Interleukin 6 and its usage in Diagnostics of Neonatal Bacterial Infection ANEŽKA DĚDKOVÁ Alergologická ambulance dětského oddělení NsP Nový Jičín SOUHRN Úspěšnost terapie novorozenecké infekce závisí na včasnosti diagnostiky, proto jsou nutné citlivé a specifické laboratorní znaky zachycující již fázi nastupující infekce. Tato práce se zaměřila na monitorování hladiny IL-6, který v zánětlivé kaskádě nastupuje ještě před zvýšením CRP. Do souboru bylo zařazeno celkem 102 novorozenců, z toho 79 dětí tvořilo skupinu dětí s rizikem neonatální infekce, 23 fyziologických novorozenců vytvořilo kontrolní soubor. Všem dětem se odebírala krev po porodu a v intervalech za 6, 12, 24 hodin. Ze vzorků se stanovovaly hladiny IL-6, CRP, KO+diff, IgM. Získaná data byla statisticky zpracována. Práce potvrdila senzitivitu IL-6 i jeho včasnou dynamiku korelující následně s výškou CRP u dětí s neonatální infekcí. Klíčová slova: novorozenecká infekce, diagnostické ukazatele, interleukin 6 SUMMARY The success of neonatal infection therapy depends on timing of diagnostics, therefore the sensitive and specific laboratory markers are necessary for recording of phase of appearing infection.this work is concentrated on monitory of IL-6 level, that one starts in inflammatory cascade still before CRP elevation. There were totally 102 newborn babies ordered into the file, 79 children created the group with risk of neonatal infection and 23 physiological babies created the control set.the blood was taking away after the childbirth immediatelly and in 6, 12 and 24 hours intervals. The levels of IL-6, CRP, KO (blood count)+diff, IgM were determined from the samples. The obtained datas were processed statistically. The study confirmed the sensitivity of IL-6 and its timely dynamics corellating subsequently with the CRP height by the children with neonatal infection. Key words: neonatal infection, diagnostic marker, interleukin 6
Úvod Novorozenecká infekce představuje hlavní příčinu morbidity a mortality novorozenců. Výsledky a prognóza záleží na včasnosti a efektivitě antibiotické léčby, diagnóza a léčba však může být zpožděna, neboť v časných stadiích nemoci chybí typické klinické známky. Klinický obraz novorozenecké infekce je totiž velmi nespecifický. U časné formy do 48 hodin je to např. porucha sání, dýchání, hypotermie, šedavý kolorit kůže, zhoršená perfúze kapilární návrat nad 2 sekundy, ikterus, změny srdeční frekvence, poruchy termoregulace, neklid či apatie. Až pozdní forma infekce se projevuje orgánovým postižením, jako je např. meningitida, pneumonie, osteomyelitida, pyelonephritida apod. Zachycení infekce až v tomto stadiu však velmi snižuje procento úspěšnosti terapie, proto jsou nutné citlivé a specifické indikátory schopné detekovat již nastupující infekci. Senzitivita a specificita běžně používaných laboratorních znaků infekce tj. CRP, počet leukocytů, poměr nezralých forem a všech neutrofilních granulocytů (immature to total neutrophil ratio, I/T) není vždy dostatečná. Prediktivní hodnota CRP se zvyšuje s časem a je nejlepší mezi 24 48 hodinami poté, co vzniklo podezření na infekci, proto se CRP zdá být méně užitečný jako diagnostický test časných fází neonatální infekce. V posledních letech se hledání nových diagnostických metod časné novorozenecké infekce obrátilo k cytokinům, protože se předpokládalo, že jejich vzestup v odpovědi na infekci může předcházet vzestupu CRP. Jedním z těchto diskutovaných znaků infekce je také interleukin 6 (IL-6), významný mediátor zánětlivé odpovědi. Interleukin 6 je pleiotropní cytokin zapojený v mnoha dějích imunitního systému. Je syntetizován monocyty, endotelovými buňkami, fibroblasty,t lymfocyty, polymorfonukleáry při odpovědi na zánětlivé stimuly a doprovází produkci TNF a IL-1. IL-6 působí jako signál při aktivaci T lymfocytů, indukuje sekreci protilátek B lymfocyty, indukuje diferenciaci cytotoxických T lymfocytů, podílí se na stimulaci pluripotentní buňky. Při experimentálním intravenózním podání lipopolysacharidu pro navození modelové sepse je LPS transportován plazmatickým nosičem LBP, tento komplex se váže na receptor CD 14 cirkulujících i tkáňových makrofágů a působí stimulaci produkce cytokinů. Jako intracelulární signál pro transkripci cytokinů se uplatňuje nukleární faktor kappa B (NFkB), který je pravděpodobně aktivován mimo jiné kyslíkovými radikály. Posloupnost je následující: endotoxin-kyslíkové radikály-kinázy-aktivace NFkB-transkripce m-rna-proteosyntéza cytokinů. V prvním sledu se produkují TNF alfa, TNF beta, IL-1 alfa i beta. Tyto prozánětlivé cytokiny ovlivňují prakticky všechny orgány a in vitro indukují přímo nebo nepřímo genovou expresi dalších cytokinů, zvyšují produkci eikosanoidů, PAF a expresi adhezivních molekul na endotelu. Ve svých účincích se vzájemně potencují a jsou extrémně biologicky účinné již v pikomolárních koncentracích. Jako jiné cytokiny mají schopnost autoindukce a jejich syntéza je zesilována IFN gama, imunokomplexy a následně se tvořícími mediátory zánětu. S několikahodinovým zpožděním se indukuje syntéza cytokinů druhého sledu, které mají také delší biologický poločas. Jde o IL-2, který indukuje produkci dalších specializovaných imunoaktivačních cytokinů, dále multifunkční a do značné míry o dalším průběhu rozhodující IL-6, aktivátor polymorfonukleárů IL-8 a další chemokiny. IL-6 je také hlavní induktor syntézy hepatálních proteinů, tj. ceruloplazminu, fibrinogenu, CRP, sérového amyloidu. V rámci zánětlivé kaskády dochází tedy nejdříve ke zvýšení IL-6 a až po 24 hodinách začíná reagovat i CRP. Tato rozdílná dynamika koncentrace IL-6 a CRP v rámci reakce na bakteriální agens je zachycena na grafu 1.
Poločas IL-6 v krvi je krátký 4 12 hodin, což může způsobit falešně negativní výsledek, je-li odběr již v době, kdy IL-6 klesl na normální hodnoty. Krátký biologický poločas IL-6 může být způsoben jeho vazbou na plazmatické bílkoviny, např. alfa 2-makroglobulin, rychlou akumulací v játrech nebo inhibicí jinými cytokiny. Vzhledem ke krátkému poločasu IL-6 jsou vhodné opakované odběry ke sledování dynamiky a k správné interpretaci výsledku. Dosavadní práce zabývající se studiem IL-6 u novorozenců udávají, že hladina IL-6 v pupečníkové krvi ani v krvi novorozence není ovlivněna koncentrací v krvi matky, i když podnět ke zvýšení může být shodný. IL-6 detekovatelný u dětí je tedy výsledkem vlastní tvorby a nikoliv odrazem mateřské. Většina studií uvádí fakt, že IL-6 neprochází placentární bariérou, ale závěr studie Claudia Chiesy z roku 2001 není tak jednoznačný. Tato studie se také zabývala dynamikou IL-6 u fyziologických a nedonošených dětí, zkoumala vliv skóre Apgarové (AS), gestačního věku a jiných faktorů. Došla k závěru, že vyšší hodnoty IL-6 u nedonošených dětí ve srovnání s donošenými dokazují, že gestační věk má vliv na hodnotu IL-6, což může být způsobeno inaparentní perinatální infekcí, která je častá u předtermínových porodů, ačkoliv žádné z těchto dětí nevyžadovalo ATB léčbu. Dalším důvodem zvýšení IL-6 může být i to, že předtermínový porod znamená větší stres pro nepřipravený plod a tento stres pak může indukovat vyšší tvorbu IL-6 adrenálními buňkami. Stejný důvod zřejmě vysvětluje korelaci mezi AS a koncentrací IL-6 v pupečníkové krvi. Vlastní práce Cílem této práce bylo určit vliv časné novorozenecké infekce na hladinu IL-6, CRP, IgM a KO+differenciál v pupečníkové krvi a v krvi novorozence odebrané v intervalech za 6, 12 a 24 hodin. Práce se zaměřila na posouzení přínosu stanovení IL- 6 v kombinaci s ostatními parametry pro diagnostiku časné bakteriální infekce u rizikových novorozenců. K porovnání byl vytvořen soubor tzv. fyziologických novorozenců s minimálním rizikem novorozenecké infekce. Soubor a metodika Do souboru bylo zařazeno celkem 102 novorozenců přijatých na novorozenecký úsek dětského oddělení NsP Nový Jičín v období od prosince 2001 do května 2002. 79 dětí jsme zařadili do souboru tzv. rizikových dětí, kde rizikem byla neodebraná nebo pozitivní
kultivace výtěru z pochvy matky nejčastěji s nálezem Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus, dále přítomnost silně zkalené plodové vody, předčasný odtok plodové vody, infekt matky, předtermínový porod. U většiny matek s nosičstvím Streptokoka B byla provedena ATB prepartální profylaxe. 23 novorozenců vytvořilo kontrolní soubor, tito novorozenci neměli žádná rizika hrozící neonatální infekce. Jednalo se o děti normotrofické, nekříšené, narozené v termínu matkám s negativní kultivací z pochvy a bez známek infekce matky. Také poporodní adaptace probíhala bez komplikací, výtěr z ucha dítěte byl s nálezem běžné flóry. U novorozenců obou skupin byly stanovovány koncentrace IL-6, CRP, IgM, KO+differenciál z pupečníkové krve a z dalších odběrů v intervalech za 6, 12, 24 hodin. Výtěr z ucha se prováděl u všech sledovaných novorozenců, výtěry z krku, nosu a hemokultura se pak odebíraly při elevaci zánětlivých markerů před nasazením ATB terapie. Dále se sledovala a zaznamenávala tato data: gestační věk, skóre Apgarové, porodní hmotnost, způsob porodu. Odběry vzorků probíhaly jen se souhlasem matky. Odběr vzorků a zpracování Přímo na porodním sále bezprostředně po porodu se z pupečníkové krve odebíral první vzorek, další vzorky se odebíraly ze žilní krve v intervalu za 6, 12 a 24 hodin po porodu, všechny vzorky se vyšetřovaly ihned po odběru. Stanovení interleukinu 6 IL-6 se vyšetřoval ze žilní krve, ze které se po odstředění oddělilo sérum, stanovení probíhalo na analyzátoru DPC Immulite. Stanovení je založeno na reakci jednoho epitopu IL-6 s monoklonální protilátkou konjugovanou s alkalickou fosfatázou a druhého epitopu IL-6 s protilátkou proti IL-6 konjugovanou s biotinem v reagenčním pufrovaném roztoku. Takto vzniklý komplex se váže na avidin imobilizovaný na polystyrenové kuličce. Reakce probíhá 60 minut při 37 C. Nenavázaný materiál se odstraní odtředivým promýváním. Přidá se substrát fosforečný ester adamantyl dioxetanu, který hydrolyzuje stykem s alkalickou fosfatázou za vzniku nestabilního meziproduktu. Ten se ihned rozpadá za produkce záření, které se detekuje luminometrem. Intenzita vzniklého záření je přímo úměrná koncentraci interleukinu IL-6 ve vyšetřovaném vzorku. Ke stanovení je potřeba 0,100 ml vzorku a dalších 0,100 ml jako mrtvý objem mikrozkumavky. Mez stanovitelnosti 2000 pg/ml, mez detekce 2 pg/ml. Stanovení CRP a stanovení IgM CRP i IgM bylo vyšetřováno ze srážlivé krve turbidimetricky na biochemickém analyzátoru Hitachi 717. Krevní vyšetření Krevní obraz byl měřen za použití analyzátoru Colter-Max M, diferenciální rozpočty byly hodnoceny mikroskopicky. Výsledky statistická analýza Získané hodnoty jsme podrobili statistické analýze s následujícími výsledky. Nejdříve bylo provedeno porovnání souboru s rizikem infekce a bez rizika infekce. Skóre Apgarové v jednotlivých minutách, pohlaví, porodní hmotnost ani gestační věk se v porovnávaných souborech nelišily. Byl použit T-test s korekcí na nestejné rozptyly, test Mann-Whitney U-test, c2 test. Největší diference mezi dětmi s infekcí a kontrolami je v čase 6 hod., což odpovídá času nejvyšší střední hodnoty IL-6 v souboru s infekcí (graf 2).
Druhé hodnocení: rozdělení dětí podle CRP Děti s CRP 10 a vyšší byly zařazeny do skupiny infekce, ostatní kontroly (bez infekce). Pohlaví se v obou skupinách liší, ve skupině bez infekce je signifikantně více dívek (41/24, 15/22, p=0,046). Použit c2 test. Porodní hmotnost, Apgar score ani gestační věk se mezi skupinami neliší. Použit byl t-test. Diskuse Analýza získaných hodnot v souboru tzv. fyziologických novorozenců vykazovala signifikantně nižší hodnoty než v souboru rizikových dětí. V souboru rizikových dětí se většina získaných hodnot zánětlivých parametrů také pohybovala v rozmezí nižších hodnot, protože větší část dětí infekci vůbec neměla. Kritériem zařazení do tohoto souboru bylo jen riziko možné infekce, které se většinou nepotvrdilo. Všechny děti s nízkým IL-6 i CRP zůstaly i přes rizikové faktory bez léčby ATB a neměly žádný výskyt infekčních komplikací, takže síto odběrů zánětlivých markerů bylo poměrně přesné. Díky tomu došlo i k významné redukci podávaných antibiotik, která se nasazovala jen v laboratorně indikovaných případech. V důsledku časného nasazení antibiotik také nedošlo k rozvoji typických klinických příznaků infekce. Ve skupině fyziologických novorozenců jsme zachytili 1 novorozence s elevací zánětlivých parametrů IL-6 288 pg/ml a CRP 28,2 mg/ml, z výtěru ucha kultivační nález viridujících streptokoků, pacient přeléčen antibiotiky per os. Ve skupině rizikových dětí to byly 3 děti s významnou elevací IL-6 a CRP, byly řádně přeléčeny antibiotiky Augmentinem iv., další poporodní adaptace probíhala v normě. Každá elevace IL-6 byla doprovázena i následným zvýšením CRP, nikdy se nejednalo o ojedinělé falešné zvýšení jen IL-6. Se zvýšením zánětlivých faktorů korelovaly často i pozitivní kultivace výtěru z ucha s nejčastějším nálezem Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecalis, Klebsiella pneumoniae. Hemokultury byly u všech indikovaných dětí negativní. Také předchozí studie popisovaly, že i u klinicky nemocných dětí se zvýšenými parametry bakteriálního zánětu, kde po nasazení ATB docházelo ke klinickému zlepšení, byly hemokultury negativní. Vyšetření IgM se ukázalo zcela bez přínosu k včasné diagnostice novorozenecké infekce, hodnoty se pohybovaly v rozmezí 0,02 0,62 g/l bez signifikantního rozdílu v obou skupinách vyšetřovaných dětí. Při vyšetření KO+diff byla nápadná leukocytóza v obou souborech v druhém odběru za 6 hodin po porodu. Počet tyčí lépe koreloval s ostatními laboratorními známkami infekce,v souboru fyziologických novorozenců se pohyboval v rozmezí 0,02 0,11. U dětí s elevací IL-6 a CRP dosahoval počet tyčí výrazně vyšších hodnot 0,16 až 0,32.
Na základě dosavadních zkušeností s interpretací získaných hodnot IL-6 u novorozenců jsme sestavili následující tabulku (tab. 1). Pro praktické využití je velmi významné široké rozpětí krajních hodnot, kdy hodnota IL-6 menší než 5 infekci prakticky vylučuje a hodnota nad 1000 téměř potvrzuje. Závěr Práce potvrdila včasnost tvorby a dynamiky IL-6 předcházející tvorbu a dynamiku CRP. Opakovaná vyšetření IL-6 a CRP ve skupině rizikových novorozenců umožní zachytit stadium počínající infekce ještě před klinickou manifestací a urychlí nasazení antibiotik. Pro zjištění časné diagnózy novorozenecké bakteriální infekce se v klinické praxi jeví ideální kombinace vyšetřování IL-6 a CRP. Za statistické zpracování děkuji Ing. Jaroslavovi Chládkovi, LF UK Hradec Králové, za pomoc kolektivu sester novorozeneckého úseku dětského odd. NsP Nový Jičín a kolegyni MUDr. Zuzaně Tomášové. MUDr. Anežka Dědková Alergologická ambulance dětského oddělení NsP 741 01 Nový Jičín LITERATURA 1. Buck Ch, Bundschu J, Gallati H, Bartmann P, Pohlandt F. Interleukin-6: A sensitive parameter for diagnosis of neonatal bacterial infection. Pediatrics 1994; 1: 54-56. 2. Doellner H, Arntzen KJ, Haereid PE, Aag S, Austgulen R. Interleukin-6 concentrations in neonates evaluated for sepsis. Journal of Pediatrics 1998; 1, 295-299. 3. Franz AR, Steinbach G, Kron M, Pohlandt F. Reduction of unnecessary antibiotic therapy in newborn infants using interleukin-8 and C-reactive protein as markers of bacterial infections. Pediatrics 1999; 3: 447-452. 4. Chiesa C, Signore F, Assuma M, Buffone E, Tramontozzi P, Osborn JF, Pacifico L. Serial measurements of C-reactive protein and interleukin-6 in the immediate postnatal period: reference
intervals and analysis of maternal and perinatal confounders. Clinical Chemistry 2001; 47:6: 1016-1022. 5. Janota J, Straňák Z, Bělohlávková S. Interleukin-6, prokalcitonin, C-reaktivní protein a poměr I/T v diagnostice časné sepse u novorozenců nízké porodní hmotnosti. Čes. Gynek. 2000; 65 (Suppl 1): 29-33. 6. Klener P. Cytokiny ve vnitřním lékařství. 1.vydání. Praha: Grada Publishing, spol. s r.o.; 1997; 264. 7. Küster H, Weiss M, Willeitner AE, Detlefsen S, Jeremias I, Zbojan J, Geiger R, Lipowsky G, Simbruner G. Interleukin-1 receptor antagonist and interleukin-6 for early diagnosis of neonatal sepsis 2 days before clinical manifestation. Lancet 1998; 352: 1271-1277. 8. Mihál V. Význam proteinů akutní fáze a neutrofilních granulocytů při diagnostice bakteriálního zánětu. Pediatrie pro praxi 2001; 5: 213-216. 9. Pisarčíková M, Filka J, Uher M, Kurák M, Barlová E, Kovářová M, Molokáčová M, Šašinka M. Význam stanovenia koncentrácií cytokínov a prism skóre u detí so sepsou. Čes.-slov. Pediat. 2001; 9: 510-515. 10. Závada J. Syndrom multiorgánové dysfunkce. 1. Vydání. Praha: Grada Publishing, spol. s.r.o.; 2001; 256.