Diagnostika mastitid

Diagnostika mastitid Jak vyplývá z uznávané kategorizace zdravotního stavu mlé né žlázy (viz následující tabulka), základními prost edky diagnostiky mastitid jsou bakteriologické vyšet ení a stanovení po tu somatických bun k ve tvr ových vzorcích mléka odebraných p ísn asepticky bezprost edn p ed dojením (po oddojení a odstran ní prvních st ik mléka). Kategorizace zdravotního stavu mlé né žlázy Po et somatických bun k Patogen [. 10 3. ml -1 ] nevykultivován vykultivován < 250 (100) zdravá žláza latentní infekce > 250 (100) aseptická mastitida subklinická mastitida Klinická mastitida nespecifická infek ní International Dairy Federation Bulletin 211, 1987, 24 s; DVG,1994 Metody mikrobiologické diagnostiky Metody mikrobiologické diagnostiky mastitid byly doporu eny Mezinárodní mléka skou federací již po átkem 80. let 20. století (IDF, 1981). I když základní principy této diagnostiky z stávají i nadále platné (viz nap. NMC, 1999), stále více se za ínají uplat ovat molekulárn biologické metody, založené na detekci jednotlivých genetických marker bakteriálních p vodc mastitid simultánními postupy (nap. Gillespie a Oliver, 2005). Metody stanovení po tu somatických bun k mléka Metody stanovení po tu somatických bun k mléka zahrnují: P ímé mikroskopické stanovení po tu somatických bun k mléka ( SN EN ISO 1366-1, 1998). Tato metoda se nepoužívá k rutinnímu stanovení po tu bun k, nýbrž jako referen ní metoda. Stanovení po tu somatických bun k mléka na elektronických po íta ích ástic ( SN EN ISO 1366-2, 1998). Tato metoda je na ústupu a je nahrazována elektronickým stanovením s využitím principu fluorescen ní mikroskopie. Stanovení s využitím principu fluorescen ní mikroskopie, a to jak p i nanášení vzorku na rotující disk, tak p i použití princip pr tokové cytometrie. Tyto metody byly rekodifikovány (EN ISO 1366-2, 2006). Fluorescen ního zobrazení somatických bun k využívají i po íta e bun k, pracující na principu.analýzy obrazu. Umož ují stanovení po tu bun k v terénních podmínkách (nap. to jsou NucleoCounter SCC-100; Direct Cell Counter). Uvedené p ístroje a jejich použití nebylo dosud mezinárodn kodifikováno. Direct Cell Counter (DCC) Je p enosný, bateriemi napájený p ístroj. Mlé ný vzorek ur ený k analýze je odebírán do speciální kazety. Zma knutím pístu je do kazety nasát definovaný objem vzorku, p i emž každá kazeta má kalibra ní kód, který p ístroj p i m ení rozlišuje. Mléko je protla eno systémem kanálk a tak promícháno se speciálním reagens, které obarví jádro každé somatické bu ky. Takto zpracovaný vzorek je pak vystaven excita nímu sv tlu. Dochází k emisi fluorescen ních signál, jejichž obraz je zaznamenáván kamerou. Objem 1

vzorku iní p ibližn 60 µl, m í se 1 µl obarveného vzorku. P ístroj detekuje po et bun k na displeji v rozp tí bun k od 10 do 4 000 v 1 µl. P esnost p ístroje odpovídá p esnosti p ístroj Fossomatic (r² = 0,988). Opakovatelnost stanovení vyjád ená koeficientem variability iní 8 % na hladin 400. 10 3 / ml mléka, 12 % na hladin 100. 10 3 / ml mléka. Analýza trvá 45 sekund. Významnou zm nu doznal i názor na limitní hodnotu po tu somatických bun k ve tvr ových vzorcích mléka, která má rozlišit zdravou a zán tem stiženou mlé nou žlázu. Zatímco se d íve uznávala limitní hodnota po tu bun k 250.10 3 / ml (IDF, 1987), v sou asnosti se stále více prosazuje limitní hodnota 100. 10 3 / ml mléka (DVG,1994). Nep ímé metody diagnostiky mastitid Nejrozší en jší nep ímou metodou pro diagnostiku projev zán t se stalo koncem 20. století m ení elektrické vodivosti mléka. Stanovení elektrické vodivosti mléka (VM) se využívalo pro screening subklinických mastitid. Byla navržena ada p ístroj, které umož ovaly m ení ve stáji. Princip m ení vycházel z faktu, že mléko je elektrolyt, nebo obsahuje disociované ionty jejichž obsah v mléce p i zán tlivém procesu vzr stá. To se zejména týká iont Cl - a Na +. Údaje o kritické hodnot pro diagnostiku mastitid se velmi r zní. VM se udává absolutní hodnotou (AV) nebo rozdílem nejvyšší a nejnižší hodnoty ve vzorcích mléka tvrtí téhož vemene (RV). Byly odvozeny diagnostické algoritmy využívající kombinaci obou vyjád ení (MIX). N kte í auto i použili p i konstrukci diagnostického algoritmu i nejvyšších hodnot AV a RV z opakovaných m ení. Tento p ístup ovšem vyžaduje dopln ní prostého stanovení VM programovou podporou technologického procesoru. D je se tak proto, že prosté stanovení VM má velmi nízkou diagnostickou ú innost (pod 60 % shody s referen ními diagnostickými metodami). P íklad diagnostické ú innosti p i použití algoritmu s programovou podporou a p i kritických hodnotách AV 0,57 S. m -1, RV 0,07 S. m -1 pro subklinickou mastitidu a AV 0,66 S. m -1, RV 0,16 S. m -1 pro klinickou mastitidu dokumentuje následující tabulka. Z tabulky je z ejmé, že leze s programovou podporou dosáhnout vysoké diagnostické ú innosti. Nicmén je t eba mít na z eteli, že VM je ovliv ována adou interferujících initel, zejména plemennou p íslušností zví at a sezónními vlivy (Ryšánek et al., 1984). Je rovn ž vhodné zmínit fakt, že MV indikuje zm ny v iontovém složení mléka d íve, než jsou patrné smyslové zm ny mléka a dokonce d íve, než je zaznamenán nár st po tu somatických bun k v mléce. Diagnostická ú innost m ení elektrické vodivosti mléka s programovou podporou (aritmetický pr m r 2 maximálních hodnot v 7 denním cyklu) Status AV RV MIX F - Shoda F + F - Shoda F + F - Shoda F + Mastitida 12,2 86,8 1,0 0,9 94,4 4,7 0,0 95,3 4,7 (F - falešn negativní nález F + falešn pozitivní nález) Ryšánek, D.: Vet.Med. Praha, 35,1990,145-153. 2

Diagnostické p ístroje pracující s programovou podporou jsou nákladná za ízení. Proto se tento sofistikovaný p ístup uplat uje v sou asné dob pouze v systémech automatického sb ru dat v procesu dojení a v návazných systémech procesního ízení chovatelských inností. V takových systémech je m ení VM obvykle kombinováno se snímáním spot eby jadrného krmiva, s automatickým m ením hmotnosti výdojku a s m ením pohybové aktivity dojnic krokom ry. Vzniká tak komplexní diagnostický signál umož ující automatický screening nemocných dojnic. Posoudit diagnostický význam VM a n kterých dalších zm n látkového složení mléka umož ují následující tabulky. T snost vztahu po tu somatických bun k mléka a vybraných znak látkového složení mléka ( tvr ové vzorky p ed dojením) Nezávisle prom nná Závisle prom nná Vícenásobní regrese Ukazatel n Pr m r Ukazatel n Pr m r r S Determinace [%] Chloridy 196 37,09 0,659 +++ 43,55 Po et somatických bun k [10 3 /ml] 196 2244,0 [mmol/l] Laktóza [mmol/l] Chlorcukrové íslo Titra ní Kyselost [ SH] Elektrická vodivost [S/m] 196 137,3-0,654 +++ 42,84 196 3,1 0,705 +++ 49,76 196 6,96-0,484 +++ 23,44 196 0,543 0,647 +++ 41,84 Nezávisle prom nná Závisle prom nná Vícenásobní regrese Ukazatel n Pr m r Ukazatel n Pr m r r S Determinace [%] Laktóza [mmol/l] 196 137,3-0,854 +++ 72,93 Chlorcukrové 196 3,1 0,970 +++ 94,50 Chloridy [mmol/l] 196 37,09 íslo Titra ní Kyselost [ SH] 196 6,96-0,739 +++ 54,61 Elektrická 196 0,543 0,931 +++ 86,70 vodivost [S/m] r regresní koeficient; r (0,001) = 3,39 ; S Významnost; +++ P < 0,001 Ryšánek, D., Olejník, P. 1980: Vet. Med Czech., 25 (8): 467-474 Czech 3

Z tabulek je z ejmé, že elektrická vodivost mléka koreluje t sn ji s obsahem chloridových iont v mléce než s po tem somatických bun k. Obdobn se chová i laktóza v mléce. Nicmén lze konstatovat, že všechny testované znaky tím, že statisticky významn korelují s po tem somatických bun k, mohou být použity jako nep ímé ukazatele poruchy sekre ní funkce mlé né žlázy, která provází zán tlivý proces. V ad experimentálních prací byly tyto znaky takto použity. K b žné diagnostice se však nepoužívají. Obdobn je tomu i u dalších zm n látkového složení mléka, jek je charakterizují následující graf a tabulky. Tolle, A., Heeschen, W., Reichmuth, J., Zeidler, H.: Dairy Sci. Abstract 33 (1971) 875-879 Chemické zm ny mléka v d sledku mastitid :Složka Normální hladina Koeficient zm ny laktóza [g. l -1 ] 4,85 0,93 S1 -kasein [mg. ml -1 ] 13,3 0,50 -laktalbumin [mg. ml -1 ] 1,03-1,22 0,50 ß-laktoglobulin [mg. ml -1 ] 4,0 0,74 imunoglobuliny [mg. ml-1] 0,25-0,30 10,0 serumalbumin [mg. ml-1] 0,24 2,7 Hamann, J., Krömker, V., : Livest. Prod. Sci., 48, 1997, 201-208 4

Fyzikáln chemické zm ny mléka v d sledku mastitid Složka Normální hladina Koeficient zm ny celkový Ca 2+ [µmol. l -1 ] 22,94 0,43 celkový Mg 2+ [µmol. l -1 ] 8,32 0,31 celkový P [µmol. l -1 ] 17,2 0,75 citrát [mmol. l -1 ] 11,2 0,72 K + [mmol. l -1 ] 44,1 0,85 Cl - [mmol. l -1 ] 22,6-39,05 1,2-2,0 Na + [mmol. l -1 ] 24,9 2,0 chlorcukrové íslo 2,05-3,2 2,8 titra ní kyselost [ SH] 6,2-8,0 0,8-0,6 ph 6,65 1,15 elektrická vodivost [S. m -1 ] 0,480 1,1-2,2 bod mrznutí [- C] 0,57-0,53 <1,0 Hamann, J., Krömker, V., : Livest. Prod. Sci., 48, 1997, 201-208 Z dalších zm n látkového složení mléka mají diagnostický význam tyto: Stanovení bovinního serumalbuminu (BSA). Vychází z faktu, že p i zán tlivém procesu mlé né žlázy se zvyšuje pr chodnost hemato-alveolární bariéry a z krve do mléka pronikají i vysokomolekulární látky, krom jiných i sérumalbumin. Principem stanovení v komer ních testech byla prostá radiální difúze v agarovém gelu obsahujícím monospecifické protilátky proti BSA. Vyhodnocení se provád lo stanovením pr m ru precipita ní zóny. Test vznikl na p elomu sedmdesátých a osmdesátých let minulého století. V sou asnosti se již diagnosticky tém nepoužívá. Antitrypsinový test. Neutrofilní granulocyty migrující b hem zán tu do mlé né žlázy uvol ují proteolytické enzymy, které jsou histotoxické a poškozují tkán mlé né žlázy. Mastitidní sekret však obsahuje i inhibitory proteináz. Aktivita t chto inhibitor je v pozitivní korelaci s po tem somatických bun k, jakož i s obsahem sérum albuminu v mléce. P esto, že tyto inhibitory vykazují elektroforetickou hetergenitu, jsou považovány za analog lidského 1 anti-trypsinu. Vzorky mléka se istí koprecipitátem a centrifugací, aby se odstranily interferující komponenty. Supernatanty se p enesou do jamek mikrotitra ních desti ek. P idá se trypsin a substrát. Reak ní sm s se inkubuje a pak spektrofotometricky m í absorbance chromogenu uvoln ného trypsinem. Systém readeru a PC umož uje provést s programovou podporou korekci turbidity a interpolaci hodnot podle nulových a 100% kontrolních vzork a stanovení antitrypsinové aktivity vyšet ovaných vzork mléka. Tento test, vyvinutý v osmdesátých letech minulého století, poskytuje vysokou produktivitu stanovení. Je však proti p ímému stanovení po tu somatických bun k mnohanásobn dražší. Proto nedoznal širšího uplatn ní krom experimentálních prací. NAGASE test. Zán tlivé sekrety mlé né žlázy obsahují enzym N-acetyl-ß-Dglukozaminidázu, pocházející z rozpadlých neutrofilních granulocyt, z v tší ásti však z poškozených epiteliálních bun k. Princip metody stanovení spo ívá v tom, že se vzorky mléka smíchají se substrátem a v kyselém prost edí inkubují. Dojde k hydrolýze, kterou se ze substrátu uvolní št p, jenž se stane silnou alkalizací sm si vysoce fluorescentní. Reakce probíhá v titra ních mikroplotnách. Výsledná fluorescence se m í fluorometrem. P ístroj má 5

vysokou opera ní kapacitu. Princip reakce byl navržen již za átkem šedesátých let minulého století. Popsanou podobu však test získal v osmdesátých letech. V devadesátých letech byl použit v ad výzkumných prací. V sériové diagnostice nedoznal v tšího uplatn ní, krom zem svého p vodu - Finska a dalších skandinávských zemí. C-reaktivní protein pat í stejn tak jako haptoglobulin (Hp) a sérum amyloid A (SAA) k protein m akutní fáze zán tu. Bylo prokázáno, že p i mastitid skotu se zvyšuje zejména koncentrace Hp a na mlé nou žlázu vázaného SAA (M-SAA3). M ením exprese gen na mrna bylo zjišt no, že oba proteiny jsou produkovány i ve tkáni mlé né žlázy, M-SAA3 více než Hb. V játrech jsou produkovány v opa ném po adí významnosti. Protein m akutní fáze se v mlé né žláze skotu v nuje výzkumná pozornost. K diagnostice mastitid se však zatím jejich stanovení v mléce ani exprese gen kódujících jejich produkci b žn nepoužívají. Vý et metod použitých v experimentálních pracích by mohl a v budoucnu jist bude pokra ovat. Nicmén jejich širší uplatn ní v rutinní diagnostice mastitid nelze o ekávat. Mikrobiologické vyšet ení a stanovení po tu somatických bun k mléka budou jist i nadále esenciálními metodami v diagnostice mastitid. 6

Vybraná literatura CSN EN ISO13366-3: 1998 Mléko Stanovení po tu somatických bun k. ást 1. Mikroskopická metoda. CSN EN ISO13366-2: 1998 Mléko Stanovení po tu somatických bun k. ást 2. Metoda elektronického po ítání ástic. CSN EN ISO13366-3: 1998 Mléko Stanovení po tu somatických bun k. ást 3. Fluoroopto-elektronická metoda. EN ISO13366-2: 2006. Milk Enumeration of somatic cells Part 2: Guidance on the operation of fluoro-opto-electronic counters. Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft (DVG): Leitlinien zur Bekämpfung der Mastitis des Rindes als Bestandsproblem. 3. Aufl., Gießen, 1994. Gillespie B.E, Oliver S.P. 2005: Simultaneous detection of mastitis pathogens, Staphylococcus aureus, Streptococcus uberis, and Streptococcus agalactiae by multiplex realtime polymerase chain reaction. J Dairy Sci. 88(10):3510-3518. Hamann, J., Krömker, V.1997: Potential of specific milk composition variables for cow health management, Livest. Prod. Sci., 48: 201-208 IDF 1981: Laboratory methods for use in mastitis work. International Dairy Federation Bulletin, Document 132. 27 pp. IDF 1987: Bovine mastitis. Definition and guidelines for diagnosis. Bulletin of International Dairy Federation No 211. 1987. 24 pp. NMC 1999: National Mastitis Council. Laboratory Handbook on Bovine Mastitis. National Mastitis Council. Walton Commons West, Madison, USA. 222 pp. Rysanek, D., Olejnik, P.: Diagnostic effectiveness of the measurement of electric conductivity in milk. Vet. Med. Czech., 25 (8), 1980, 467-474 Czech Ryšánek, D., Olejník, P., Sokol, J., Opletal, A., Picka, F., Majbová, J., Krej í, J. 1984:Analysis of factors underlying the electric conductance of cow s milk Breed, locality, year season. Vet. Med. Czech., 29 (2): 89-94. Czech Rysanek, D. 1990: Algorithms of evaluation of milk electric-conductivity for mastitis screening. Vet. Med. Czech., 35 (3):145-153 Tolle, A., Heeschen, W., Reichmuth, J., Zeidler, H.: Dairy Sci. Abstract 33 (1971) 875-879 Poslední aktualizace: erven 2007 Copyright (c) Dušan Ryšánek. All rights reserved. 7