4. APLIKACE SUPRAMOLEKULÁRNÍ CHEMIE PRO VÝVOJ SENZORŮ - SENZOROVÁ ANALÝZA Vladimír Král, Radko Volf, Tatjana Shishkanova, Martin Kronďák, Gabriela Broncová, Miloslav Šťastný, VŠCHT Praha a ÚOCHB AV ČR Praha Obsah: 4.1. Historické perspektivy 4.2. Od receptoru k senzorům 4.3. Hmotnostní, teplotní, vodivostní, elektrochemické a optické senzory 4.4. Literatura ÚVOD Supramolekulární chemie, a to především v počátcích, byla soustředěna pouze na návrh a syntézu vhodného receptoru pro zvolený analyt, substrát. Dosažení požadované selektivity bylo považováno za cíl. Nyní se důraz v supramolekulární chemii přesouvá na funkci navrženého systému, kde rozpoznávací proces představuje pouze první nutný krok. Soustředění na funkční systémy se v současnosti realizuje především v oblasti samoskladných systémů (rozpoznání stavebních kamenů vedoucí ke vzniku požadované architektury supramolekuly), supramolekulární katalýze (rozpoznání a transformace substrátu), cíleného transportu léčiv (komplexace a cílený transport léčiva založený na rozpoznání povrchu buněk). Molekulární rozpoznání je stále více využíváno v současné analytické chemii a to jak pro vývoj nových separačních technik (napodobujících afinitní chromatografii), tak pro návrh a využití chemických sensorů a biosensorů, jejichž popis tvoří hlavní část tohoto příspěvku. Základní náplní analytické chemie jako vědní disciplíny je vývoj nových metodik důkazů a stanovení. Řešení souvisí s širším pohledem na analytickou chemii zahrnutím poznatků řady nově vznikajících oborů pro potřeby analytické chemie tak, aby byla schopna odpovídat na jednotlivé potřeby současnosti. Zatímco prvková analýza a principy analýzy anorganických materiálů postačuje i současným nárokům (obvykle se řeší již jen metodika jednotlivých stanovení pro danou konkrétní aplikaci), největší tlak je v současnosti na analýzu organických látek a biologických materiálů. Jaké řešení se v současné době nabízí? Jediné řešení, které má budoucnost, je formulováno velmi přehledně jedním z nejvýznamnějších analytických chemiků současnosti, prof. Umezawou z University v Tokiu. Ten demonstruje velmi dobře, že moderní analytická chemie 21. století nemůže jako vědní obor obstát bez aplikace nových poznatků biochemie, fyzikální chemie, kvantové chemie, molekulárního designu, kombinatoriální chemie a matematiky. Jeho pohled na filosofii analytické chemie byl nedávno uveřejněn v časopise Analytical Chemistry. 105
Methods of Analysis I teach analytical chemistry as chemical and physical methods of analysis. Physical methods of analysis are based on the direct interaction of materials (analyte) with electromagnetic waves; corpuscular beams, such as electrons and neutrons; or electric, magnetic, and gravimetric fields. Chemical methods of analysis are based on the selective interaction of materials (receptors, chromatographic media, etc.) with analytes. It is important to appreciate that various methods of instrumental analysis, including all kinds of spectroscopies, have completely changed the nature of chemical research. For example, until the end of the 19th century, organic chemistry developed with little support from physical methods because they were simply not available. Instead, organic chemists invented their own chemical methods, such as extraction, elemental analysis, melting point measurements, and functional group analysis using specific colorimetric reactions. Modern chemistry owes much to the various physical methods of analysis developed by modern, 20th century physics. Physical and chemical methods of analysis are, in fact, not clearly separated. The molecularrecognition processes in chemical senzors, chromatography, and immunoassay methods, for example, are surely chemical, but signal transduction and amplification often rely on physical methods. Even in the case of biosenzors, molecular recognition is certainly based on bioreceptors such as enzymes, antibodies, and nucleotides, but the process of following the signal transduction is mostly physical. On the other hand, in biological systems such as cells, all processes from molecular recognition to signal transduction and amplification are governed by chemical mechanisms. In analytical chemistry, the pursuit of sensitivity, selectivity, precision, and accuracy has been a priori praised and rewarded. Among these parameters, selectivity has a unique position. In most chemical methods of analysis, selectivity for analytes against interfering substances is essentially governed by the competitive binding constants between the analyte and its molecular-recognition reagent. This is generally the basis for binding assays, such as immunoassays. As a result, chemical methods of analysis owe much to natural bioreceptors, as well as to group reagents, chelating agents, and various supramolecular receptor molecules developed by organic chemists. Binding assays are typically used for analyzing bioactive substances. Conventional binding assays can neither discriminate agonists from antagonists nor give sufficient information on their physiological activities. Physical methods such as NMR and MS cannot provide this information either. The bioassay that uses intact biological tissue or whole bodies has a unique position in analysis, because it can target bioactive substances. However, the bioassay cannot give molecularlevel information because of this inherent black box approach. During the past 50 years, molecular biology has developed primarily by taking advantage of physical and chemical methods of analysis, which have elucidated the molecular chemistry behind cellular mechanisms. If analytical methods for bioactive substances are based not only on receptor binding but also on known molecular-level processes involved in signal transduction along signaling pathways (reconstructed in vitro or taken, in part, from in vivo data), these methods will be able to provide physiologically relevant analyte selectivities in terms of cellular mechanisms at the molecular level. This is of prime importance for screening and targeting pharmaceutically, toxicologically, and environmentally relevant bioactive substances. Chemical analysis methods for bioactive substances thus will rely more and more on molecular-recognition and cellular signal transduction, mimicking how living things on earth see ions and molecules. 4.1. HISTORICKÉ PERSPEKTIVY Yoshio Umezawa The University of Tokyo (Japan) Umezawa@chem.s.u-tokyo.ac.jp 106
Zatímco klasická analytická chemie dosáhla v mnoha oblastech svých metodik skutečného mistrovství a pro řadu jednosložkových systémů poskytuje přesné, správné, reprodukovatelné a robustní metodiky, naráží v současné době na řadu nových výzev, kde už nestačí klasický přístup a je třeba přijmout zcela nové metodiky řešení. To lze demonstrovat velmi dobře na největším analytickém projektu posledních 10 let, kterým byla analýza lidského genomu. Tento Human genome project představoval intenzivní mezinárodní úsilí řady týmů, a to jak univerzitních tak soukromých biotechnologických společností (Celera Genomic). Motivací bylo určení sekvence nukleotidů lidské DNA (lidského genomu), neboť to by mělo umožnit následné porozumění individuálním rozdílům mezi lidmi (genomy žádných dvou lidí kromě monozigotních dvojčat nejsou identické; interindividuální variabilita sekvence DNA u člověka dosahuje asi 0,1 %), a dále např. možnost regrese genetických onemocnění. Účinné metody sekvenování DNA byly už sice vyvinuty v druhé polovině 70. let dvacátého století, ale záměr analyzovat pořadí celého lidského genomu byl poprvé formulován v roce 1986. Již v roce 1990 bylo v USA oficiálně zahájeno financování projektu Human genome project. Tento úkol, který byl původně plánován na více než 20 let, byl ale dokončen velmi rychle díky vývoji nových automatických metodik stanovení, miniaturizaci a automatizaci založené především na senzorové analýze. A tak již v červnu 2000 oznámili společně jak zástupci akademických laboratoří tak zástupci firmy Celera dokončení předběžné verze lidského genomu. První výsledky byly publikovány v roce 2001. Mezi daty získanými oběma týmy je několik rozdílů. Celera použila strategii založenou na fragmentaci celého genomu s finálním počítačovým složením celé sekvence, zatímco v mezinárodním akademickém projektu byl genom nejprve mapován a pak byly analyzovány fragmenty DNA lokalizované na jednotlivých chromosomech (50-250 milionů párů nukleotidů). Analýza sekvence ukazuje, že genom člověka obsahuje asi 40 000 genů. Dnešní verze sekvence lidského genomu není definitivní, protože obsahuje mnoho mezer a nepřesností. Předpokládá se, že úplná analýza, která bude obsahovat méně než jednu chybu na 10 000 nukleotidů (celkový počet je asi 3,2 miliardy párů nukleotidů), bude dokončena do konce roku 2005. Tento projekt, samozřejmě kromě vlastního cíl určení sekvence, byl obrovským přínosem pro vývoj nových metodik analytické a bioanalytické chemie. Využití DNA čipů v diagnostice pro detekci známých mutací je sice teprve v počátcích, ale již dnes je patrna řada výhod této moderní hybridizační techniky jednoduchost, rychlost a velká kapacita. Do stejné kategorie výzev současné analytické chemie patří také analýza milionů nových látek, potenciálních léčiv, produkovaných kombinatoriální chemií ve farmaceutickém průmyslu. Vývoj high throughput metodik je výzvou současné analytické chemii pro analýzu kombinatoriálních knihoven. V neposlední řadě si novou metodiku vyžaduje také analytická chemie uvnitř buněk, případně analýza velmi malého subpikomolárního látkového množství sledovaného analytu. Již toto zadání indikuje potřebu nových přístupů stejně jako v jiných oblastech, např. stanovení velmi nízkých koncentrací těžkých kovů a organických polutantů. Jaké separační a analytické metody lze k tomu použít? Nové výzvy je možné nejlépe demonstrovat na běžném zadání současného analytického problému, jakým je např. analýza množství nukleové kyseliny nebo proteinu, jejichž obsah je na úrovní pikomolů, přičemž požadovanou informací je nejenom stanovení kvantitativní, ale také kvalitativní, což v případě těchto látek znamená nejenom určení primární struktury, sekvence, ale i struktury 107
sekundární, její konformace a funkce. Tím jsme vstoupili z období genomiky do období proteomiky jako hlavního cíle výzkumu příštích desetiletí. Základní náplní analytické chemie jako vědní disciplíny je vývoj nových metodik důkazů a stanovení. Řešení souvisí s širším pohledem na analytickou chemii zahrnutím poznatků řady nově vznikajících oborů pro potřeby analytické chemie tak, aby byla schopna odpovídat na jednotlivé potřeby současnosti. Zatímco prvková analýza a principy analýzy anorganických materiálů postačují současným nárokům (obvykle se řeší již jen metodika jednotlivých stanovení pro danou konkrétní aplikaci), největší tlak je v současnosti na analýzu organických látek a biologických materiálů. 4.2. OD RECEPTORU K SENZORŮM Senzorová analýza Výsledky studia mechanismu molekulárního rozpoznání aplikované do oboru analytické chemie se uplatňují především při vývoji senzorů, což je dnes horký bod chemické analýzy. Selektor navržený na základě molekulárního modelování pro selektivní komplexaci analytu našeho zájmu dovoluje vývoj nových senzorových elementů. Spojení selektoru, který rozpoznává daný analyt, s fyzikálním převodníkem umožňuje převedení interakce na vhodný analytický signál; v principu jde tedy o konverzi chemické informace na fyzikální informaci. Existuje celá řada typů senzorů, v předkládané práci jde o nalezení vhodných selektorů pro biologicky významné aniontové analyty. Rozpoznání analytu na úrovni interakce molekul je cesta, kterou ve vydala současná analytická chemie. Z původní laboratorní vědecké kuriozity se vývoj senzorů stal předmětem širokého zájmu, a to jak na akademických tak firemních pracovištích. Je to důsledek ohromného potenciálu, který senzory a biosenzory nabízejí pro revoluční změny analytických postupů. Přednostmi jsou vysoká selektivita, měření bez speciálních reagencií, nízké náklady a snadná obsluha. Současné odhady uvádějí, že více než 90 % stanovení v klinické praxi bude založeno na využití senzorů, především selektivních elektrod, fluorescenčních senzorů a biosenzorů. Vedle uplatnění v klinické praxi jsou stále více využívány při kontrole výrobních procesů, především v potravinářském průmyslu (on line analýzy), a monitorování znečištění životního prostředí, především znečištění zdrojů pitné vody. V minulém desetiletí byl zájem soustředěn na stanovení biologicky významných nízkomolekulárních látek v klinické praxi, a to především elektrochemickými senzory hlavně potenciometrickými a amperometrickými metodami. Nové směry jsou zaměřeny na použití bioafinitních systémů založených na vysoce specifických vazebných interakcích biomolekul, zejména protilátek s odpovídajícími antigeny a hapteny. Výzkum se také soustředí na miniaturizaci senzorů, přípravu a chemickou modifikaci povrchů matric a senzorů. Ale klíčovým prvkem stále zůstává nalezení vysoce selektivního receptoru (selektoru) pro sledovaný analyt. Senzorová analýza je založena na tvorbě komplexu receptoru s analytem, který je pomocí převodníku monitorován. Výsledkem tohoto procesu je analyticky užitečný signál. Toto uspořádání představuje obrovskou výhodu proti klasickým analytickým metodám, kde činidlo se stanovovaným analytem kvantitativně reaguje a výsledkem je tedy pouze jednorázová analýza. Základním přínosem senzorové analýzy je právě to, že senzorové uspořádání 108
umožňuje opakované (často v řádu desetitisíců až milionů opakovaných vzorků) stanovení sledovaného analytu. To umožňuje tvorba nekovalentního komplexu a analytem a možnost prosté regenerace receptoru. V senzorové analýze je úspěšnost metody často označována SSS, tedy stabilitou, sensitivitou a selektivitou vůči danému analytu. Proto je nutné pro každý nově vyvíjený receptor určit pro celou škálu analytů, které chceme potenciálním senzorem stanovovat, určit hodnotu konstant stability komplexů, pak můžeme z naměřených dat udělat závěr o selektivitě daného receptoru. Konstanty stability komplexu receptor-analyt V supramolekulární chemii, při studiu komplexů receptorů se substráty, je určení konstant stability zcela běžným úkolem. Jaké metody jsou k tomu používány, bude diskutováno v následující části. Obvykle vyžadujeme dostatečnou hodnotu konstanty stability komplexu, obvykle vyšší než 10 8, abychom dosáhli prakticky použitelného detekčního limitu a citlivosti. To ale není jediný požadavek. Pro stanovení také požadujeme, aby nedocházelo k rušení celou řadou analytů, které mohou být také přítomny. V senzorové analýze se samozřejmě chceme vyhnout často časově náročné a obtížně automatizovatelné separaci, proto pro prakticky použitelný receptor musí být hodnota konstanty stability komplexu o 3-4 řády vyšší než pro ostatní přítomné analyty. Obecně řečeno, tvorba komplexu mezi receptorem a substrátem (analytem) má základní význam v teorii senzorové analýzy pro určení vhodnosti receptoru pro daný analytický problém. Vazebná konstanta je použita jako kriterium pro vyhodnocení komplexačního procesu host-hostitel. Vazebné konstanty musí být určeny pro kvantitativní analýzu, samozřejmě při znalosti složení, stechiometrie komplexu. I přes nesporný význam určování vazebných konstant je obtížné najít literaturu, kde lze najít nejenom teoretické odvození a aproximace používané při jejich určení, ale i praktické pokyny k určení. Řešení tohoto problému vyžaduje zvolení vhodné metody. Komplexační jev může být charakterizován různými fyzikálními, především spektrálními a elektrochemickými metodami, mezi nejdůležitější patří NMR, UV-Vis, fluorescence, CD spektroskopie, hmotnostní spektrometrie, potenciometrie, polarografie a isotermální kalorimetrie (ITC). Dalším krokem při určení K as je zpracování experimentálních dat, použité aproximace a regresní metody pro vlastní výpočet asociační konstanty. Pro návrh a syntézu nových receptorů je používán racionální design. V současné době vykazuje možnosti ušít na míru receptor dle sledovaného analytu s vysokou selektivitou. Přechod od receptoru k senzoru vyžaduje transdukční mechanismus, fyzikální převodník, který poskytuje informaci o vazebném ději, o tom, že cílový analyt byl rozpoznán a receptor s ním vytvořil přesně definovaný komplex. Tento děj pak umožní konverzi receptoru v senzor. Oblast molekulárního rozpoznání dosáhla úrovně, která dovoluje spolehlivě navrhnout a syntetizovat receptor pro sledovaný substrát (analyt) s dobrou až vysokou spolehlivostí (selektivitou) pro komplexaci (rozpoznání) malých a středně velkých molekul. Vhodný transdukční mechanismus (hmotnostní, termický, optický, elektrochemický) pak dovoluje následnou konstrukci chemického senzoru. Cílem základního i aplikovaného výzkumu bylo porozumět vazebným mechanismům a vytvořit systém, kdy receptor má tvar zámku, do kterého jako klíč zapadne sledovaný 109
analyt. Toto poučení z přírody vedlo k přípravě a aplikaci celé řady elegantních receptorů, např. kryptandů (komplexace iontů), cyklofánů (komplexace aromátů), receptorů na bázi boronových kyselin pro sacharidy a guanidinových receptorů pro anionty. Sice ještě stále nedosahují selektivity pozorované v přírodě při tvorbě enzym-substrát, antigen-protilátka, ale mohou být ušity na jakýkoliv zvolený analyt. Návrh takového receptoru pak zahrnuje identifikaci vhodných rozpoznávacích a vazebných míst, které musí obsahovat receptor aby umožňoval selektivní komplexaci zvoleného analytu. Takovými receptorovými systémy mohou být zkoumány síly molekulárního rozpoznání, zahrnující efekt rozpouštědla, vodíkové vazby a párování iontů. I přes pokrok racionálního návrhu a molekulárního modelování je konečnou fází testování forma trial and error pro dosažení optimálního rozpoznání sledovaného analytu navrženým receptorem. Nezbytnou podmínkou pro automatizované řízení je dostupnost informací o řízeném systému. Informace, respektive veličina, fyzikální či chemické povahy je pomocí vhodného senzoru převedena na veličinu, která je zpracovatelná (typ signálu je daný typem použitého převodníku) a se kterou je schopen pracovat rozhodovací člen automatu. Především na vlastnostech samotného senzoru záleží, jak kvalitní informace budou a jak kvalitní pak bude i vlastní řízení. Senzor jako kompozitní zařízení Vlastní senzor se skládá z několika částí (obr. 1). Přítomnost analytu (detegované látky) generuje chemickou změnu v aktivní vrstvě senzoru. Aby však mohl senzor úspěšně pracovat, je nezbytnou podmínkou, aby se tato chemická změna odrazila i ve fyzikálních vlastnostech aktivní vrstvy. Typické jsou například změny barvy, změny náboje či vodivosti. Na tuto změnu fyzikálních vlastností pak reaguje fyzikální převodník signálu, jehož výstupem je informace zpravidla v elektrické formě. Jak již bylo řečeno, molekulární rozpoznání je jedním ze základních kamenů supramolekulární chemie. Pro daný substrát (neutrální molekulu, kation, anion) supramolekulární přístup spočívá v návrhu odpovídajícího receptoru, který má strukturní a chemické (vazebné) rysy, charakteristiky pro rozeznání požadovaného substrátu. Na základě řady nevazebných interakcí lze při současných metodikách syntetické chemie připravit téměř jakýkoli receptor. Ovšem v praktickém smyslu i ten nejlépe propracovaný systém z hlediska komplexace substrátu je neužitečný, pokud neexistuje operátor (transducer), který by informoval o tom, že došlo ke vzniku komplexu receptor-substrát. Tak můžeme ilustrovat rozdíl mezi ligandem/re- 110
ceptorem na jedné straně a senzorem na druhé straně. K přeměně receptoru na senzor je nutné připojit signální skupinu, která kvantitativně monitoruje interakci receptor-substrát. A právě takové spojení specifického receptoru a podjednotky schopné signalizovat interakci receptorsubstrát vytváří senzor. Efektivita senzoru pak závisí na selektivitě vazby pro daný substrát a snadnosti detekce a měření signálu (chemické informace) monitorujícího tuto vazbu (aktivní a kontrolní jednotka spojená spojkou). Nomenklatura chemických senzorů Výše zmíněná chemická informace může pocházet z chemické reakce analytu nebo z fyzikálních vlastností zkoumaného systému. Chemický senzor se skládá ze dvou funkčních jednotek: receptorové a převodníkové (transdukční) části. V receptorové časti senzoru je chemická informace transformována do energie, která je měřena fyzikálním převodníkem (transducerem). Ten převádí energii do analyticky užitečného signálu. Transducer jako takový nevykazuje selektivitu, ta je dána receptorem. Receptorová část senzoru může být založena na různých principech, a to fyzikální, neprobíhající při interakci chemické reakce, chemické, kdy chemická reakce s účastí analytu dává vznik analytickému signálu, a biochemické, kde biochemický proces je zdrojem analytického signálu (biosenzory). Chemické senzory mohou být klasifikovány podle operačního principu transduceru jako elektrochemické, optické, termální a hmotnostní. Elektrochemické senzory transformují efekt elektrochemické interakce mezi analytem a elektrodou na užitečný signál. Jedním z nejvýznamnějších analytických nástrojů současnosti se stávají fluorescenční senzory vzhledem k tomu, že jsou schopny analyzovat koncentrace analytu v submikromolárních koncentracích. Fluorescenční jednotka (fluorofor) je obvykle připojena kovalentní vazbou k rozpoznávací receptorové části. V porfyrinových a safyrinových systémech má makrocyklus dvojí roli, poskytuje vazbu analytu a současně reprezentuje inherentní fluorescenční jednotku. Vazba substrátu bývá obvykle založena na zhášení fluorescence vazbou substrátu, nebo naopak výrazným zvýšením fluorescence, jak bylo zjištěno při monitorování vazby nukleotidů ve vodném prostředí na safyrinové receptory díky jejich deagregaci. Současný trend v designu senzorů Velký zájem o rozpoznání aniontů začal kolem roku 1990, kdy si nová oblast supramolekulární chemie kladla za cíl nalezení receptorů anion-selektivních potenciometrických senzorů. Vývoj supramolekulární chemie v mnoha směrech změnil strategii řešení problémů jak v technologii tak především v analytické chemii. Téměř od začátku tohoto oboru supramolekulární chemie byly nové vlastnosti makrocyklických polyetherů spojovány s možným využitím v analytické chemii a s technologickou aplikací. Byly popsány extrakční studie a vývoj ISE spolu s vývojem nových specifických syntetických ligandů. Odhalení jejich potenciální užitečnosti v analytické chemii se táhne jako zlatá niť supramolekulární chemií. Základní aspekt sledované chemické interakce je rozpoznání cílové molekuly pomocí receptoru, a to jak přírodního, tak syntetického. Tento jev může být použit pro vývoj senzoru. Proces rozpoznání substrátu musí být spojen s amplifikací nejčastěji elektrického signálu, který je výsledkem přítomnosti chemické látky, která má být monitorována. Obecně proces sestává ze dvou stupňů: rozpoznání a zesílení. Ve většině případů je rozpoznání zajištěno chemickou interakcí, zatímco zesílení je dosaženo fyzikálním prostředkem. Návrh senzorů je nejdůležitější částí ve vývoji selektivního rozpoznání. Ačkoliv senzor 111
může být založen na různých mechanismech, funkce a kvalita senzoru závisí na tom, jak dobře umí rozeznat analyt (svou receptorovou částí), pro který byl navržen, vzhledem k ostatním látkám přítomným v mediu. Chemický senzor je tedy dle definice IUPAC nástroj, který dovoluje transformovat chemickou informaci (např. o koncentraci či přítomnosti specifického substrátu ve směsi) na analyticky užitečný signál. Dvě hlavní oblasti při návrhu senzorových elementů jsou selektivita a způsob, jak ji postihnout, monitorovat. Centrální otázka selektivity je řešena na úrovni návrhu, syntézy a testování nových selektivních ligandů pro daný substrát, kde nejlepší kandidáti mají šanci se proměnit v komerční senzory různých typů. Selektivita je proměněna na pozorovatelný jev pomocí fyzikálního převodníku, který může být různého typu. Transdukční metoda může být elektrochemická (potenciometrická neutrální nosič/přenašeč pro kationty a anionty; amperometrická neutrální nosič/přenašeč s redoxním charakterem; UV-Vis a fluorescenční pro barevný nosič/přenašeč a fluorescenční substráty). Dosud používané elektrochemické prostředky transdukce jsou převážně potenciometrické. Existují také ionofory poskytující transdukci pro amperometrickou detekci. Moderní trendy v této oblasti vedou k miniaturizaci elektrod pro komerční využití. Potenciometrické mikroelektrody jsou velice populární ve fyziologii, biochemii a bioanalytické chemii. Pro mnoho výše zmíněných aplikací musí být ligand rozpuštěn v polymerní membráně s použitím plastifikátorů, které samy také mají vliv na selektivitu a musí být pro každý speciální případ detekce optimalizovány. Požadavkům na selektivitu pro daný ligand není vždy plně porozuměno, ale vztahují se k relativní rovnováze mezi ligandem a dvěma konkurujícími substráty. Pozice rovnováhy je určena rychlostmi tvorby a disociace komplexu. U mnoha případů je tvorba komplexů velice rychlá a to, co rozhoduje, je rychlost disociace. Jestliže rychlost tvorby komplexu je nízká, pak takový ligand není vhodný ani jako přenašeč ani jako receptor pro vývoj senzoru. Úžasná citlivost očí na barvy činí senzory založené na detekci analytu určované na základě barevné změny velice atraktivní. Kolorimetrické senzory byly vyvinuty pro řadu kovových kationtů od Li + k Pb 2+. V současné době zavedení chromogenní funkce k selektivnímu karieru nečiní problém. Tak se staly design a syntéza chromoionoforů velice populární. Alternativně lipofilní anionty s vhodnou barvou jsou použity k extrakci kationtů do membrány. Ty jsou pak analyzovány jako barevné iontové páry. Klinické požadavky jsou hnací silou pro vývoj v oblasti senzorů, např. dnes dovolují stanovení lithia, sodíku, draslíku, vápníku, chloridů, uhličitanů, fosfátů a ostatních iontů v tělních tekutinách. Analýzy vody a znečištění životního prostředí (těžké kovy, nitráty) jsou také dnes už často řešeny pomocí specifických senzorů. Renesance koordinační chemie alkalických kovů v šedesátých letech měla jako jeden z hlavních motorů biologický ionofor valinomycin a syntetický ionofor dibenzo-18-crown-6. Chemické senzory založené na těchto a podobných ionoforech byly tím, co nastartovalo bouřlivý rozvoj celé této oblasti. První selektivní elektrody draselných iontů pro klinické využití byly navrženy Simonem a spolupracovníky. Vedle aplikačních záležitostí se v celé oblasti rozvíjelo studium mechanismu syntetických ionoforů pro iontově-selektivní elektrody (ISE), které ve svém důsledku umožnilo porozumění dějů vedoucích k vysoké selektivitě a navržení nových ligandů pro chemické senzory. Jednou z nejužitečnějších aplikací jsou ISE, kde je specifická odpověď k jednomu iontu v přítomnosti ostatních. Selektivitu neovlivňuje pouze typ ligandu, ale také složení membrány dané typem polymeru, plastifikátorem a solí (lipofilní protiion). Tato směs je často nazývána koktejl a činí 112
přesné srovnání výsledku z různých laboratoří obtížné. Dostatečná lipofilita a schopnost selektivně rozpoznávat daný ion je základním požadavkem na ligand pro přípravu odpovídajícího senzoru. Selektivita karieru (nosiče/přenašeče) může být alternována, je-li inkorporován do membrány všechny faktory, jako druh polymeru, plastifikátor a protiion, jsou podstatné. Operační mechanismus ISE byl studován řadou fyzikálně chemických metod, které sledují relativní kinetiku interakce karieru a sledovaných iontů a interferujících iontů. Dále se sleduje dielektrické prostředí membránové fáze, měření impedance a kvalita membránového povrchu na rozhranní s vodnou fází. Pozoruje se také relativní disociační rychlost komplexů ligandů se sledovanými ionty. Důležitost kinetiky v elektrochemických teoriích popisujících ISE je dnes všeobecně přijímána a ovlivňuje časovou konstantu (response time) ve vztahu k tloušťce a propustnosti membrány. Výsledky ukazují, že sledovaný ion (analyt) proniká pouze na povrch membrány. Elektrický efekt není způsoben přenosem iontu analytu na druhou stranu membrány, karier nepracuje v modu ekvivalentu k analytu, jak je tomu v membránových transportních systémech. Závěr o selektivitě, založený na studiu výměny radioaktivních stopových iontů, je v souhlasu s představou, že to, co určuje selektivitu, je reverzní děj, kdy disociační rychlost komplexu ion-karier je rozhodující; membrána vykazuje selektivitu pro ion, který je nejpomaleji uvolňován z komplexu v membráně. Aniontové senzory Velký zájem o rozpoznání aniontů vzhledem k jejich významu jak biologickému, tak z hlediska monitorování znečištění životního prostředí vedl k hledání selektivních senzorů pro stanovení aniontů. Jedním z nejdůležitějších je vývoj anion-selektivních potenciometrických senzorů. Vytvořit receptor pro anionty je komplikovanější úkol než je tomu v případě kationtů, protože anionty mají vesměs složitější tvar, vykazují ph závislost a mají vysokou solvatační energii. Anionty mohou mít tvar koule, např. chloridy či bromidy, mohou být lineární (thiokyanáty, kyanidy, azidy, hydroxidy, ), planární (uhličitany, dusičnany, ), tetraedrické (fosforečnany, sírany, vanadičnany, molybdenany, manganistany, ), případně mít tvar oktaedru (hexakyanoželeznatany, hexakyanokobaltitany, ). Další významnou komplikací je závislost na ph. V případě, že se nejedná o anionty silných kyselin (dusičnany, sírany, chloridy a chloristany), uplatňují se disociační rovnováhy, kdy při bazických ph je přítomen pouze aniont, ale s postupným okyselováním roztoků začnou volné anionty přecházet na nedisociovanou formu kyselin, která má z hlediska tvaru a rozpoznání zcela odlišné vlastnosti. Proto je třeba udržovat vhodné ph, což není vždy jednoduché. Třetí komplikací je vysoká solvatační energie aniontů. Anionty se ve vodných roztocích nevyskytují samostatně, ale jsou obklopeny tzv. primární hydratační sférou, která se v roztoku pohybuje s nimi. Těchto několik molekul vody je z aniontu obtížně odstranitelných. Všechny anionty lze seřadit do Hoffmeisterovy série podle jejich lipofilicity, tj. podle toho, jak ochotně přecházejí z vodné fáze do organické fáze. Protože většina senzorů je založena na organické vrstvičce, téměř všechny senzory vykazují selektivitu pro lipofilní část Hofmeisterovy řady, a naopak při stanovení hydrofilních aniontů je třeba vysoce selektivních receptorů. Klasické aniontově selektivní elektrody jsou založeny na využití kvarterních amoniových solí jako nabitých ionoforů, kde je selektivita kontrolována právě relativní lipofilicitou aniontů, Hoffmeisterovou serií zmíněnou nahoře, která sleduje obecnou sekvenci: perchlorát > thiokyanát > iodid > nitrát > bromid > chlorid > bikarbonát > fluorid. 113
Cílem v této oblasti je vyvinout elektrody s odlišným trendem, pořadím selektivity, který je dán specifickou interakcí mezi sledovaným aniontem a ligandem. Vazebná energie komplexu, který je vytvořen asociací aniontu a receptoru, redukuje přenosovou energii, která je potřeba k extrakci aniontu z vodné fáze do membrány. V kontrastu k velkému množství ionoforů, které jsou známy pro selektivní komplexaci aniontů, existuje pouze malé množství ionoforů, které jsou vhodné pro konstrukci anion-selektivních membránových elektrod. Ty lze rozdělit do několika typů podle interakce na které jsou založeny: elektrostatické interakce, klasická aniontová výměna; ligandy jsou dusíkaté makrocykly s protonovaným nebo kvarterním dusíkovým atomem a guanidinové deriváty. Dalším vazebným modem je výměna ligandu, např. u metaloporfyrinových komplexů, kde bylo dosaženo zcela odlišné selektivity než jaká je dána Hoffmeisterovou serií (např. pro dusitanové ionty). Další interakce spočívá v koextrakci aniontu a kationtu receptorem (dosud ale nebyla popsána analytická aplikace), dále ve vytváření kovalentní vazby mezi receptorem a substrátem, např. trifluoracetofenony jako neutrální kariery pro tvorbu kovalentní vazby s uhličitany, a dále i receptory typu Lewisovské kyseliny (boronové sloučeniny, rtuťnaté, organické sloučeniny cínu a rtuti) pro interakci se substráty typu Lewisovských bazí. Vitamín B 12 je znám svými koordinačními schopnostmi pro anionty. Několik hydrofobních derivátů vitamínu B 12 bylo použito pro vývoj iontově selektivních elektrod. Objev vazby aniontů v porfyrinu se podobajících makrocyklech a metaloporfyrinech vedl k vývoji dusitanových selektivních elektrod a salicylát-selektivních elektrod. Bylo pozorováno, že povaha plastifikátoru ovlivňuje selektivitu elektrody, často mechanismem, který je založen na stacking interakci plastifikátoru a substrátu; toto bylo pozorováno u benzoátů. Protonované lipofilní makrocyklické polyaminy byly použity pro vývoj potenciometrických senzorů pro nukleotidy AMP, ADP a ATP ve formě jejich aniontů, resp. polyaniontů. V nedávné době bylo popsáno použití expandovaných porfyrinů pro rozpoznání aniontů. Tento nový přístup ke komplexaci aniontů pomocí nových pyrrolových makrocyklů dovoluje podle velikosti cyklu a jeho náboje selektivní komplexaci různých aniontů. Tyto látky jsou v současné době testovány jako receptory pro vývoj aniontově selektivních elektrod s důrazem na fosfáty a nukleotidy. Další zvýšení selektivity bylo dosaženo zavedením nukleobáze (C, G) na periferii makrocyklu tyto ligandy rozpoznávají současně jak anion (fosfát), tak komplementární nukleobázi příslušného nukleotidu. Předběžné výsledky ukazují na reálnou možnost jejich využití jako senzorových elementů. Senzory organických molekul Vývoj senzorů pro organické ionty a neutrální molekuly je stimulován převážně farmaceutickým výzkumem a klinickou bioanalytickou chemií. Neutrální ligandy typu makrocyklických etherů byly použity pro vývoj senzorů pro biologicky významné kationty (guanidinium, adenosinium, amfetaminium, amoniové ionty). Lipofilní cyklodextriny byly použity pro selektivní vazbu a detekci oniových iontů a ukázaly selektivitu pro kvartérní amoniové ionty před kationty kovů. Významnou vlastností lipofilních cyklodextrinů je jejich schopnost chirálního rozpoznání, čehož bylo využito pro monitorování aryl-substituovaných aminoalkoholů, kde mechanismus dělení je založen na inkluzi aromatické části molekuly. Na tomto principu byly založeny ISE pro měření enantiomerní čistoty efedrinu v přítomnosti ostatních kationtů. Senzory neutrálních organických molekul detegovaných prostřednictvím jejich protonovaných forem byly popsány v literatuře. Tento princip byl použit pro ISE na bázi substituovaných kalixarenů pro selektivní detekci primárních, sekundárních a terciárních aminů založené na tvaru molekuly. 114
Organizované monomolekulární vrstvy a dvojvrstvy představují jedinečné prostředí pro studium molekulárního rozpoznání. Takovéto systémy jistě budou v budoucnu důležité pro vývoj molekulárních senzorů. Pionýrská práce Kunitakeho ukázala, že molekulární rozpoznání je založeno na vzniku vodíkových vazeb na monovrstvě vystavené vodné fázi. Jeli monovrstva tvořena selektivním ligandem, tak jako v případě resorcinolových cyklotetramerů, může být využita pro přípravu modifikovaných elektrod pro monosacharidy. Pro zvýšení selektivity pro anionty či neutrální molekuly je možné kombinovat vazbu kationtů, která modifikuje konformaci ligandu a vytváří selektivní velikost a tvar pro vazbu sledovaného analytu. Takováto heterotropní kooperativita (alosterická regulace) je velmi vhodnou a slibnou metodikou pro konstrukci senzorových systémů. Důležitým cílem v analytické chemii v následujícím desetiletí bude vývoj molekulárních systémů obsahujících receptorové molekuly, které budou schopny převádět chemickou interakci na molekulární úrovni na fyzikální kvanta na makroskopické úrovni. Pro takové systémy byl Lehnem navržen název molekulární elektronika, která spočívá na vytvoření molekulárního systému skladbou vhodně navržených molekul, který je pak schopen předávat a shromažďovat informace přes chemickou interakci, fyzikální převod bude zajištěn elektronickými nebo optickými signály. Alternativní přístup navržený Reinhoudtem je založen na integraci syntetického receptoru s čipem pomocí litografické techniky. Chemický senzor je zařízení poskytující odezvu při interakci s konkrétním analytem. Tato interakce musí být selektivní a reversibilní a takovýto senzor se pak uplatní pro kvantitativní a kvalitativní analýzu. Vlastní senzor je kompozitní zařízení, které se skládá z několika částí (obr. 4.2). Přítomnost analytu (detegované látky) generuje chemickou změnu v aktivní vrstvě senzoru. Aby však mohl senzor úspěšně pracovat, je nezbytnou podmínkou, aby se tato chemická změna odrazila i ve fyzikálních vlastnostech aktivní vrstvy. Na tuto změnu fyzikálních vlastností pak reaguje fyzikální převodník signálu (v anglické literatuře transducer), jehož výstupem je informace zpravidla v elektrické formě. Tu už není obtížné dále převést na napětí a dále na číslicová data, jak je naznačeno na obrázku 4.2. Aktivní vrstva senzoru Fyzikální převodník signálu Zesilovač A/D převodník Číslicové zpracování signálu Obrázek 4.2: Schéma chemického senzoru Typickými fyzikálními převodníky signálu jsou: elektrochemické převodníky zahrnující iontově-selektivní elektrody (ISE), iontově-selektivní a chemicky citlivé polem řízené tranzistory (ISFET a ChemFET), plynové sensory s pevným elektrolytem a polovodičové plynové senzory. Selektivita Jako u každého měřícího zařízení, i u senzorů je třeba definovat parametry ovlivňující kvalitu získaného signálu. Mezi nejvýznamnější kritéria patří selektivita. Ta určuje míru s jakou je signál citlivý právě na určitý analyt, a to relativně vzhledem k ostatním analytům či interferentům (neměřeným složkám ovlivňujícím signál) obsaženým v matrici analyzovaného systému. Vzhledem k velmi odlišným vlastnostem chemických snímačů různých typů je selektivita kvantifikována různě. 115
Mějme lineární měřící systém odpovídající soustavě lineárních nezávislých kalibračních rovnic: y = S c + S c + K + S c 1 11 1 12 2 1n y = S c + S c + K + S c M 2 21 1 22 2 2n y = S c + S c + K + S c m m1 1 m2 2 mn T T S y = S Sc = Kc n n n (0.0.1), kde počet měření je m (tj. měření senzorovým polem o m senzorech či na m kanálech přístroje), počet všech měřitelných složek (analytů plus interferentů) je n a platí m n. Signály jsou označeny y j (pro j-tý kanál), měřené koncentrace c i a kalibrační koeficienty (vlastně selektivní citlivosti pro j-té měření a i-tou složku zjistitelné kalibrací) S ji. Pokud je m > n a matice soustavy (1) je alespoň řádu n, pak lze provést regresní vyrovnání na čtvercovou soustavu transformací matice soustavy S m n na K n n podle maticového vztahu (0.0.2) Zde S T y = Kc je tedy soustava n rovnic o n neznámých, která vznikla vyrovnáním nepřímého měření podle systému (1), a to, jak je možné dokázat statistickou analýzou (při normálním rozdělení chyb), na základě metody nejmenších čtverců. U tohoto systému seřadíme jednotlivé řádky (měření) tak, aby j-té měření bylo nejcitlivější na j-tou složku, tj. koeficient k jj byl v absolutní hodnotě největší ze všech k ji (na diagonále budou absolutně největší prvky). Pak je selektivita definována pro každou j-tou měřitelnou složku jako k jj η j = (0.0.3) k i j ji Vidíme, že u dokonale selektivního měření, jehož selektivita η j bude limitovat k nekonečnu, jsou všechny kalibrační koeficienty ostatních složek nulové, takže koncentraci měřené složky bude možné spočítat pouze na základě tohoto jediného měření. U nedokonale selektivních systémů je třeba řešit celou soustavu S T y = Kc a zde přistupují samozřejmě další ukazatelé kvality měření vzhledem k řešitelnosti a chybám, jako např. velikost determinantu soustavy. Dále se používají kritéria srovnávající pouze 2 složky, z nichž jedna je měřeným analytem a druhá nežádoucím interferentem. Tzv. koeficient selektivity udává, kolikrát nižší poskytne senzor signál při měření interferentu než při měření sledovaného analytu, přičemž jak interferent tak analyt mají stejnou koncentraci. Tento ukazatel tedy charakterizuje jednotlivé interferenty vzhledem k nominálně určenému jedinému analytu, pro nějž byl daný senzor vytvořen. Pro stanovení koeficientů selektivity u iontově selektivních elektrod, které mají logaritmickou odezvu na koncentraci analytu (viz dále), však mezinárodní normy a doporučení stanovují jinou definici koeficientu selektivity a několik různých metod jeho měření, které zpravidla závisejí i na dalších experimentálních podmínkách. Proto je někdy vhodné selektivitu elektrod ověřit experimentálně a vždy publikovat použitou metodu. Deklaruje se zde koeficient selektivity k i,j definovaný v Nicolskii-Eisenmanově rovnici: E = K + S a + k a n/ z log( i i, j j ) (0.0.4), kde E je potenciál indikační elektrody senzoru, a i je aktivita primárního analytu (určeného k měření) o nábojovém číslu n, a a j aktivita interferentu s nábojovým číslem z, K a S jsou 116
konstanty Nernstovy rovnice (viz dále) stanovené většinou kalibrací [Aktivita iontu je poměrová termodynamická veličina zohledňující energetický stav všech iontů v dm 3 roztoku a pro dostatečně zředěné roztoky (ca < 10-3 mol.dm -3 ) se číselně (nikoliv rozměrem) přibližně rovná molární koncentraci (v mol.dm -3 ).]. Zde je na místě upozornit na problémy všech potenciometrických měření, které do analytického výsledku zavádějí přesně nespočítatelné, ale přibližně odhadnutelné chyby. Ty jsou způsobeny tím, že elektrody reagují na aktivity, nikoliv koncentrace, a navíc samotné potenciály elektrod jsou přímo nezměřitelné a při jejich vyhodnocení z napětí galvanických článků se používají teoretické předpoklady, které vedou k jejich odhadům. Z těchto důvodů nelze při vyhodnocování potenciometrické odezvy spoléhat jen na teoretické vztahy, ale je třeba tento měřicí systém důsledně kalibrovat. Koeficient selektivity vlastně zhodnocuje vliv interferentu j na měření analytu i, pro který je elektroda nominálně určena. Je zřejmé, že by měla být jeho hodnota co nejmenší za přijatelnou se považuje nanejvýše 10 3, ale záleží také na aktivitě přítomného interferentu n/z (člen k i,j a j je zde z hlediska měření chybový je-li nulový, rovnice (0.0.4) přechází v jednodušší tvar Nernstovy rovnice). Citlivost, koncentrační rozsah Jednou z dalších základních charakteristik senzorů je citlivost, která bývá udávána jako změna výstupního signálu na jednotkovou změnu koncentrace. Senzory s lineární odezvou mají citlivost konstantní pro koncentrace spadající do tzv. oblasti linearity, u nelineárních odezev se citlivost určuje jako reciproká derivace kalibrační křivky. Dále bývá u chemických snímačů uváděn použitelný koncentrační rozsah, který je někdy definován oblastí linearity (vyhodnocovaným na základě statistiky); nicméně v praxi nemusí být odezva striktně lineární, stačí je-li monotónní a dostatečně strmá. Pak je definována tabulkou nebo nelineární funkcí empiricky získaným polynomem nebo empiricky stanovenými parametry teoretické závislosti (např. Nernstovy rovnice, viz dále). Limitní statistické parametry Dalším parametrem posuzovaným u senzorů i kompletních analytických systémů je statistický limitní parametr označovaný jako mez detekce, detekční limit. Tato veličina udává nejmenší možnou koncentraci analytu, která je ve vzorku detekovatelná danou metodou s určitou maximální velikostí statistické chyby 1. druhu α. Norma IUPAC definuje detekční limit jako trojnásobek směrodatné odchylky signálu, který je získán opakovaným měřením slepého vzorku (vzorku o nulové koncentraci analytu), dělený citlivostí (přepočet na koncentrační jednotky). Uzanční koeficient 3 však vede k hodnotě α = 0,0013 (předpoklad normálního rozdělení pravděpodobnosti) a tím k pravděpodobnosti 99,87 %, což je při statistických testech nezvykle vysoká hodnota (obvykle je to 95 %, maximálně 99 %). Tato definice má některé nevýhody (nedostupnost slepého vzorku, nelinearita odezvy, interference). V praxi je proto ke stanovení hodnoty limitu někdy používána extrapolace kalibračního grafu při koncentracích řádově srovnatelných s mezí detekce na nulový signál. Směrodatná odchylka se pak vypočítá pomocí lineární regrese jako výběrová směrodatná odchylka úseku regresní kalibrační přímky na ose signálu (tj. pro nulovou koncentraci). Citlivost je zde dána směrnicí regresní kalibrační přímky. Vyjádření limitu detekce v koncentračních jednotkách je obvyklejší u kompletního analytického systému než u samotného senzoru. Zde je často vhodnější jiná veličina, a tou je odhad směrodatné odchylky či střední kvadratická integrální hodnota (rms) šumu signálu získaného při měření prázdného roztoku. Z této hodnoty se vynásobením třemi získá tzv. 117
instrumentální detekční limit v signálových jednotkách, který je nezávislý na citlivosti měření. Pro kontrolu čistoty životního prostředí, potravin, léků apod. má podstatný význam jiný limitní parametr, tzv. limit záruky čistoty (Limit of Guarantee of Purity). Ten je odvozen od limitu detekce, ale závisí též na statistické chybě druhého druhu β, která se opět, v souladu s limitem detekce, stanoví nanejvýše na 0,0013. Limit záruky čistoty je dvojnásobkem detekčního limitu (o 3 směrodatné odchylky vyšší) a určuje minimální koncentraci, kterou můžeme danou metodou (měřením určitým senzorem) s velkou pravděpodobností (99,87 % a vyšší) vyloučit. Bude to právě tehdy, když látka nebude detekována, tj. naměříme-li koncentraci menší než limit detekce. Naměříme-li vyšší koncentraci, lze přítomnost analytu vyloučit s touto pravděpodobností v koncentraci opět o 3 směrodatné odchylky vyšší. Dalším limitním parametrem je limit stanovitelnosti senzoru. Limit stanovitelnosti je nejmenší koncentrace analytu, kterou lze kvantitativně změřit s relativní směrodatnou odchylkou (koeficientem variace) rovnou alespoň 10 % měřené hodnoty. Je-li naměřena koncentrace mezi limitem stanovitelnosti a detekčním limitem, je analyt přítomen s pravděpodobností nejméně 99,87 %, ale nelze určit s výše stanovenou přesností jeho koncentraci. U potenciometrických senzorů (např. iontově selektivních elektrod) se výše uvedené definice nedají dost dobře aplikovat. Potenciometrická odezva je lineární s logaritmem koncentrace a tzv. praktický detekční limit se stanoví jako koncentrační parametr průsečíku extrapolované lineární části signálu s nenulovou směrnicí (nenulová odezva senzoru) a lineární části s nulovou směrnicí (kdy senzor na daný analyt nereaguje). V odborné literatuře existují polemiky o správnosti různých přístupů. Proto se doporučuje vždy uvádět způsob, jakým byl daný praktický detekční limit získán. Dynamické vlastnosti, stabilita Dynamické vlastnosti senzorů charakterizuje nejčastěji časová konstanta přechodové charakteristiky, tj. jsou hodnoceny v běžném významu zavedeném obecně v měřící technice. Dlouhodobá časová, resp. teplotní stabilita je popisována poklesem citlivosti, případně změnou ofsetu, která se udává v % za jednotku času, resp. na stupeň Kelvina. S tím souvisí i maximální časový interval přípustný mezi dvěmi rekalibracemi; tento interval zpravidla určuje výrobce. Design aktivní vrstvy senzoru Jak již bylo uvedeno výše, informace o chemických vlastnostech analyzovaného média vzniká v aktivní vrstvě, která obsahuje vlastní receptor (nebo také ionofor), tedy molekulu, které interaguje s molekulou detekované látky. Receptor je zpravidla velká molekula, která obsahuje místo (kavitu), do kterého svým tvarem přesně zapadne molekula analytu, molekuly ostatních látek do kavity nezapadnou zdaleka tak přesně a ke komplexaci dochází v mnohem menší míře. Tento rozpoznávací princip je nazýván zámek a klíč. V anglosaské literatuře je nazýván host-guest recognition, tedy rozpoznávání hostitel-host, a je v centru zájmu odvětví zvaného supramolekulární chemie. Při vlastním rozpoznávání nedochází k vytvoření klasické kovalentní vazby, nýbrž je dílem t.zv. mezimolekulárních interakcí. Mezi receptorem a analytem může nastat několik typů interakcí, jejich účinek se sčítá a může být dokonce významnější než by tomu bylo v případě běžné vazby. Pro úspěšnou komplexaci je nutná komplementarita jednak co do smyslu velikosti kavity receptoru a analytu a jednak co do prostorového umístění jednotlivých interagujících vazebných center. 118
Nejsilnějšími mezimolekulárními interakcemi jsou elektrostatické síly, které se uplatňují při interakci dvou nabitých částic (Coulombické interakce), případně částic vykazujících permanentní dipólmoment či kvadrupólmoment (látky s nesymetrickým rozložením elektronové hustoty). Je zřejmé, že přitažlivá síla se projeví mezi opačně nabitými póly. Toho lze s výhodou využít při návrhu molekuly receptoru pro kationty či anionty, nicméně tato interakce nemůže být jediná, neboť, na rozdíl od dalších, není směrová. Dalším druhem možných interakcí jsou lipofilní interakce. Ty jsou založeny na známém pravidle, že podobné se rozpouští v podobném, tedy látky polární v polárních rozpouštědlech a látky nepolární v rozpouštědlech nepolárních. Obsahuje-li molekula receptoru nějakou výrazně nepolární část, bude tato vytvářet interakci s nepolární částí detegované molekuly. Tento komplexační mód se tímto způsobem uplatní pouze v polárním prostředí. V opačném případě by došlo k soutěži mezi nepolárními molekulami rozpouštědla a analytu a interakce by byla výrazně oslabena. Třetím druhem nekovalentních interakcí, významných pro molekulární rozpoznávání, jsou vodíkové vazby. Navzdory názvu se nejedná o opravdovou chemickou vazbu, nýbrž o slabou donor-akceptorovou interakci. Ta, jak už z názvu vyplývá, nastává mezi vodíkem, který má prázdný elektronový orbital a chová se jako příjemce (akceptor) elektronů, a jejich donorem, většinou kyslíkem, který má naopak dva volné elektronové páry a tendenci elektrony nabízet. Samozřejmě donor-akceptorová interakce může nastat i mezi jinou dvojicí donor-akceptor, ale interakce vodík-kyslík je v přírodě nejčastější a je mj. odpovědná za některé vlastnosti vody. 4.3. HMOTNOSTNÍ, TEPLOTNÍ, VODIVOSTNÍ, ELEKTROCHEMICKÉ A OPTICKÉ SENZORY V předchozí části jsme definovali požadavky na senzor a nastínili možnosti designu molekuly receptoru pro různé kategorie analytů. Avšak samotná molekula receptoru schopná komplexovat analyt je nepoužitelná bez vhodného fyzikálního převodníku, který transformuje chemickou změnu na měřitelnou, zpravidla elektrickou veličinu. O principu některých druhů těchto převodníků a jejich vlastnostech bude pojednáno zde. V praxi se používá několik různých typů fyzikálních převodníků, které lze rozčlenit mnoha způsoby. Prvé rozdělení je na základě nosiče informace na elektrické, které poskytují elektrický výstupní signál, a na neelektrické, např. mechanické senzory. Elektrické senzory z mnoha praktických důvodů dominují a lze je dále z praktické hlediska rozdělit na i) elektronické, ii) polovodičové a iii) mikroelektronické. Jiný způsob klasifikace fyzikálních převodníků je podle druhu snímané veličiny na snímače i) mechanické (poloha, otáčky, ), ii) tepelné (teplota, tepelný tok, ), iii) elektrické (proud, napětí, výkon, ), iv) magnetické (magnetická indukce, intenzita pole, ), v) radiační (intenzita záření ve viditelné oblasti, UV, infračervené, α, β, γ, RTG, ) a konečně vi) chemické senzory. Třetí možností klasifikace je dělení na aktivní snímače, které jsou zdrojem energie, a na pasivní snímače, které samy o sobě zdrojem energie nejsou. Čtvrtým způsobem dělení je rozdělení podle způsobu interakce s měřeným prostředím na snímače dotykové a bezdotykové. Jako u každého zařízení vyvstává potřeba popsat parametry jednotlivých senzorů. Prvním kritériem hodnocení chemických senzorů je jejich selektivita. Koeficient selektivity udává kolikrát poskytne senzor nižší signál při měření interferentu než při měření sledovaného analytu, přičemž jak interferent tak analyt jsou o stejné koncentraci. Pro stanovení tzv. koeficientů selektivity u iontově selektivních elektrod lze v odborné literatuře 119
nalézt mnoho různých metod, které jsou mnohdy ovlivňovány vnějšími podmínkami. Proto je vždy vhodné selektivitu experimentálně ověřit při těchto konkrétních podmínkách. Pro praktická měření by koeficient selektivity měl být alespoň 0,001, mnohdy se však musíme spokojit se selektivitou podstatně nižší. Dalším parametrem posuzovaným u senzoru je mez detekce. Tato veličina udává nejmenší možnou koncentraci analytu, která je ve vzorku detegovatelná. Norma IUPAC definuje detekční limit jako trojnásobek směrodatné odchylky signálu, který je získán měřením slepého vzorku (vzorku o nulové koncentraci analytu). Tento způsob má však i některé nevýhody a v praxi je mnohem častěji využívána metoda, kdy se lineární částí (pro koncentrace, kde je signál přímo úměrný koncentraci) a konstantní částí (pro nízké koncentrace, při kterých signál nezávisí na koncentraci) proloží dvě přímky a detekční limit je roven jejich průsečíku. Někdy se též nazývá praktický detekční limit. V odborné literatuře existují velice bouřlivé polemiky o relevantnosti obou přístupů. Doporučuje se vždy uvádět způsob, jakým byl daný detekční limit získán. Analogicky lze získat tzv. horní detekční limit, který však nemá takovou důležitost jako detekční limit spodní, neboť v případě příliš koncentrovaného vzorku lze tento snadno naředit. Třetím parametrem je koncentrační rozsah senzoru. Koncentrační rozsah je rozmezí koncentrací, mezi kterými lze stanovit koncentraci analytu. Je-li koncentrace mezi dolní mezí koncentračního rozsahu a dolním detekčním limitem, lze určit, zda je analyt přítomen či nikoli, ale nelze určit jeho koncentraci. Totéž analogicky platí pro horní mez koncentračního rozsahu a horní detekční limit. Koncentrační rozsah je někdy též nazýván rozsahem linearity, nicméně v praxi nemusí být odezva striktně lineární, stačí je-li monotónní a dostatečně strmá. Čtvrtou základní charakteristikou senzoru je citlivost, která bývá udávána jako změna výstupního signálu na jednotkovou změnu koncentrace. Předpokladem pro toto vyjádření je lineární odezva senzoru. Obecně platí, že čím strmější je jeho kalibrační křivka, tím lépe. Dynamické vlastnosti senzorů charakterizuje časová konstanta senzoru v jejím běžném významu v měřící technice. Dlouhodobá časová stálost je popisována poklesem citlivosti, který se udává v % za jednotku času. Pro praktické použití hromadně vyráběných senzorů je důležitá i doba mezi rekalibrací senzoru, tento časový interval zpravidla určuje výrobce. Hmotnostní senzory Hmotnostní senzory tvoří asi 6 % používaných chemických senzorů a jsou navíc i velice prespektivní. Přírůstek hmotnosti na aktivní ploše senzoru generuje změnu elektrického signálu. První typem jsou QCM senzory (z anglického Quartz Crystal Microbalances). Na povrchu piezokrystalu, zapojeného v oscilátoru, je nanesena aktivní vrsta s receptorem, který je schopen selektivně komplexovat analyt. Na této vrstvičce se vratně sorbuje analyt z plynného vzorku a to tím více, čím vyšší je jeho koncentrace ve stanovovaném médiu. Změna kmitočtu oscilátoru souvisí se změnou hmotnosti citlivé vrstvičky deponované na povrchu piezokrystalu podle vztahu f = f 2 m N ρ F (0.5), kde f je změna frekvence, f je základní frekvence oscilátoru, m je změna hmotnosti na povrchu krystalu, N je frekvenční konstanta, ρ je hustota sorbentu a F jeho plocha. Touto sorpcí dochází ke změně hmotnosti vrstvičky a tím i změně vlastní frekvence oscilátoru. Schematicky je systém znázorněn na obrázku (n). Základní frekvence oscilátoru se pohybuje v řádu 1 až 10 MHz a systém musí být dobře temperován na konstantní teplotu a navíc je 120
teplotně kompenzován použitím diferenčního uspořádání zařízení. To je rovněž citlivé na průtok média a proto musí být průtok udržován konstantní. Určitou nevýhodou je nelinearita odezvy. Dosahované detekční limity jsou typicky 1-10 ppm pro plyny. V praxi se QCB používají pouze pro plyny. Mezi používané sorbenty patří například trietanolamin (na SO 2 ), kyselina sorbová s AgNO 3 (NH 3 ), carbowax550 (toluen), Pd (H 2, detekční limit 10 ppb!) a LiCl v želatině (stanovení vlhkosti). Referenční oscilátor Směšovač frekvencí A/D Měřící oscilátor Rozdílová frekvence Měřící cela Křemenný výbrus se sorbentem Obrázek 4.3: Schéma hmotnostního senzoru QCM Jiným, obdobným druhem hmotnostích snímačů jsou tzv. SAW snímače, kde SAW je zkratkou z anglického Sourface Acoustic Wave, tedy povrchová akustická vlna. Principem techniky je vygenerování Rayleighovy akustické vlny, která se šíří po povrchu podložky modifikovaném selektivně reagujícím sorbentem, přičemž změna hmotnosti tohoto povrchu způsobí změnu rezonanční frekvence ( f) senzoru vlivem absorbovaného analytu. Změna rezonanční frekvence je přímo úměrná čtverci rezonanční frekvence a plošné hmotnosti citlivé vrstvy. Pracovní frekvence senzoru se volí v rozsahu od 10 MHz do řádově jednotek GHz a dosahované detekční limity jsou velmi nízké, typicky 10-9 až 10-15 g, což odpovídá např. koncentraci 100 ppb SO 2 ve vzduchu. Schéma měřící aparatury je znázorněno na obrázku 4.4.. 121
VF generátor Fázový posun Komparátor A/D převod Obrázek 4.4: Schéma hmotnostního senzoru SAW Teplotní senzory Teplotní senzory jsou nejčastěji založeny na vzniku tepelného efektu na fázovém rozhraní kapalina tuhá fáze nebo plyn tuhá fáze, přičemž plyn nebo kapalina jsou analyzovaným vzorkem a tuhá fáze je teplotním senzorem, jehož povrch je vhodným způsobem upraven látkou (katalyzátorem), která umožňuje reakci analyzované složky vzorku a reagencie a která se ke vzorku v dostatečném množství přidává. Možné je také uspořádání, kdy látka nanesená na povrch teplotního senzoru přímo reaguje s analytem v plynné nebo kapalné fázi za vzniku tepelného efektu. Příkladem prvního typu senzoru jsou diferenční teplotní biochemické senzory, přičemž na povrchu jednoho z nich je zakotven enzym (biokatalyzátor) a druhý senzor je srovnávací. Vysoce selektivní biokatalyzátory, např. typu oxidas, jsou schopny za přítomnosti kyslíku selektivně konvertovat (oxidovat) některé organické látky, například jednoduché cukry, za uvolnění značně velkého množství reakčního tepla (řádově 10 4 10 5 kj/mol). Detekční limity pro stanovení glukosy, fruktosy a dalších cukrů pro výše uvedené senzory jsou na úrovni 10-6 až 10-7 mol/l. Jako teplotních činidel bylo v minulosti používáno dnes již zastaralých a necitlivých termočlánkových baterií, v současné době pak především platinových odporových teploměrů, termistorů a teploměrů pracujících na pyroelektrickém principu. Nevýhodou všech teplotních chemických senzorů je, že je nutno stabilizovat teplotu okolí jejich umístěním v termostatu a, jak již bylo výše naznačeno, využít diferenčního zapojení s jedním aktivním a jedním srovnávacím čidlem. Vodivostní chemické senzory Pro vodivostní senzory, jak již název sám napovídá, je charakteristická změna vodivosti citlivé vrstvičky v závislosti na koncentraci analytu. Citlivou vrstvou může být vodič prvního druhu napařený kov. Jako příklad je možno uvést destičku z izolantu (např. ze slinutého oxidu hlinitého-aluminy) s napařenou vrstvou zlata o tloušťce 100 až 200 nm. Tento 122
senzor lze použít pro detekci vysoce reaktivních sodíkových par ve vakuu. Odpor zlaté vrstvičky prudce naroste za vzniku slitiny AuNa (x) a to dokonce o několik řádů. Příkladem vodivostního senzoru založeného na vodiči druhého druhu, tedy elektrolytu, je destička opatřená platinovými elektrodami s naneseným polymerem (směsí polyvinylacetátu a polyvinylalkoholu) obsahujícím hydroskopický chlorid lithný. Pomocí takovýchto senzorů je pak možno měřit relativní vlhkost plynů v mezích od 10 do 99 % při teplotách od 40 do +60 C. Třetí kategorií materiálů pro citlivou vrstvu je polovodič, např. na bázi oxidu cíničitého. Konkrétní vlastnosti senzorů tohoto typu se značně liší jednak podle jejich provedení, tj. zda-li se jedná o sintrovaný, tlustovrstvý či tenkovrstvý senzor, a v nemenší míře podle přítomnosti některých dopujících látek, které selektivitu ovlivňují velice dramaticky (obr. 4.5). 1 Odporové topení R/R 50 H 2 CO Pt přívody i-c 4H 10 0,2 C 2 H 5 OH koncentrace [ppm] 3000 A citlivá vrstva izolátor topení 10 R/R 50 H 2 i-c 4 H 10 + CO Pt přívody ferit 1 3000 0,2 C 2H 5OH koncentrace [ppm] B Pt přívody napařená citlivá vrstva 1,4 CO SiO2 R/R 50 i-c 4H 10 + H 2 ferit topení 1 3000 0,6 koncentrace [ppm] C 2H 5OH C Obrázek 4.5: Schema konstrukce různých typů SnO2 senzorů a příklady jejich odezvy na vodík, oxid uhelnatý, isobutanol a páry etanolu. A) sintrovaný SnO 2 senzor se stopami palladia a kovového kovového cínu, B) tlustovrstvý SnO 2 senzor s aktivní vrstvou dopovanou 123
palladiovou černí a C) příklad tenkovrstvého SnO 2 senzoru s napařenou vrstvou dopovanou Pd černí. R 50 je odpor vrstvy při koncentraci 50 ppm. Selektivita jednotlivých typů senzorů je ovlivněna způsobem interakce analyzovaného plynu s aktivní vrstvou a eventuelně přítomností některých dalších složek. Vodivost oxidu cíničitého, který je polovodičem typu N, vzrůstá za přítomnosti donorů elektronů (F -, O 2, Sb, apod.). Přítomnost plynů, jako je vodík, metan či isobutan, ve směsi se vzduchem, které vytěsňují resp. reagují za zvýšené teploty s kyslíkem (nebo přesněji s kyslíkovými radikály na povrchu polovodivého SnO 2 ), způsobí, že vodivost aktivní vrstvy senzoru bude klesat. Naopak za přítomnosti kyslíku, oxidu uhličitého či par etanolu, tj. kyslík obsahujících látek, se bude vodivost aktivní vrstvy zvyšovat. Z toho také plyne, že při měření je nutno zachovávat konstantní koncentraci okolního kyslíku a samozřejmě i teplotu. Jako konstrukčních materiálů vodivostních senzorů bylo využito ve výrobě i ve výzkumu i jiných polovodivých oxidů (oxid inditý, oxid železitý, směsné oxidy hlinité a vanadičné, oxid nikelnatý a další), které samozřejmě mají odlišnou selektivitu. Některé jejich typy jsou vyráběny v obrovských seriích. Používají se téměř výhradně pro analýzu plynných směsí. Potenciometrické senzory Iontově selektivní elektrody Iontově-selektivní elektrody (ISE) patří, co do počtu prováděných analýz, k nejdůležitějším a nejfrekventovanějším analytickým technikám vůbec a přitom s využitím cenově dostupných elektrod a měřících přístrojů (zpravidla digitálních voltmetrů s vysokým vstupním odporem). Jejich princip je založen na měření potenciálu mezi dvěma elektrodami, jedné pomocné, referenční, jejíž potenciál nezávisí na koncentraci analyzovaných iontů, a měrné, jejíž potenciál závisí, v ideálním případě, na koncentraci podle Nernstovy rovnice: f 0,059 E= E + log c (0.6), z kde E je potenciál měrné elektrody, E f je tzv. formální potenciál elektrody, který je zpravidla konstantní, z je nábojové číslo analyzovaného iontu a c jeho koncentrace v roztoku. Z této rovnice plyne, že je-li elektroda citlivá na kationty, pak s rostoucí koncentrací roste i její potenciál a naopak, je-li citlivá na anionty, pak s rostoucí koncentrací její potenciál klesá. Potenciometricky nelze přímo stanovovat nenabité neutrální molekuly. Typickým reprezentantem iontově-selektivních elektrod je skleněná elektroda citlivá na vodíkové ionty, respektive kyselost (obr. 4.6a), jejíž základem je speciální lithné sklo. Skleněná elektroda poskytuje lineární, Nernstovskou odezvu v širokém rozsahu ph od 2 do 12, tedy v rozmezí koncentrací vodíkových iontů od 0,01 mol.l -1 do 10-12 mol.l -1 (obr. 4.6b). U skleněných elektrod je možno se setkat s tzv. kyselou a alkalickou chybou. Jedná se o odchylky od Nernstovské odezvy při nízkých hodnotách ph a při vysokých hodnotách ph se uplatňuje tzv. alkalická chyba skleněné elektrody. Alkalická chyba je vysvětlitelná interferencí vysoké koncentrace alkalických kovů (resp. prakticky velmi častou přítomností Na + a K + ) a matematicky popsaná zobecněním Nernstovy rovnice, rovnicí Nicholsky-Eisenmanovou. 124