UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ. Katedra anorganické a organické chemie PŘÍPRAVA ANALOGŮ FYTOCERAMIDŮ

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra anorganické a organické chemie PŘÍPRAVA ANALOGŮ FYTOCERAMIDŮ A HODNOCENÍ JEJICH VLIVU NA BARIÉROVOU FUNKCI KŮŽE Diplomová práce Školitel: doc. PharmDr. Kateřina Vávrová, Ph.D. 2013 Ondřej Tesař

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpal, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu. V Hradci Králové, dne 23.8. 2013 Ondřej Tesař 2

PODĚKOVÁNÍ Tímto bych rád poděkoval své školitelce doc. PharmDr. Kateřině Vávrové, Ph.D. za vedení, pomoc, nesmírnou ochotu a trpělivost. Dále pak pracovníkům Katedry anorganické a organické chemie za vstřícný přístup a příjemné pracovní prostředí. 3

ABSTRAKT Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra anorganické a organické chemie Kandidát: Ondřej Tesař Školitel: doc. PharmDr. Kateřina Vávrová, Ph.D. Název diplomové práce: Příprava analogů fytoceramidů a hodnocení jejich vlivu na bariérovou funkci kůže Fytoceramidy (FCER) patří do skupiny sfingolipidů. Jsou tvořeny bazickým alkoholem fytosfingosinem (P) a acylovým řetězcem. Společně s dalšími lipidy tvoří extracelulární membránu v lidském stratum corneum (SC), nejsvrchnější vrstvě kůže, která nás chrání před ztrátami vody a průnikem cizorodých látek do našeho těla. O vlivu struktury FCER na funkci této membrány se toho zatím mnoho neví. Cíl práce: Cílem této práce bylo prozkoumat, jakou úlohu hraje v nepropustnosti této bariéry délka postranního nehydroxylovaného acylového řetězce FCER. Metody: Mým úkolem bylo syntetizovat FCER s délkou acylu 2, 4, 6, 24 uhlíků a příprava modelových membrán SC obsahující FCER s délkou acylu 2, 4, 6, 8 nebo 24 uhlíků, dále pak cholesterol, kyselinu lignocerovou a cholesterol sulfát. Permeabilita modelových membrán byla hodnocena ve Franzových difuzních celách. Jako měřené veličiny byly zvoleny elektrická impedance a propustnost pro 2 modelová léčiva: theofylin (TH) a indomethacin (IND), které byly stanoveny pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC). Hlavní poznatky: Zjistili jsme, že membrány obsahující FCER s krátkým řetězcem jsou několikanásobně propustnější než kontrolní membrány s fyziologickým FCER s 24 uhlíkatým acylem. Nejpropustnější byly membrány obsahující 4 uhlíkatý analog (přibližně 2,7x propustnější pro ionty, 10,5x pro TH, 2,8x pro IND oproti kontrole). 4

Je tedy patrné, že podobně jako pro ceramidy (CER) odvozené od sfingosinu (S) a dihydrosfingosinu (DS) je i pro FCER dostatečně dlouhý acyl nezbytný pro zachování jejich bariérových vlastností. V druhé části práce byl zkoumán vliv polární hlavy CER na bariérové vlastnosti. Byly připraveny modelové membrány obsahující CER se stejně dlouhými řetězci odvozené od P, DS, S a syntetický analog CER - tetradecyl ester kyseliny (S)-2-tetrakosanoylamino-3-hydroxypropionové (14S24). Membrány byly hodnoceny stejným způsobem jako ty obsahující FCER. Ukázalo se, že propustnost těchto membrán je srovnatelná, pouze propustnost membrány z 14S24 pro TH byla oproti ostatním signifikantně vyšší. Závěr: Tato práce je prvním krokem k objasnění vlivu struktury FCER na bariérové vlastnosti kůže a bude podkladem pro další výzkum. Klíčová slova: fytoceramid, stratum corneum, modelová membrána, NP 5

ABSTRACT Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradci Králové Deparment of Inorganic and Organic Chemistry Candidate: Ondřej Tesař Supervisor: doc. PharmDr. Kateřina Vávrová, Ph.D. Title of diploma thesis: Synthesis of phytoceramide analogues and evaluation of their effect on the skin barrier properties. Phytoceramides (FCER) belong to the class of sphingolipids. They are composed of a basic alcohol phytosphingosine (P) and the acyl chain. Together with the other lipids they create the extracellular membrane in human stratum corneum (SC), the uppermost layer of the skin, which protects us against the loss of water and penetration of foreign compounds into our body. The influence of FCER structure on the function of this membrane is unknown yet. Aim of the work: The aim of this work was to examine what role the acyl chain length of FCER plays in this membrane impermeability. Methods: My task was to synthetize FCER with acyl chain length of 2, 4, 6 and 24 carbons and preparation of SC model membranes containing FCER with acyl chain length of 2, 4, 6, 8 or 24 carbons, cholesterol, lignoceric acid and cholesterol sulfate. The permeabilities of the model membranes were evaluated in Franz diffusion cells. Electric impedance and permeability for two model drugs: theophylline (TH) and indomethacin (IND), which were determined by high performance liquid chromatography (HPLC). Main findings: We discovered that the membranes with short acyl chain FCER are several times more permeable than the control membranes with the physiological FCER with acyl chain length of 24 carbons. The most permeable membrane was the one 6

containing 4 carbons acyl analogue (approximately 2,7 times more for ions, 10,5 times for TH, 2,8 times for IND rather than control). Thus, sufficient acyl chain length in FCER is necessary to maintain their skin barrier properties similar as for ceramides (CER) derived from sphingosine (S) and dihydrosphingosine (DS). The influence of the polar head structure of CER on their barrier properties was studied in the second part of this work. Model membranes composed of CER derived from P, DS, S and synthetic analogue tetradecyltetracosanoyl-l-serinate (14S24) with equal chain length were prepared. The membranes were evaluated the same way as membranes made of FCER. We discovered that the permeability of the membranes were comparable, only the permeability for TH of membrane 14S24 was significantly higher. Conclusinon: This work is the first step for clarification of the influence of FCER structure on the skin barrier properties and will be foundation for further research. Keywords: phytoceramide, stratum corneum, model membrane, NP 7

OBSAH PROHLÁŠENÍ...2 PODĚKOVÁNÍ...3 ABSTRAKT...4 ABSTRACT...6 OBSAH...8 1. CÍL PRÁCE...10 2. TEORETICKÁ ČÁST...11 2.1. Kožní bariéra...11 2.2. Cesty průniku látek kůží...13 2.3. Struktura ceramidů...14 2.4. Složení mezibuněčné matrix v lidském stratum corneum...15 2.5. Uspořádání lipidů v mezibuněčné matrix stratum corneum...16 2.6. Vlastnosti a úloha fytoceramidů...18 3. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST...19 3.1. Přístroje a chemikálie...19 3.2. Syntéza...20 3.2.1. N-((2S,3S,4R)-1,3,4-trihydroxyoktadekan-2-yl)hexanamid (NP6)...20 3.2.2. N-((2S,3S,4R)-1,3,4-trihydroxyoktadekan-2-yl)tetrakosanamid (NP24)...21 3.2.3. N-((2S,3S,4R)-1,3,4-trihydroxyoktadekan-2-yl)butyramid (NP4)...21 3.2.4. N-((2S,3S,4R)-1,3,4-trihydroxyoktadekan-2-yl)acetamid (NP2)...22 3.2.5. Charakteristiky získaných fytoceramidů...22 3.3. Permeační pokusy...25 3.3.1. Příprava modelových membrán...25 3.3.2. Franzova difuzní cela a permeace...26 3.3.3. Měřené veličiny, podmínky HPLC analýzy...27 8

4. VÝSLEDKY...28 4.1. Vliv délky acylu fytoceramidu na bariérové vlastnosti lipidové směsi...28 4.2. Vliv polární hlavy cermidu na bariérové vlastnosti lipidové směsi...29 5. DISKUSE...31 5.1. Syntéza fytoceramidů...31 5.2. Permeační pokusy...31 5.3. Délka acylu fytoceramidu...32 5.4. Polární hlava cermidu...32 6. ZÁVĚR...33 7. SEZNAM ZKRATEK...34 8. LITERATURA...36 9

1. CÍL PRÁCE V dřívějších pracích byl popsán vliv nefyziologických ceramidů (CER) s velmi krátkým acylem odvozených od sfingosinu (S) (1) (2) a dihydrosfingosinu (DS) (3) na propustnost modelových lipidových membrán napodobujících některé důležité parametry kožní bariéry. Cílem této práce je: a) Připravit sérii CER odvozených od fytosfingosinu (P) s délkou acylu 2, 4, 6 a 24 uhlíků. b) Na modelových membránách napodobujících složení lipidové kožní bariéry objasnit vliv délky acylu na bariérové vlastnosti lipidických směsí obsahující fytoceramidy (FCER). c) Porovnat vliv struktury polární hlavy u CER odvozených od S, DS, P a analogu CER tetradecylesteru kyseliny (S)-2-tetrakosanoylamino-3-hydroxypropionové (14S24) na bariérové vlastnosti modelu stratum corneum (SC). 10

2. TEORETICKÁ ČÁST 2.1. Kožní bariéra Klíčovou funkcí kůže je oddělovat vnitřní prostředí od nepříznivého vnějšího prostředí. Kůže nás chrání před mechanickým poškozením, ultrafialovým zářením, chemickými látkami a patogenními mikroorganismy (obrázek 1.). Ale abychom mohli přežít na souši, musí nás kůže chránit před ztrátami vody a elektrolytů. Bez této nepropustné bariéry by život na souši nebyl možný. Mechanickou bariéru představuje SC lokalizována ve vnější vrstvě epidermis. Je tvořena korneocyty (terminální stádium diferenciace keratinocytů) obklopené hydrofobní lipidovou extracelulární matrix (4), která tvoří bariéru proti pohybu vody, elektrolytů i cizorodých látek. obrázek 1. Funkce kožní bariéry cesty průniku z a do organismu (5). 11

Korneocyty jsou zrohovatělé odumřelé buňky, pro které je charakteristický plochý tvar a vysoký obsah proteinů (80-90 % filaggrin a keratin). Úloha filaggrinu v kožní homeostáze je jen částečně známa. Spolu s vlákny keratinu tvoří pevné svazky, které podporují zhroucení buňky do plochého tvaru při diferenciaci. Mechanickou odolnost SC zajišťují desmozomy proteinové můstky mezi korneocyty (obrázek 2.). Desmozomy jsou také důležité při odlupování kůže. Některé mezibuněčné lipidy SC se pomocí esterové vazby vážou na involucrin, envoplakin a periplakin, které jsou obsažené v lipidové membráně korneocytu a stabilizaci mezibuněčných lipidových vrstev - lamel (5). Mezibuněčná matrix tvoří jedinou kontinuální fázi SC, a pro většinu látek je hlavní cestou, kudy mohou pronikat látky do a z organismu. Proto složení a organizace lipidů mezibuněčné matrix jsou klíčové pro její bariérovou funkci. Hlavními lipidy v lidském SC jsou cholesterol (CH), volné mastné kyseliny (FFA) a ceramidy (CER) (6). Stavbu SC lze nejlépe přirovnat ke zdi z cihel (korneocyty) a malty (lipidová matrix) (7). obrázek 2. Schématický nákres SC. Korneocyty jsou obalené zrohovatělou proteinovou vrstvou a lipidovou vrstvou, na níž se fixují mezibuňečné lipidy. Pevnost vrstvy zajišťují diferencované desmozomy (corneodesmozomy) (5). 12

2.2. Cesty průniku látek kůží Látky mohou pronikat přes kůži do cévního řečiště několika způsoby (obrázek 3). První možností je prostup nejkratší cestou skrz korneocyty (transcelulární cestou), zde ale musí překonat mnoho fázových rozhraní, nebo nejčastěji mezibuněčnými prostory (intercelulární cestou). V obou případech musí překonat lipidovou matrix SC. Další možností je prostup zkratkou přes póry v kůži (potní a mazovou žlázou nebo vlasovým folikulem). Vlastní mechanizmus prostupu jednotlivých látek závisí především na velikosti molekuly, lipofilitě a schopnosti tvořit vodíkové vazby (2) (8) (9). obrázek 3. Schématický řez kůží; A stratum corneum, B živá epidermis, C dermis, D podkožní tuk, 1 cesta potní žlázou, 2 cesta mazovou žlázou, 3 transfolikulární cesta, 4 intercelulární cesta, 5 transcelulární cesta (9) 13

2.3. Struktura ceramidů CER tvoří obrovskou skupinu látek. Původně byly pojmenovány podle pořadí eluce na tenkovrstvé chromatografii (TLC), avšak s postupem času byly objevovány stále nové a nové CER a bylo potřeba změnit názvosloví. Pro účely této práce bylo zjednodušeno názvosloví podle Masukawy et al. (2008) (10). Molekula CER se skládá ze dvou částí. Ze sfingoidní báze, a to buď ze sfingosinu, dihydrosfingosinu, fytosfingosinu nebo 6-hydroxysfingosinu (značeny S, DS, P, H), ke které je připojena amidovou vazbou dlouhá mastná kyselina, která může být nehydroxylovaná (značená N), α-hydroxylovaná (A) nebo esterifikovaná ω-hydroxylovaná (EO) (6). Na základě této terminologie je vyjádřeno 12 podskupin CER: NDS, NS, NP, NH, ADS, AS, AP, AH, EODS, EOS, EOP, EOH (tabulka 1.). Pro přehlednost není v této práci vyznačena délka sfingoidní báze, neboť je tu stejná pro všechny CER a to 18 uhlíků. Číslovka za označením typu CER vyjadřuje pouze délku acylu. Například NDS24 označuje CER složený z DS a kyseliny tetrakosanové. tabulka 1. Struktura a názvosloví CER v lidském SC (10). 14

2.4. Složení mezibuněčné matrix v lidském stratum corneum Charakteristickým znakem pro SC je její heterogenita v lipidovém složení. Je tvořena přibližně ekvimolární směsí CER, CH a FFA. Z celkové hmotnosti extracelulárních lipidů SC tvoří CER 45-50 %, CH pak 25 %, FFA 10-15 % a ostatní lipidy, z nichž nejdůležitější je cholesterol sulfát, méně než 5 % (11). Právě toto unikátní složení umožňuje vznik mnohovrstevnaté lamelární struktury. CH hraje důležitou roli v mísení lipidů různých struktur. V závislosti na jeho množství může zvyšovat nebo snižovat fluiditu membrány. FFA jsou především zastoupeny nasycenými mastnými kyselinami s délkou řetězce C16-C30, přičemž největší množství tvoří C22 a C24. Z nenasycených jsou zastoupeny kyselina olejová a linolová (2). Navíc mastné kyseliny zvyšují rozpustnost CH a mohou tak hrát klíčovou úlohu v nepropustnosti kožní bariéry (12). SC obsahuje širokou paletu CER širší, než kdekoliv jinde v lidském těle. V buňkách/tkáních (kromě vlasů a SC) jsou obsaženy 3 strukturální typy CER: NS, NDS a AS, všechny s délkou sfingoidní báze 18 uhlíků. Vlasy obsahují mnohem komplexnější směs CER. Byly zde identifikovány 4 strukturální podskupiny CER: NS, NDS, AS a ADS. Nicméně počet uhlíků sfingoidních bází byl 16-20. Lidské SC je ale z hlediska struktury CER ještě více různorodé (10). Doposud bylo popsáno 12 strukturálních podskupin CER viz (tabulka 1.) (6). Délka řetězců jednotlivých podskupin CER zjištěných v SC je znázorněna níže (tabulka 2.). tabulka 2. Počet uhlíků v řetězcích jednotlivých podskupin CER (kromě EODS) (6). 15

2.5. Uspořádání lipidů v mezibuněčné matrix stratum corneum Podobně jako u fosfolipidů se molekula CER skládá z polární hlavy a hydrofobního řetězce. Nicméně polární hlava CER je ve srovnání s fosfolipidy mnohem menší a tak mohou být CER mnohem těsněji uspořádány. Organizují se do několikavrstvé struktury - lamel (obrázek 4.) (13), které jsou tvořeny cca 13 nm širokou, opakující se sekvencí 3 pásů (široký úzký široký / cca 5 nm 3 nm 5nm) s nízkou elektronovou hustotou, která je označována jako fáze s dlouhou periodicitou (LPP). K zformování této fáze je nezbytný CER EOS (14) (15), který svým velmi dlouhým ω-hydroxylovaným acylovým řetězcem prostupuje skrz dvojvrstvu lipidů a spojuje je tak do této neobvyklé struktury. Dále se v lidském SC vyskytuje cca 6 nm široká fáze, označované jako fáze s krátkou periodicitou (SPP), která se skládá pouze z 2 pásů a tvoří klasickou dvojvrstvu, podobně jako fosfolipidy. Na rozdíl od SPP má LPP unikátní strukturu, která byla prokázána v lidském, prasečím i myším SC. Z tohoto důvodu se vyvozuje, že hraje velmi důležitou úlohu v bariérové funkci kůže (2) (12) (16) (17) (18). obrázek 4. Mezibuněčná lamelární struktura SC. Šipky ukazují intercelulární lamely. Desmozom je označen D. Měřítko v levém dolním rohu je 50 nm (13). 16

Lipidy jsou v lamelách uspořádány kolmo na směr lamel ve 2 krystalových mřížkách a to buď orthotrombicky v krystalické fázi nebo hexagonálně ve fázi gelové nebo neuspořádaně v kapalně krystalické fázi (2). "Sendvičový model" (obrázek 5.) navržený roku 2000 vysvětluje uspořádání těchto fází v lamelách (18). (Jiný názor - model představující jednu soudržnou gelovou fázi představil Norlén (2003) (19).) Orthotrombické uspořádání je těsnější a je považováno za méně propustné, nicméně v nedávné studii (20) se ukázalo, že na propustnost modelového léčiva kyseliny benzoové neměla změna krystalinity žádný vliv. Naopak zásadní se ukázalo zachování lamelární struktury. obrázek 5. "Sendvičový model" popisuje přítomnost fluidní fáze v SC, která je umístěna především v úzké vrstvě (v prostředku) LPP. Tato gelová fáze nejspíše přechází v kompaktnější a méně pohyblivé fáze po stranách. Toto uspořádání brání vytvoření nového rozhraní (17) (18). 17

2.6. Vlastnosti a úloha fytoceramidů Oproti S obsahuje P v poloze 4 hydroxylovou skupinu místo trans dvojné vazby (obrázek 6.). I tato zdánlivě malá změna má velké dopady na teplotu tání CER, uspořádání řetězců, krystalinitu a vodíkové vazby daného CER v SC (21). obrázek 6. Porovnání struktury CER odvozených od P a S.. Chování hydratovaných CER odvozených od P a S zkoumali Rerek et al. (2001 a 2005) (21) (22). Ukázalo se, že CER odvozené od S jsou mnohem těsněji uspořádané než ty odvozené od P, jehož molekula zabírá mnohem větší prostor. Díky vodíkovým vazbám polární hlavy CER odvozených od P je teplota tání vyšší a tvoří také pevnější spojení mezi svými molekulami. Dvojná vazba, která nedává molekule CER odvozených od S takovou volnost, a menší síla vodíkových vazeb mezi polárními hlavami je pravděpodobně podmínkou pro orthotrombické uspořádání molekul při tělesné teplotě, které je pro tyto CER charakteristické. Naopak CER odvozené od P krystalují v hexagonální mřížce. Zatímco CER odvozené od S díky orthotrombickému uspořádání tvoří krystalickou fázi, CER odvozené od P hojně interagují s FFA za účasti CH a tvoří tak gelovou fázi a navíc pomáhají propojit tyto dvě fáze. Zvyšují pevnost lipidového uspořádání a spolu s ostatními CER tvoří relativně nepropustnou SC (21). Nedostatek CER NP byl zaznamenán u nemocí spojených se sníženou funkcí kožní bariéry, jako jsou atopická dermatitida, psoriáza a suchá kůže (2). SC je velmi citlivé na změny složení CER. Poznatky výše popsané naznačují, že CER odvozené od P by mohly hrát důležitou roli pro správnou bariérovou funkci kůže. 18

3. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 3.1. Přístroje a chemikálie CER N-((2S,3R,E)-1,3-dihydroxyoktadek-4-en-2-yl)tetrakosanamid (NS24), N-((2S,3R)-1,3-dihydroxyoktadekan-2-yl)tetrakosanamid (NDS24) a N-((2S,3S,4R)-trihydroxyoktadekan-2-yl)oktanamid (NP8) byly zakoupeny od firmy Avanti PolarLipids (Alabaster, USA), P od firmy TCI (Haven, Belgium). Pseudoceramid 14S24 byl syntetizován na katedře anorganické a organické chemie (Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové) v rámci dosavadního výzkumu (23). Všechny další chemikálie a rozpouštědla byly zakoupeny od firmy Sigma-Aldrich (Schnelldorf, Německo). Pro TLC byly použity desky Silica gel 60 F 254 (Merck). Teploty tání byly změřeny na Koflerově přístroji. Struktura a čistota produktů byla ověřena spektry nukleární magnetické rezonance (NMR): 1 H-NMR (300MHz nebo 500 MHz) a 13 C-NMR (75 MHz nebo 125 MHz) (Varian Mercury-Vx BB nebo VNMR S500) a hmotností spektrometrií (MS) (Agilent 500 Ion Trap LC/MS). 19

3.2. Syntéza Při syntéze CER typu NP jsme vycházeli z komerčně dostupného P a příslušné kyseliny. Využili jsme zkušeností z předchozích prací (1), a tak byla zvolena kondenzace pomocí N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylkarbodiimidu (WSC) (obrázek 7.). obrázek 7. Syntéza CER typu NP. 3.2.1. N-((2S,3S,4R)-1,3,4-trihydroxyoktadekan-2-yl)hexanamid (NP6) Všechny reaktanty byly použity v ekvimolárním množství (0,5 mmol). Do suché varné baňky bylo naváženo 159 mg P (M r = 317,51), 58 mg NHSI (M r = 115,09) a vloženo míchadlo. Baňka byla uzavřena septem, zavedena dusíková atmosféra a přidáno rozpouštědlo (bezvodý THF). Poté bylo přidáno 68 µl kyseliny hexanové (M r = 116,2; ρ = 0,85 g.ml -1 ) a nakonec postupně přidáno 87 µl WSC (M r = 155,2; ρ = 0,877 g.ml -1 ) v bezvodém DCM. Reakce byla ponechána do druhého dne (přibližně 24h) při laboratorní teplotě. Aby se odstranily případné zbytky kondenzačního činidla a vedlejší produkty, byla směs vytřepána vodou následujícím způsobem: Směs byla zředěna chloroformem a poté 3x vytřepána destilovanou vodou. Spojené vodné frakce byly 3x protřepány chloroformem. Spojené chloroformové frakce byly 1x vytřepány destilovanou vodou okyselenou kapkou koncentrované HCl. Chloroformová frakce byla vysušena 20

bezvodým síranem sodným a oddestilována na vakuové odparce. Tímto způsobem byly připraveny všechny následující CER. Pro přečištění sloupcovou chromatografií byla zvolena mobilní fáze chloroform: methanol v poměru 20:1 (v/v) a 50g silikagelu. Bylo získáno 83 mg (40 % z teoretického výtěžku) bezbarvé krystalické látky. 3.2.2. N-((2S,3S,4R)-1,3,4-trihydroxyoktadekan-2-yl)tetrakosanamid (NP24) NP24 byl připraven analogicky jako NP6. Výchozí látky byly použity v ekvimolárním množství (0,945 mmol). Do varné baňky bylo naváženo 300 mg P, 348 mg kyseliny tetrakosanové (M r = 368,65) a 109 mg NHSI. Po zavedení dusíkové atmosféry a přidání rozpouštědla bylo přikapáváno166 µl WSC v DCM a reakce ponechána do druhého dne při laboratorní teplotě. Po vytřepání byl produkt opět přečištěn sloupcovou chromatografií. Nejprve jsme použili mobilní fázi chloroform: methanol v poměru 30:1 (v/v), ale nepodařilo se získat čistou látku. Proto jsme použili mobilní fázi chloroform: methanol 20:1(v/v) a 50 g silikagelu. Bylo získáno 74,8 mg bezbarvé krystalické látky (11,9 % z teoretického výtěžku). 3.2.3. N-((2S,3S,4R)-1,3,4-trihydroxyoktadekan-2-yl)butyramid (NP4) Opět bylo využito analogického postupu. Všechny reaktanty byly použity v ekvimolárním množství (0,472 mmol): 150 mg P, 54,3 mg NHSI, 431,5 µl 10% kyseliny máselné (M r = 88,11; ρ 10% = 0,964 g.ml -1 ) a 84 µl WSC. Reakce byla opět ponechána do druhého dne při laboratorní teplotě. Po vytřepání byl produkt přečištěn sloupcovou chromatografií. Bylo použito 60 g silikagelu a mobilní fáze chloroform: methanol v poměru 20:1. Bylo získáno pouze 39,8 mg (21,7 % z teoretického výtěžku) čisté látky a tak byla reakce zopakována stejným způsobem s navážkou o 33 % vyšší (0,63 mmol). Bylo použito 200 mg P, 72,4 mg NHSI, 112 µl WSC, 575,8 µl 10% kyseliny máselné. Separace proběhla stejným způsobem. Výtěžek činil 103 mg (42,2 % z teoretického výtěžku). Produktem byla bezbarvá krystalická látka. 21

3.2.4. N-((2S,3S,4R)-1,3,4-trihydroxyoktadekan-2-yl)acetamid (NP2) Příprava NP2 proběhla stejným způsobem. Bylo použito ekvimolární množství výchozích látek (0,472 mmol). Navážky byly následující: 150 mg P, 54,3 mg NHSI, 84,1 µl WSC, 27 µl kyseliny octové (M r = 60,05; ρ = 1,0491 g.ml -1 ). Separace proběhla stejným způsobem. Jako mobilní fáze byla použita směs chloroform: methanol v poměru 20:1 (v/v). Bylo získáno 81 mg (47,6 % z teoretického výtěžku) bezbarvé krystalické látky. 3.2.5. Charakteristiky získaných fytoceramidů Pro přehlednost jsou relativní molekulová hmotnost, teplota tání, retenčí faktor (Rf) (silikagel, mobilní fáze chloroform: methanol v poměru 10:1 (v/v)) jednotlivých produktů uvedeny níže (tabulka 3.), NMR (tabulka 4.), MS (tabulka 5.), chemické vzorce (obrázek 8.). Mr T t [ C] Rf NP2 359,56 106-109 0,23 NP4 387,62 87-89 0,33 NP6 415,65 90-100 0,36 NP24 668,16 110-116 (113-114) (24) 0,53 tabulka 3. Relativní molekulová hmotnost, teplota tání a retenční faktor syntetizovaných FCER. 22

NP2 NP4 NP6 NP24 1 H NMR (500 MHz, CDCl 3 ) 13 C NMR (126 MHz, CDCl 3 ) 1 H NMR (300 MHz, CDCl 3 ) 13 C NMR (75 MHz, CDCl 3 ) 1 H NMR (300 MHz, CDCl 3 ) 13 C NMR (75 MHz, CDCl 3 ) 1 H NMR (300 MHz, CDCl 3 ) δ 6.41 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 4.17 4.11 (m, 1H), 3.91 (dd, J = 11.5, 2.7 Hz, 1H), 3.73 (dd, J = 11.6, 5.7 Hz, 1H), 3.66 3.60 (m, 1H), 3.58 (dd, J = 6.8, 3.1 Hz, 1H), 2.04 (s, 3H), 1.80 1.56 (m, 2H), 1.53 1.45 (m, 2H), 1.34 1.23 (m, 22H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H) ppm. δ 171.39, 76.74, 72.64, 61.40,53.30, 31.92, 29.69, 29.65, 29.61, 29.59, 29.36, 25.60, 23.25, 22.69, 14.12 ppm. δ 6.52 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 4.18 4.10 (m, 1H), 4.05 3.97 (m, 1H), 3.87 (dd, J = 11.4, 3.0 Hz, 1H), 3.71 (dd, J = 11.3, 5.5 Hz, 1H), 3.65 3.54 (m, 1H), 2.20 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.66 (dt, J = 7.5 Hz, 2H), 1.57 1.42 (m, 2H), 1.36 1.18 (m, 24H), 0.95 (t, J = 7.3 Hz, 3H), 0.87 (t, J = 6.5 Hz, 3H) ppm. δ 174.54, 76.56, 72.92, 61.74, 58.72, 38.72, 33.54, 32.15, 29.94, 29.90, 29.60, 26.02, 24.67, 22.92, 19.35, 14.35, 13.92 ppm. δ 6.55 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 4.18 4.08 (m, 1H), 3.86 (dd, J = 11.6, 3.0 Hz, 1H), 3.70 (dd, J = 11.5, 5.7 Hz, 1H), 3.66 3.50 (m, 5H), 2.22 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.76 1.55 (m, 2H), 1.54 1.40 (m, 2H), 1.39 1.17 (m, 28H), 0.89 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 0,87 (t, J = 6,9 Hz, 3H) ppm. δ 174.38, 76.50, 72.59, 61.56, 56.14, 36.59, 36.29, 35.29, 34.48, 33.34, 31.89, 31.38, 31.33, 29.67, 29.63, 29.34, 26.89, 25.74, 25.37, 24.66, 22.66, 22.46, 22.35, 14.73, 14.10, 13.91 ppm. δ 3.91 3.81 (m, 1H), 3.52 (dd, J = 11.4, 4.7 Hz, 1H), 3.37 3.28 (m, 1H), 3.17 3.08 (m, 2H), 1.98 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.47 1.31 (m, 2H), 1.19 0.91 (m, 64H), 0.65 (t, J = 6.7 Hz, 6H) ppm. tabulka 4. NMR spektra syntetizovaných FCER. 23

NP2 MS (APCI) m/z = 360,9 [M+H + ]; 382,3 [M+Na + ]; 741,6 [2M+Na + ] NP4 MS (APCI) m/z = 388,3 [M+H + ]; 410,3 [M+Na + ]; 797,7 [2M+Na + ] NP6 MS (APCI) m/z = 416,4 [M+H + ]; 438,4 [M+Na + ]; 853,4 [2M+Na + ] NP24 MS (APCI) m/z = 668,7 [M+H + ]; 690,7 [M+Na + ]; 1358,3 [2M+Na + ]; 706 [M+K + ] tabulka 5. MS syntetizovaných FCER. OH NP2 (C 20 H 41 NO 4 ) HO O NH OH OH NP4 (C 22 H 45 NO 4 ) HO O NH OH OH NP6 (C 24 H 49 NO 4 ) HO O NH OH OH NP24 (C 42 H 85 NO 4 ) HO O NH OH obrázek 8. Sumární a strukturní vzorce syntetizovaných FCER. 24

3.3. Permeační pokusy 3.3.1. Příprava modelových membrán Pro přípravu modelových membrán bylo využito dřívějších poznatků (2). Jako báze membrány byl zvolen polykarbonátový filtr (Nuclepore, firma Whatman, Kent, Velká Británie) o velikosti pórů 15 nm. Z něj byly zhotoveny čtverce o velikosti 15 mm*15 mm, které byly odmaštěny v rozpouštědle použitém pro nanášení lipidových vrstev (směs hexan/ethanol 96% v poměru objemů 2:1). Membrána byla upevněna stabilizována proti pohybu mezi 2 destičky (jedna s kruhovým otvorem o průměru 1 cm pro nástřik lipidové směsi) oboustrannou lepicí páskou (nikoliv ale přilepena), aby se s ní dalo manipulovat při další práci. Modelová lipidová směs byla připravena z ekvimolární směsi příslušného CER, CH a kyseliny lignocerové. Byl přidán cholesterol sulfát (z celkové hmotnosti lipidů tvořil 5%). Jednotlivé složky byly naváženy do vialek, rozpuštěny ve směsi chloroform: methanol poměru 2:1 (v/v) a kvantitativně převedeny do jediné vialky. Rozpouštědlo bylo odfoukáno proudem dusíku a jeho zbytky byly odstraněny nad parafínem v hlubokém vakuu na olejové pumpě. Pro přípravu modelových membrán byla lipidová směs naředěna směsí hexan:ethanol 96% (pozn.: přítomnost 96% ethanolu je nezbytná k disoluci cholesterol sulfátu) v poměru 2:1 (v/v) na koncentraci 4,5 mg/ml. Pomocí Linomatu 4 (Camag, Muttenz, Švýcarsko) vybaveného dodatečným navíjením (pohyb po ose y) byly lipidy rovnoměrně naneseny na membránu ve třech vrstvách. Na jednu vrstvu (1 cm 2 ) bylo použito 100 µl (4500 µg/ml) lipidové směsi, na tři vrstvy pak tedy 1350 µg/cm 2 lipidů. Takto předpřipravené membrány byly uloženy do plastových krytů a uchovány v mrazicím boxu. Aby se lipidy uspořádaly do lamel, byly membrány 1 den před permeačními pokusy zahřáty v pícce na 90 C (což je dostatečná teplota aby se chladnutím mohla vytvořit lamelární struktura (25) ). (Kvůli vysoké teplotě tání NP24 byly 3 membrány zahřáty na teplotu 110 C. Takovéto membrány jsou dále označeny jako NP24(110 C).) 20 minut byly ponechány při této teplotě a pak byla pícka vypnuta, aby v ní membrány mohly pomalu zchladnout na laboratorní teplotu (cca 4 h). Poté byly uchovávány v termostatu při 32 C do následujícího dne, kdy proběhly další pokusy. 25

3.3.2. Franzova difuzní cela a permeace Pro hodnocení permeability membrán bylo použito Franzových difuzních cel (obrázek 9.). Permeační plocha činila 0,5 cm 2. Cela o objemu cca 6 ml byla naplněna akceptorovou fází - PBS pufem (10 mmol fosfátový pufr, 137 mmol NaCl a 2,7 mmol KCl, 50 mg/l gentamycinu (protimikrobní přísada), ph 7,4). Objemy jednotlivých cel se lišily, nicméně tyto rozdíly byly zahrnuty do výpočtů. Cely byly vybaveny míchadélkem a temperovány na 32 C. Po vytemperování (1h) byla změřena impedance (viz 3.3.3.), poté byla voda z membrán opatrně odsáta vatovým tampónkem a na povrch nanesen donorový vzorek modelového léčiva (suspenze 5% thephylinu (TH) nebo 2% indomethacinu (IND) v 60% propylenglykolu). Vzorky (300 µl) byly odebírány každé 2 hodiny (celkem 4x, tedy po dobu 8 hodin) a nahrazeny stejný množstvím PBS (zahrnuto do finálních výpočtů). Obrázek 9. Franzova difuzní cela (1. donorový vzorek, 2. modelová membrána, 3. raménko pro odběr vzorků, 4. akceptorová fáze PBS pufr, 5. termostat 32 C, 6. magnetické míchadélko) 26

3.3.3. Měřené veličiny, podmínky HPLC analýzy Nejprve jsme zjišťovali ochotu membrán propouštět ionty pomocí multimetru LCR 4080 (Conrad Electronic, Hirschau, Německo) při paralelním režimu a frekvenci 120Hz. Na membránu jsme dali 0,5 ml PBS a opatrně do ní ponořili jednu elektroda, druhou pak do raménka Franzovy difuzní cely. Po chvíli ustálení jsme odečetli impedanci, která nepřímo ukazuje ochotu propouštět ionty. Druhým ukazatelem propustnosti membrán byl flux modelového léčiva, tedy množství látky, které pronikne plochou membrány za jednotku času. Měřili jsme rostoucí koncentraci modelového léčiva, kterou jsme stanovili pomocí analýzy vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) za použití přístroje Shimadzu Prominence (Shimadzu, Kyoto, Japonsko) s pumpami LC-20AD s odplyňovačem DGU-20A3, s autosamplerem SIL-20A HT, s kolonovým termostatem CTO-20AC, s detektorem SPD-M20A a s komunikačním modulem CBM. Data byla analyzována pomocí softwaru LC solutions 1.22. Separace TH proběhla na reverzní fázi na koloně LiChroCART 250-4 (LiChrospher 100 RP-18, 5 µm; Merck) při 35 C. Jako mobilní fázi jsme použili směs methanol/0,1 M NaH 2 PO 4 4:6 (v/v) při průtoku 1,2 ml/min. Velikost nástřiku činila 10 µl a detekce proběhla při 272 nm. Retenční čas TH byl 2,9 + / - 0,1 min. Separace IND proběhla na reverzní fázi na koloně LiChroCART 250-4 (LiChrospher 100 RP-18, 5 µm; Merck) při 40 C. Jako mobilní fázi jsme použili směs acetonitrilu/vody/kyseliny octové 90:60:5 (v/v/v) při průtoku 1,5 ml/min. Velikost nástřiku činila 20 µl a detekce proběhla při 260 nm. Retenční čas IND byl 3,9 + / - 0,1 min. Obě metody byly již dříve validovány (1). Pro sestavení kalibrační křivky TH a IND jsme použili roztoky donorových vzorků o koncentraci 10; 6; 4; 2; 1; 0,5; 0,1; 0,05 mg/ml. 27

4. VÝSLEDKY 4.1. Vliv délky acylu fytoceramidu na bariérové vlastnosti lipidové směsi Pro každou zkoumanou látku (NP2, NP4, NP6, NP8, NP24) bylo připraveno 6 modelových membrán. Do závěrečných výpočtů byla použita data ze všech NP2, NP4, NP6, jen 4 membrány NP8 a NP24 (vyřazené membrány byly pravděpodobně poškozené (kumulativní množství léčiva bylo o 2 řády vyšší než u ostatních membrán) nebo muselo dojít k chybě (záporný nebo nulový flux)), dále pak 5 membrán NP24 z pozdějšího pokusu (pro zpřesnění výsledků) (viz 4.2.). Data v grafu jsou vyjádřena jako průměrná hodnota + / - standardní chyba průměru (SEM) (obrázek 10). obrázek 10. Propustnost modelových membrán SC pro ionty, kterou nepřímo charakterizuje elektrická impedance (A.) a pro modelová léčiva: TH (B.) a IND (C.). * značí statisticky významný rozdíl oproti kontrole (membrány obsahující NP24). 28

Membrány obsahující NP24 byly statisticky významně méně propustné pro ionty než membrány s obsahem NP2 (cca 4x) i než NP4 (cca 2,7x). Membrány obsahující NP6 měly srovnatelnou impedanci s kontrolními membránami obsahující NP24. Avšak membrány obsahující NP8 byly statisticky významně odolnější (cca 1,7x) než kontrola. Všechny membrány s obsahem zkoušených CER analogů typu NP s kratšími acyly byly propustnější pro TH než NP24. Statistiky významně propustnější než kontrolní membrány s NP24 byly membrány obsahující NP4 (cca 10,5x), NP2 (cca 5,9x), NP6 (cca 5,3x). Membrány s NP8 nevykazovaly statisticky významnou odchylku od kontrolních membrán. Pro druhé modelové léčivo IND měl graf podobný charakter. Membrány s NP4 byly opět nejpropustnější (cca 2,8x než membrány s NP24), následovaly membrány obsahující NP2 a NP6 (obě cca 2,2x propustnější). Membrány obsahující NP8 se opět statisticky významně nelišily od kontroly. 4.2. Vliv polární hlavy cermidu na bariérové vlastnosti lipidové směsi. Byly připraveny 4 modelové membrány pro NS24, DS24 a 14S24. Pro NP24 jich bylo připraveno 8, avšak 3 byly při přípravě zahřáty na 110 C (viz 3.3.1.). Pro zpřesnění byly do výpočtů zahrnuty také data z dřívějších pokusů: 4 membrány s NP24 (z 4.1.), 6 membrán s NS24 (2) a 6 s membrán NDS24 (3). Data v grafu jsou opět vyjádřena jako průměrná hodnota + / - standardní chyba průměru (SEM) (obrázek 11.). V propustnosti pro ionty se odlišovaly (nikoliv ale statisticky významně) pouze membrány obsahující CER analog 14S24, jehož průměrná hodnota impedance byla 11,25 kω.cm 2 (což je například v porovnání s membránami s NP24 19,3x méně). Co se týče propustnosti membrány pro TH, byly membrány s analogem 14S24 statisticky významně propustnější oproti membránám z ostatních CER. Jejich průměrný flux činil cca 1,22 μg.h -1.cm -2, což je cca 4x více než flux membrán ostatních CER. Ve fluxu IND nebyl zaznamenán žádný statisticky významný rozdíl v propustnosti, nicméně membrány obsahující NP24 vykazovaly trend vyšší propustnosti, než membrány ostatních vzorků (včetně NP24(110 C). 29

obrázek 11. Vliv polární hlavy na propustnost modelových membrán SC. Hodnocené veličiny jsou impedance (A.), flux TH (B.) a flux IND (C.) * značí statisticky významný rozdíl oproti membránám ostatních CER. 30

5. DISKUSE 5.1. Syntéza fytoceramidů V této práci byly všechny FCER připraveny N-acylací P příslušnou kyselinou. Jako kondenzační činidlo byl zvolen WSC, jehož případné zbytky lze po ukončení reakce snadno odstranit vytřepáním s vodou. Výtěžnost této acylace byla 11,6-47,5 % (výtěžek 11,9 % u NP24 byl nižší z důvodu neúplného rozdělení sloupcovou chromatografií). Pro CER typu NS byly výtěžky podobné reakce 57-89 % (1). Pravděpodobně by šlo získat vyšší výtěžky i pro CER typu NP. Nejvyšší ztráty mohly vzniknout při vytřepávání (vytváření pěny), sloupcové chromatografii a při přenášení do vialek (při odfoukávání proudem dusíku se na povrchu rozpouštědla tvořila krusta z krystalizujících CER). 5.2. Permeační pokusy Jako modelové léčivo pro permeační pokusy byl původně zvolen pouze TH. Příprava modelových membrán je značně časově náročná a tak jsme se rozhodli vyzkoušet, zda by nešlo získat z každé připravené membrány více informací. Po ukončení permeací s TH byly modelové membrány opatrně opláchnuty od donorového vzorku léčiva a akceptorová fáze byla nahrazena čistým PBS. Druhý den pak byla akceptorová fáze znovu naplněna. Poté proběhl další permeační pokus s IND. Tato metoda byla i později (v dosud nepublikované práci) validována. Nebyly zjištěny žádné zbytky prvního modelového léčiva v druhém permeačním pokusu, byly provedeny permeace i v opačném pořadí (nejprve IND a pak TH) a fluxy jednotlivých látek naměřených první i druhý den odpovídaly. 31

5.3. Délka acylu fytoceramidu Podobně jako u CER typů NS (2) (25) a NDS (3) platí i pro NP, že CER s krátkým acylovým řetězcem nejsou schopny v lipidové směsi vytvořit bariéru srovnatelnou s jejich 24 uhlíkatým analogem. Tyto CER by proto neměly být používány jako modely chování CER a vzhledem k tomu, že krátké analogy NS zvyšují propustnost kožní bariéry (1), jsou tyto látky pravděpodobně nepoužitelné jako náhražky fyziologických CER. Ačkoliv je v lidské SC obsaženo mnoho druhů CER, byl pro tyto pokusy vytvořen model membrán, složených pouze z jednoho CER. Nicméně pokud porovnáme trend propustnosti membrán (25) a zvýšené propustnosti kůže po aplikaci příslušného CER (1), můžeme předpokládat podobnou závislost i pro CER typu NP. Důvodem, proč membrány složené s krátkých CER jsou propustnější, by mohla být neschopnost utvořit patřičnou lamelární strukturu, která je hlavním důvodem nepropustnosti SC (20). Další možností by mohlo být vytváření samostatných fází v SC, které jsou pak snadněji prostupné pro průnik látek. Důvodem tvorby těchto samostatných fází by mohlo být nedostatečné uplatnění hydrofobních interakcí krátkých acylů a neschopnost začlenit se mezi ostatní řetězce (1). Tyto krátké CER by se mohly v SC chovat podobně jako kratší kyseliny (20). Bariérové vlastnosti modelových membrán tvořených NP8 se ukázaly jako blízké NP24. Lidské SC ale tvoří CER o mnohem větší délce C řetězců (10) (6), takže nelze přepokládat zachování této podobnosti. Kromě toho v kůži lidí trpících atopickou dermatitidou byl zjištěn signifikantní zvýšení CER s řetězcem o celkové délce 34C (26). NP8 by tedy spíše mohl mít negativní vliv na propustnost kůže. 5.4. Polární hlava cermidu Ačkoliv odlišnost polární hlavy CER typu NP má zásadní vliv na krystalickou mřížku CER v SC (21), nezjistili jsme signifikantní rozdíly mezi CER podtypu NDS, NS a NP v propustnosti ani pro ionty ani pro 2 modelová léčiva. Tyto výsledky tak nepřímo korelují s dřívějšími poznatky (21) (20). 32

Zajímavým zjištěním je, že membrána obsahující CER analog 14S24 není propustnější i pro IND, když je v porovnání s membránami ostatních CER propustnější pro TH i pro ionty. Je to zřejmě dáno tím, že IND je poměrně velká lipofilní molekula a bude preferovat jiné cesty průchodu lipidovými membránami než molekuly o menší velikosti a lipofilitě, jako je TH (8). Dále by bylo zajímavé zkoumat jak se 14S24 chová v lipidových směsích různých CER a zda tvoří lamelární strukturu. Každopádně 14S24 bude nadále studován. Experimentální zahřátí 3 membrán NP24 na 110 C neodhalilo statisticky významný rozdíl v propustnosti oproti membránám z NP24 zahřátých pouze na 90 C. Ačkoliv membrány z NP24(110 C) vykazovaly trend vyšší odolnosti, tuto skutečnost nemá smysl hodnotit, neboť membrán bylo příliš málo a bylo by třeba provést další experimenty. 6. ZÁVĚR Podařilo se nám najít vhodnou metodu přípravy analogů CER NP s různě dlouhým řetězcem. Tuto metodu lze použít pro přípravu malého množství látek, které jsou potřeba například k přípravě modelových membrán SC. Podařilo se nám prokázat teorii, že CER typu NP s velmi krátkým acylovým řetězcem netvoří v lipidické směsi dostatečnou bariéru podobně jako CER typu NS. Dostatečná délka acylu je tedy důležitou strukturní vlastností, která se podílí na neprostupnosti SC. Zjistili jsme, že přítomnost trans dvojné vazby či hydroxylu v poloze 4 polární hlavy CER nemá na propustnost modelových membrán s obsahem CER NP, NDS a NS zásadní vliv. Permeabilita membrán, které obsahovaly CER analog 14S24, u nějž došlo k výraznější změně ve struktuře polární hlavy, však byla vyšší, než permeabilita membrán s přirozenými CER. Důvod, proč tomu tak je, bude předmětem dalšího výzkumu. 33

7. SEZNAM ZKRATEK 14S24: tetradecylester kyseliny (S)-2-tetrakosanoylamino-3-hydroxypropionové CER: ceramid, ceramidy DCM:dichlormethan DS: dihydrosfingosin FCER: fytoceramid, fytoceramidy FFA: volná mastná kyselina, volné mastné kyseliny H: 6-hydroxysfingosin HPLC: vysokoúčinná kapalinová chromatografie CH: cholesterol IND: indomethacin LPP: fáze s dlouhou periodicitou ("long periodicity phase") MS: hmotnostní spektrometrie NHSI: N-hydroxysukcinimid; Mr = 115,09 NMR: nukleární magnetická rezonance NDS24: N-((2S,3R)-1,3-dihydroxyoktadekan-2-yl)tetrakosanamid NP2: N-((2S,3S,4R)-1,3,4-trihydroxyoktadekan-2-yl)acetamid NP4: N-((2S,3S,4R)-1,3,4-trihydroxyoktadekan-2-yl)butyramid NP6: N-((2S,3S,4R)-1,3,4-trihydroxyoktadekan-2-yl)hexanamid NP8: N-((2S,3S,4R)-1,3,4-trihydroxyoktadekan-2-yl)oktanamid NP24: N-((2S,3S,4R)-1,3,4-trihydroxyoktadekan-2-yl)tetrakosanamid NP24(110 C): modelové membrány obsahující NP24, které byly před pokusy zahřáty na 110 C NS24: N-((2S,3R,E)-1,3-dihydroxyoktadek-4-en-2-yl)tetrakosanamid P: fytosfingosin; M r = 317,51 PBS: fosfátový pufr se solemi (10 mmol fosfátový pufr, 137 mmol NaCl a 2,7 mmol KCl, 50 mg/l gentamycin (protimikrobní přísada), ph 7,4) 34

Rf : retenční faktor S: sfingosin SC: stratum corneum SEM: standardní chyba průměru SPP: fáze s krátkou periodicitou ("short periodicity phase") TH: theofylin THF: tetrahydrofuran TLC: tenkovrstvá chromatografie v/v: objem v objemu WSC: N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylkarbodiimid; M r = 155,2; ρ = 0,877 g.ml -1 35

8. LITERATURA 1. Novotný J., Janůšová B., Novotný M., Hrabálek A., Vávrová K. Shor-chain ceramides decrease skin barrier properties. Skin Pharmacol Physi. 2009, Sv. 22, stránky 22-30. 2. Janůšová B. Vliv derivátů aminokyselin a cermidů na bariérovou funkci kůže. Doktorská disertační práce (Univerzita Karlova v Praze, Faramaceutická fakulta v Hradci Králové). 2012. 3. Jandovská K. Příprava analogů ceramidů a dihydroceramidů a hodnocení jejich vlivu na bariérovou funkci kůže. Diplomová práce (Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové). 2012. 4. Feingold K. R. The role of epidermal lipids in cutaneous permeability. J Lipid Res. 2007, Sv. 48, stránky 2531-2546. 5. Proksch E., Brandner J. M., Jensen J. The skin: an indispensable barrier. Exp Dermatol. 2008, Sv. 17, stránky 1063 1072. 6. van Smeden J., Hoppel L., van der Heijden R., Hankemeier T., Vreeken R. J., Bouwstra J. A. LC/MS analysis of stratum corneum lipids: ceramide profiling and discovery. J Lipid Res. 2011, Sv. 52, stránky 1211-1221. 7. Raith K., Farwanah H., Wartewig S., Neubert R. H. H. Progress in the analysis of stratum corneum ceramides. Eur J Lipid Sci Tech. 2004, Sv. 106, stránky 561-571. 8. Mitragotri S. Modeling skin permeability to hydrophilic and hydrophobic solutes based on four permeation pathways. J Control Release. 2003, Sv. 86, stránky 69-92. 9. Hrabálek A., Doležal P., Šklubalová Z., Farsa O., Krebs A. Akceleranty transdermální penetrace. Chem Listy. 1999, Sv. 93, stránky 107-119. 10. Masukawa Y., Narita H., Shimizu E., Kondo N., Sugai Y., Oba T., Homma R., Ishikawa J., Takagi Y., Kitahara T., Takema Y., Kita K. Characterization of overall ceramide species in human stratum corneum. J Lipid Res. 2008, Sv. 49, stránky 1466-1476. 36

11. Madison K. C. Barrier function of the skin: La Raison d'être of the epidermis. J Invest Dermatol. 203, Sv. 121, stránky 231-241. 12. Bouwstra J. A., Gooris G. S., Dubbelaar F. E. R., Weerheim A. M., IJzerman A. P., Ponec M. Role of ceramide 1 in the molecular organization of the stratum corneum lipids. J Lipid Res. 1998, Sv. 39, stránky 186-196. 13. Wertz P. W. Lipids and barrier function of the skin. Acta Derm-Venereol. 2000, Sv. 208, stránky 7-11. 14. Kessnera D., Brezesinskib G, Funaric S. S., Dobnera B., Neubert R. H. H. Impact of the long chain ω-acylceramides on the stratum corneum lipid nanostructure. Part 1: Thermotropic phase behaviour of CER[EOS] and CER[EOP] studied using X- ray powder diffraction and FT-Raman spectroscopy. Chem Phys Lipids. 2010, Sv. 163, stránky 42-50. 15. de Jager M. W., Gooris G. S., Ponec M., Bouwstra J. A. Lipid mixtures prepared with well-defined synthetic ceramides closely mimic the unique stratum corneum lipid phase behavior. J Lipid Res. 2005, Sv. 46, stránky 2649-2656. 16. Madison K. C., Swartzendruber D. C., Wertz P. W., Downing D. T. Presence of intact intercellular lipid lamellae in the upper layers of the stratum corneum. J Invest Dermatol. 1987, Sv. 88, stránky 714-718. 17. Rawlings A. W. Trends in stratum corneum research and the management of dry skin conditions. Int J Cosmetic Sci. 2003, Sv. 25, stránky 63-95. 18. Bouwstra J. A., Dubbelaar F. E. R, GoorisG. S., Ponec M. The lipid organisation in the skin barrier. Acta Derm-Venereol. 2000, Sv. 208, stránky 23-30. 19. Norlén L. Skin barrier structure, function and formation - learning from cryoelectron microscopy of vitreous, fully hydrated native human epidermis. Int J Cosmetic Sci. 2003, Sv. 25, stránky 209-226. 20. Groen D., Poole D. S., Gooris G. S., Bouwstra J. A. Is an orthorhombic lateral packing and a proper lamellar organization important for the skin barrier function? Biochim Biophys Acta. 2011, Sv. 1808, stránky 1529-1537. 37

21. Rerek M. E., Chen H., Markovic B., van Wyck D., Garidel P., Mendelsohn R., Moore D. J. Phytosphingosine and sphingosine ceramide headgroup hydrogen bonding: structural insights through thermotropic hydrogen/deuterium exchange. J Phys Chem B. 2001, Sv. 105, stránky 9355-9362. 22. Rerek M. E., van Wyck D., Mendelsohn R., Moore D. J. FTIR spectroscopic studies of lipid dynamics in phytosphingosine ceramide models of the stratum corneum lipid matrix. Chem Phys Lipids. 2005, Sv. 134, stránky 51-58. 23. Vávrová K., Zbytovská J., Palát K., Holas T., Klimentová J., Hrabálek A., Doležal P. Ceramide analogue 14S24 ((S)-2-tetracosanoylamino-3-hydroxypropionic acid tetradecyl ester) is efective in skin barrier repair in vitro. Eur J Pharm Sci. 2004, 21, stránky 581-587. 24. Koike K., Nakahara Y., Ogawa T. Total synthesis of (2S,3S,4R)-N-tetracosanoyl- 2-amino-1,3,4-octadekantriol, a ceramide part of wheat flour glycosyl ceramides. Agric Biol Chem. 1990, Sv. 54, stránky 663-667. 25. Školová B., Janůšová B., Zbytovská J., Gooris G. S., Bouwstra J. A., Slepička P., Berka P., Roh J., Maixner J., Palát K., Hrabálek A., Vávrová K. Ceramides in the skin barrier: length matters. v recenzním řízení. 26. Janssens M., van Smeden J., Gooris G. S., Bras W., Portale G., Caspers P. J., Vreeken R. J., Hankemeier T., Kezic S., Wolterbeek R., Lavrijsen A. P., Bouwstra J. A. Increase in short-chain ceramides correlates with an altered lipid organization and decreased barrier function in atopic eczema patients. J Lipid Res. 2012, Sv. 53, stránky 2755-2766. 38