AMH preanalytické podmínky Testování stability podle ISBER protokolu R. Kučera, O. Topolčan, M. Karlíková Oddělení imunochemické diagnostiky, Fakultní nemocnice Plzeň
O čem to dnes bude? AMH základní informace Stabilita AMH co je známo ISBER protokol Naše výsledky Závěry 2
Úvod Trocha statistiky na úvod nikdy neškodí 3
ZDROJ: Český statistický úřad Vývoj míry plodnosti podle věku, srovnání rok 1990 a 2003
Průměrný věk matky při porodu v ČR 2001-2015 30,5 Průměrný věk matky při porodu v ČR 30,0 29,5 29,0 28,5 28,0 27,5 27,0 26,5 26,0 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 ZDROJ: Český statistický úřad
průměrné koncentrace AMH (ng/ml) AMH ve fertilním věku u žen 6 5 4 3 2 1 0 20-23 24-27 28-31 32-35 36-40 41-45 >45 Věk (roky)
AMH základní charakteristika AMH patří do skupiny růstových faktorů TGF-β. Název Řetězec Poločas (h) AA Molek. hmotnost (kda) Fyziologická funkce prenatální Fyziologická funkce postnatální AMH AMH-N AMH-C 48 560 72 Diferenciace pohlaví plodu Muži: pohlavní zrání Ženy: zrání folikulocytů AMH glykoproteinový dimer AMH-N AMH-C I I I AMH prostorová struktura
AMH Fyziologická funkce - prenatálně Sexuální diferenciace lidského plodu Caspar F. Wolff (1733 1794) německý anatom Johannes Müller (1801 1858) německý anatom AMH ne AMH ano AMH izoloval Alfred Jost (1947) U vyvíjejícího se embrya jsou přítomny bipotenciální žlázy a oba typy vývodů: Müllerův ženský typ, Wolfův mužský typ
AMH Fyziologická funkce - prenatálně Sexuální diferenciace lidského plodu AMH ne AMH ano Chromozom Y Gen SRY nacházející se na chromozomu Y spouští produkci proteinu testicular determination factor (TDF) - transkripční faktor. Váže se do specifických oblastí DNA a pomáhá kontrolovat aktivitu jednotlivých genů spouští kaskádu dějů vývoj plodu mužského pohlaví.
Prenatální funkce AMH diferenciace pohlaví plodu Exprese receptorů pro AMH při regresi Müllerova duktu AMH způsobuje vývoj plodu mužského pohlaví 6. 8. gestační týden - exprese receptoru MIS1 a MIS2, po navázání AMH regrese Můllerova vývodu díky indukci apoptózy dále se vyvíjí Wolfův duktus a plod mužského pohlaví Teixeira J et al. Endocrine Reviews 2001;22:657-674
AMH produkce v dospělosti Řez varletem Řez ovariálním folikulem Produkce AMH probíhá v Sertoliho buňkách varlat v prenatálním i postnatálním období u mužů, a v granulózových buňkách vaječníků v postnatálním období u žen.
AMH - klinické využití Diagnostika a sledování PCOS Sledování léčby nádorů granulózových buněk vaječníků Sledování změn ovariální rezervy po užívání cytostatik a po radioterapii Diagnostika a diferenciální diagnostika předčasné a opožděné puberty u chlapců Diagnostika kryptorchizmu a anorchie u chlapců Diferenciální diagnostika narušeného pohlavního vývoje u dětí 12
Cíl Zjistit optimální preanalytické podmínky a krátkodobou stabilitu AMH 13
2 otázky 1) Za jak dlouhou dobu po odběru je potřeba krev stočit a separovat sérum (plazmu)? 2) Co je možné provádět se separovaným materiálem po odběru včetně krátkodobého skladování do zpracování? 14
Stáčení plné krve Důležité je včasné oddělení červené krevní složky Stočení krve do 3h po náběru (některé zdroje 8h)
AMH Gen II den 2 Vliv stání plné krve 24h při RT na hodnotu AMH AMH Gen II ELISA 24h plná krev RT 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 AMH Gen II den 1 Rozdíl AMH Gen II: den 1 vs den 2 Průměr + 11%
Metodika 5 dobrovolníků AMH mezi 3,92-6,39 ng/ml protokol ISBER po vystavení vzorků různě nadefinované zátěži byly vzorky umístěny do -80 C až do závěrečné analýzy 18
Metodika
Opakované rozmrazování
Různé skladovací teploty
Metodika skupiny vzorků: sérum sérum separované po přemražení plné krve v gelových náběrových zkumavkách sérum oddělené po centrifugaci z gelových zkumavek za použití druhé odběrové sady 22
??? 23
AMH (ng/ml) Výsledky AMH sérum 7 Freeze - Thaw stability 6 5 4 3 2 Volunteer 1 Volunteer 2 Volunteer 3 Volunteer 4 Volunteer 5 1 0 0 1 2 3 4 5 6 Number of freeze thaw cycles 24
AMH (ng/ml) Výsledky AMH sérum 7 Stability after separation (22 C) 6 5 4 3 2 Volunteer 1 Volunteer 2 Volunteer 3 Volunteer 4 Volunteer 5 1 0 1 2 4 24 72 168 7 8 9 10 11 12 Time 25
AMH (ng/ml) Výsledky AMH sérum 7 Stability after separation (4-8 C) 6 5 4 3 2 Volunteer 1 Volunteer 2 Volunteer 3 Volunteer 4 Volunteer 5 1 0 13 1 214 415 24 16 72 17 168 18 1 2 4 24 72 168 Time 26
AMH (ng/ml) 4,8 Výsledky všechny materiály přemrazování vzorku Freeze - Thaw stability 4,6 4,4 4,2 4 3,8 3,6 serum standard serum freeze thaw blood serum second separation 3,4 3,2 3 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 Number of freeze - thaw cycles 27
AMH (ng/ml) Výsledky všechny materiály stabilita po separaci při 22 C Stability after separation (22 C) 4,8 4,6 4,4 4,2 4 3,8 3,6 Průměr z Serum Průměr z Serum 2 Průměr z Freeze thaw gel tubes 3,4 3,2 3 1 7 2 8 49 24 10 11 72 12 168 28
AMH (ng/ml) Výsledky všechny materiály stabilita po separaci při 4-8 C Stability after separation (4-8 C) 5 4,8 4,6 4,4 4,2 4 3,8 Průměr z Serum Průměr z Serum 2 Průměr z Freeze thaw gel tubes 3,6 3,4 3,2 3 1 13 2 14 415 24 16 172 18168 29
AMH (ng/ml) Výsledky všechny materiály -20 C po dobu 30 dní Stability after separation 5 4,5 4 4,514 4,642 4,59 3,5 3 2,5 2 Průměr z Serum Průměr z Serum 2 Průměr z Freeze thaw gel tubes 1,5 1 0,5 0 FREEZER (-20 C) FOR 30 DAYS 30
Skladovatelnost zamražených vzorků -20 C 1rok -80 C více než 1rok maximální doba uložení???? (v 2015 zprac. vz. z roku 1994)
Závěry Přemražený vzorek plné krve CV(%) 5.50 Ostatní vzorky CV(%) max 4.86 32
Závěry AMH stočit do 8h (?) 24h (+11%), 20h (+15%) při RT Lednice 4 C lepší varianta Po stočení max 2x přemrazit 33
Závěry Po stočení skladování po 24h v RT úbytek AMH 2.1% po 1 týdnu v RT úbytek AMH do 10% po 1 týdnu ve 4 C úbytek AMH 0% Po zamražení -20 C, -80 C 34
doc. PharmDr. Radek Kučera, Ph.D. Oddělení imunochemické diagnostiky Fakultní nemocnice Plzeň Telefon: +420 377 401 158 Mobil: +420 603 456 958 E-mail: kucerar@fnplzen.cz Děkuji za pozornost