Možná uplatnění proteomiky směrem do klinické praxe
Formy uplatnění proteomiky do klinické praxe Přímé uplatnění proteomických technologií Metody pro studium proteinů tu byly dřív něž proteomika jako obor Uplatnění poznatků získaných proteomickými analýzami Aplikace proteomiky do výzkumu klinicky závažných oblastí Identifikace klinických markerů Pro diagnostiku Pro prognózu Pro sledování účinnosti farmakoterapie Identifikace nových cílů pro farmakoterapii Studium mechanismu účinků léčiv, toxicity léčiv a jiných látek
1) Proteomika založená na gelových metodách Testy založené na různých typech elektroforetické separace proteinů se v diagnostických laboratořích využívají rutinně Izoelektrická fokusace Vyšetření fenotypu alfa-1-antitrypsinu Vyšetření proteinů mozkomíšního moku
1) Proteomika založená na gelových metodách Testy založené na různých typech elektroforetické separace proteinů se v diagnostických laboratořích využívají rutinně 1D elektroforéza Vyšetření základních proteinů séra pro detekci monoklonálních gamapatií
1) Proteomika založená na gelových metodách Testy založené na různých typech elektroforetické separace proteinů se v diagnostických laboratořích využívají rutinně 2D elektroforéza Širšímu využití v klinice brání manuální náročnost a obtížná automatizace Lze využít u velmi specifických onemocnění, Jednoznačná identifikace a charakterizace abnormálních proteinů produkovaných u hemato-onkologických onemocnění
2) Proteomika založená na protilátkách Protilátky využívá naprostá většina rutinně používaných diagnostických souprav, především ELISA testů
2) Proteomika založená na protilátkách High-throughput proteomický přístup využívající protilátky se rozvíjel až s dostupností multiplexových technologií Např. Luminex
2) Proteomika založená na protilátkách Nedostatkem může být nedostupnost kvalitních a ověřených protilátek proti některým proteinům Na přípravě a důkladném ověření specifických protilátek je postaven projekt pro charakterizaci lidského proteomu Human Protein Atlas www.proteinatlas.org V současné době pokryto přes 12 238 lidských genů!
3) Proteomika založená na měření MS profilů Přímá analýza vzorku na MALDI-TOF může velmi rychle poskytnout náhled na jeho složení Možnosti frakcionace - různé chromatografické povrchy SELDI-TOF (Surface-Enhanced Laser Desorption/Ionization) Využívána k vyhledávání diagnostických molekul v tělních tekutinách 5909 5909 8138
3) Proteomika založená na měření MS profilů Přímá analýza vzorku na MALDI-TOF může velmi rychle poskytnout náhled na jeho složení Nevýhody: Rozporuplné, obtížně reprodukovatelné výsledky Opakovaně nalézané vysoce zastoupené fragmenty sérových proteinů OVA1 test První test postavený na poznatcích moderní proteomiky schválený FDA Sleduje hladiny: CA 125, transthyretinu, apolipoproteinu A1, β 2 mikroglobulinu a transferinu
3) Proteomika založená na měření MS profilů Přímá analýza vzorku na MALDI-TOF může velmi rychle poskytnout náhled na jeho složení MS profilování představuje vůbec první proteomickou technologii, která našla uplatnění v klinickém prostředí
3) Proteomika založená na měření MS profilů Přímá analýza vzorku na MALDI-TOF může velmi rychle poskytnout náhled na jeho složení MS profilování představuje vůbec první proteomickou technologii, která našla uplatnění v klinickém prostředí
4) Shotgun proteomika Nejnovější instrumentace schopna identifikovat přes 2 500 proteinů eukaryotních buněk během jedné LC-MS/MS analýzy A) Explorativní shotgun proteomické analýzy Poskytnou globální pohled na proteom jak kvalita, tak kvantita Zatím výlučně na experimentálních pracovištích Ale existuje požadavek kliniků na vývoj proteomické technologie, která by umožnila do hloubky charakterizovat proteom nádorové tkáně Fertichip bude asi prvním klinickým testem postaveným na shotgun proteomických datech
4) Shotgun proteomika Nejnovější instrumentace schopna identifikovat přes 2 500 proteinů eukaryotních buněk během jedné LC-MS/MS analýzy B) Cílené shotgun proteomické analýzy MRM multiple reaction monitoring Poskytnou cílený pohled na proteom jak kvalita, tak kvantita Velice reálné uplatnění v klinických laboratořích Především analýza nativních peptidů tělních tekutin
Aplikace proteomiky do výzkumu klinicky závažných oblastí Identifikace klinických markerů Co je marker? Objektivně měřitelný a hodnotitelný proteinový indikátor Pro diagnostiku Pro prognózu Pro sledování účinnosti farmakoterapie nebo jiné intervence
Aplikace proteomiky do výzkumu klinicky závažných oblastí Identifikace klinických markerů Požadavky na ideální klinické biomarkery citlivost - časná detekce před klinickými příznaky Časná diagnóza časná terapie efektivita specifita - schopný rozlišit podobné nemoci Určení diagnózy, prognózy Dostupnost invazivita odběru: krev vs biopsie snadné zpracování vzorků a stanovení biomarkeru celkové finanční náklady Validovaný a verifikovaný
Aplikace proteomiky do výzkumu klinicky závažných oblastí Identifikace klinických markerů Vývoj biomarkerů Oddělené fáze vývoje Zřetelně oddělena fáze identifikace kandidátního proteinu od jeho důkladného testování 5 fází dle Early Detection Research Network Fáze 1 Fáze 2 Fáze výzkumná identifikace kandidátního proteinu/ů Ověření schopnosti kandidátů rozlišit mezi zdravým jedincem a postiženým jedincem Fáze 3 Ověření schopnosti detekce onemocnění bez jiných klinických příznaků vzorky dlouhodobě odebírané u kohorty jedinců Fáze 4 Fáze 5 Mapovací studie Definitivní plošná populační studie ověření významu mapování na morbiditu a mortalitu cílové populace
Aplikace proteomiky do výzkumu klinicky závažných oblastí Identifikace klinických markerů Úloha proteomiky spočívá především v identifikaci kandidátního proteinu (fáze 1) Úlohou je: z proteinů tkáně/tělní tekutiny nalézt marker Jeden protein Panel proteinů citlivost, specifita Částečně i fáze 2 Další fáze (charakterizace a testování) Jiné metody a technologie (v budoucnu možní i MRM) validované a verifikované metody/postupy stupeň automatizace kapacita vzorků
Aplikace proteomiky do výzkumu klinicky závažných oblastí Identifikace klinických markerů Zdroje markerů: Tělní tekutiny Krev plasma/sérum Mozkomíšní mok Sinoviální tekutina Aspirát z prsu Plodová voda Sliny Slzy Moč Tkáně - biopsie
Aplikace proteomiky do výzkumu klinicky závažných oblastí Identifikace klinických markerů Zdroje markerů: Krev plasma/sérum Výhody: Jednoduchý, neinvazivní a levný odběr a zpracování plasma antikoagulancia + odstranění krevních elementů sérum koagulace + odstranění krevních elementů Rozdíly proteinového složení Odráží děje probíhající v těle Proteiny obsažené v krvi: Normálně v krvi přítomné funkce krve Omývání tkání proteiny z poškozených buněk aktivní sekrece transformovanými buňkami
Aplikace proteomiky do výzkumu klinicky závažných oblastí Identifikace klinických markerů Krev Zdroje markerů: Nevýhody: plasma/sérum komplexita proteinového složení (rozdíly 9-10 řádů v koncentracích proteinů) nespecifická vazba na jiné proteiny Řešení afinitní deplece izolace subproteomů prefrakcionace a multidimenzionální separace Modely plasmy
Aplikace proteomiky do výzkumu klinicky závažných oblastí Identifikace klinických markerů Zdroje markerů: Krev plasma/sérum
Aplikace proteomiky do výzkumu klinicky závažných oblastí Afinitní deplece Afinitní HPLC
Aplikace proteomiky do výzkumu klinicky závažných oblastí 2) Identifikace nových cílů pro farmakoterapii Nutné pochopit molekulární patogenezi choroby Znalost patogeneze = nutný předpoklad úspěšné léčby Úspěch analýzy proteinů v této oblasti Příklad: chronická myoloidní leukémie 1960: u 90 % jedinců detekován abnormální chromozom 22 1973: chromozom 22 vznikl translokaci t(9;22) 1982: v translokaci nalezen proto-onkogen abl 1987: fúzní gen bcr-abl neregulovatelný BCR-ABL protein
Aplikace proteomiky do výzkumu klinicky závažných oblastí 2) Identifikace nových cílů pro farmakoterapii Nové farmakoterapeutické cíle Gleevec chronická myeloidní leukémie Tarceva nemalobuněčný karcinom plic Iressa karcinom prsu Herceptin - karcinom prsu
Aplikace proteomiky do výzkumu klinicky závažných oblastí 3) Studium mechanismu účinků léčiv, toxicity léčiv a apod. Xenobiotikum vliv na genovou expresi Proteomika sledování změn na úrovni proteinů Změny v proteomu vypovídají o účincích xenobiotika Chain B, Transition State Analog Complex Of Muscle Creatine Kinase 4.0 3.0 Beta tropomyosin 3.0 Beta cardiac myosin heavy chain 3.5 2.5 2.5 3.0 2.0 2.0 2.5 2.0 1.5 1.5 1.5 Ratio to IS 1.0 0.5 0.0 Control Daunorubicin 1.0 Ratio to IS 0.5 0.0 Control Daunorubicin 1.0 Ratio to IS 0.5 0.0 Control Daunorubicin
HUPO Human proteome organisation Mapování proteomu člověka Proteom jednotlivých tkání a buněčných populací Tvorba ProteinATLASU Atlas proteinů nacházejících se v lidském organismu www.proteinatlas.org Proteom biologickcýh tekutin Standardizace postupů, školení apod. HUPO iniciativy: Human Liver Proteome Project (HLPP) Human Brain Proteome Project (HBPP) Proteomic Standards Initiative (PSI) Human Antibody Initiative (HAI) Plasma Proteome Project (PPP) Mouse Models of Human Disease (MMHD) Human Disease Glycomics/Proteome Initiative (HGPI)