke klinické relevanci)

28 Využití NGS pro detekci rezistencí HCV (NS3 gen, NS5 gen) HSV1 a HSV2 Problémy se zavedením metody - návrh primerů (délka bp) - optimalizace přípravy knihovny - analýza dat!!!!!!!!!!

29 NGS software v klinické virologii Software DeepCheck - analýza resistence u HIV a HCV Exatype TM testování lékové rezistence u HIV geno2pheno[454] testování tropismu HIV Diagnostické testy se softwarem Sentosa SQ HIV Genotyping Assay

31 Požadavky na NGS systém pro rutinní virologickou diagnostiku snadná příprava vzorků/pracovní postup objem dat přizpůsobený diagnostickým potřebám efektivita nákladů pohotová bioinformatika - SW přijatelné časy analýzy ( TAT ) důraz na interpretace (ve vztahu ke klinické relevanci)

32 Děkuji za pozornost

Podobné dokumenty

Externí kontrola kvality sekvenačních analýz

Externí kontrola kvality sekvenačních analýz Radka Bolehovská 1, Lenka Plíšková 2, Kateřina Hrochová 2 Úsek molekulární biologie, 1 Ústav klinické mikrobiologie 2 Ústav klinické biochemie a diagnostiky